عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

مطلوب عزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية للروتين تجارب البيولوجيا الجزيئية مثل شمال النشاف ^9، QRT-PCR ¹ أو التعبير الجيني التنميط ^5. وتستند معظم الطرق المعاصرة لعزل الحمض النووي الريبي على إدخال تعديلات على البروتوكولات ثيوسيانات الجوانيدين ^{2، 3.} الجوانيدين ثيوسيانات هو ممسخ بروتين قوي وفعال وتعطيل نشاط ريبونوكلياز في معظم الظروف. طريقة شعبية من Chomczynski وساكي ³ مجتمعة الفينول في حل الجوانيدين ثيوسيانات تحلل، مما يقلل من الوقت العزلة إلى حوالي 4 ساعة. وتقوم العديد من الكواشف المتاحة تجاريا استخراج الحمض النووي الريبي على Chomczynski وطريقة ساكي ^3.

الأنسجة الغنية ريبونوكلياز مثل الإنسان أو الماوس البنكرياس يمثل تحديا إضافيا لعزل الحمض النووي الريبي. قد تحتوي الماوس البنكرياس تصل إلى 75 ملغ من ريبونوكلياز ⁶ سيصدر بعضها الزيتوز تعطيل الأنسجة البنكرياس مما يؤدي إلى انحلال ذاتي الأنسجة. وقد استخدمت التعديلات على البروتوكولات الجوانيدين ثيوسيانات بنجاح لعزل الحمض النووي الريبي من البنكرياس مع سلامة عالية ^{2، 4، 7، 10.} التسريب من الحمض النووي الريبي لتحقيق الاستقرار في الماوس كاشف البنكرياس العزلة سهلت من الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية ^{4، 7، 10،} ولكن ضخ الحلول في البنكرياس يتطلب مهارة كبيرة، قد تتطلب أدوات متخصصة مثل مجهر تشريح وتعطيل العمارة الأنسجة أثناء إجراء قد يؤدي إلى تحلل الخلايا. Perfusing الأنسجة مع تثبيت الحمض النووي الريبي كاشف قد تتداخل مع غيرها من التطبيقات بما في ذلك عزل البروتين وتلطيخ النسيجية. علاوة على ذلك، هذه التقنية ليست مناسبة لعزل الحمض النووي الريبي من البنكرياس الإنسان. بروتوكولات أخرى تتطلب إعداد حلول محددة من قبل المحقق ^2.

نفيدكم بروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية من الماوس البنكرياس. اليستخدم بروتوكول البريد عناصر الأساليب المنشورة سابقا، ويستند إلى حد كبير على الفينول / جوانيداين تحلل بروتوكولات كاشف القائم على ثيوسيانات القياسية. أنها لا تتطلب إعداد الحلول المتخصصة كما أنها لا تتطلب ضخ الكواشف في البنكرياس. وتشمل الخطوات الحاسمة لنجاح عزل الحمض النووي الريبي عالية الفينول / القائم جوانيداين تحلل كاشف إلى نسبة الأنسجة، وإزالة الأنسجة غير مهضوم قبل مرحلة الانفصال وإدراج المانع ريبونوكلياز إلى حل RNA الناتجة عن ذلك. باستخدام هذه التعديلات وغيرها، ونحن عادة عزل الحمض النووي الريبي مع رين أكبر من 7 لاستخدامها في تحليل التعبير الجيني الروتينية.

1. إعداد

الممارسات التالية الالتزام بالسياسات التي وضعتها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسة ل(IACUC).

1. فمن المستحسن لعزل ما لا يزيد عن 6 البنكرياس الماوس في أي يوم من الأيام. لديك كل الأدوات الجراحية نظيفة وتعقيمها، مجموعة واحدة لكل حيوان.
2. تسمية كل أنابيب microcentrifuge. أربعة أنابيب 2 مل لكل حيوان.
3. وضع 8 مل من تحلل كاشف في 50 مل أنابيب الطرد المركزي على الجليد. ملاحظة: على الرغم من أن عدة تنقية يأتي مع ثيوسيانات الجوانيدين الفينول كاشف التي هي مناسبة لعزل البنكرياس، ويستخدم كاشف تحلل بسبب كميات كبيرة والتي هي ضرورية في العزلة.
4. الاستغناء عن 10 مل من الحلول التالية في 15 مل أنابيب الطرد المركزي لتنظيف ريش الخالط لل. الإيثانول، 70٪ (2 أنابيب)، HPLC المياه الصف (1 أنبوب) وهبلك الصف المياه التي تحتوي على ما يقرب من 200 ميكرولتر من ريبونوكلياز بعيدا أو ما يعادلها ريبونوكلياز inactivator.
2. جراحة، تشريح البنكرياس والتجانس
1. وضع 1-2 مل من isoflurane وإلى جرة تحتوي على شاش القطن أو المناشف الورقية. يتم وضع الفئران على منصة يمنعهم من الوصول إلى مصدر isoflurane و. إضافة جديدة لisoflurane والجرة قبل التخدير لكل الماوس.
2. وضع الماوس بلطف في جرة تحتوي على isoflurane و. سقف الجرة ورصد آثار التخدير عن طريق تناوب بلطف الجرة ذهابا وإيابا. يتم تخدير الحيوان مرة واحدة هو في غير قادر على الوقوف في 'الخاصة.
3. للحصول على تأكيد من التخدير، وإزالة الحيوان من الجرة وتطبيق قرصة أخمص القدمين الشركة. إذا لا تتفاعل الماوس إلى قرصة أخمص القدمين، انتقل إلى الخطوة 2.5.
4. إذا يتفاعل الماوس إلى قرصة أخمص القدمين، ثم كرر الخطوات من 2،2-2،3.
5. وضع الحيوان تخدير على أعلى مقاعد البدلاء في وضعية الانبطاح. خلخل عنق الرحم الماوس، عن طريق وضع بإحكام اليد اليسرى على عنق الرحم الفأر. لناجي اليد اليمنى فهم ذيل الماوس، وبسرعة سحب صعودا في حوالي بزاوية 45 درجة الى خلخل عنق الرحم.
6. تأمين الذبيحة على سطح (قطعة من الستايروفوم مستوى مغطاة المناشف الورقية) من خلال ثقب كل أربعة الكفوف الحيوان في سطح مستو باستخدام قياس 25 إبر الحقن.
7. استخدام الأدوات الجراحية المعقمة، وقطع القسم الوسطي من الفأرة مفتوحة وبسرعة إزالة البنكرياس من الماوس. استخدام ملقط لعقد البنكرياس وقطع عليه من الطحال والأمعاء الدقيقة باستخدام مقص الربيع. يجب الحرص على عدم تمتد البنكرياس خلال إزالة من الماوس. تعطيل الأنسجة قد يفرج عن ريبونوكلياز. ملاحظة: إن الوقت الذي يستغرقه لإزالة البنكرياس من الماوس أمر بالغ الأهمية. وينبغي أن يكون الشخص قادرا على المهرة تشريح البنكرياس في حوالي 1 دقيقة أو أقل.
8. وضع البنكرياس بأكمله في أنبوب 50 مل تحتوي على 8 مل من الجليد الباردة كاشف تحلل. غطاء الأنبوب لفترة وجيزة يهز لتزج منظمة الشفافية الدوليةssue في كاشف والمضي قدما إلى الخطوة التالية دون تأخير. نسبة تحلل الأنسجة كاشف لأمر بالغ الأهمية. راجع قسم نتائج مقارنة لسلامة الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام كميات مختلفة من تحلل كاشف.
9. التجانس لمدة 5 ثوانى. فمن المهم للضغط على شفرات الخالط إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي للسماح للأنسجة ليتم سحبها في شفرات لتجانس كفاءة.

3. إزالة الأنسجة غير المهضومة

ملاحظة: بعد التجانس، وقطع صغيرة من الأنسجة البقاء في كاشف تحلل. هو أكثر أهمية لليز بسرعة الأنسجة ترك بعض الأنسجة عسر الهضم بدلا من أكثر من المجانسة وتدهور خطر الحمض النووي الريبي.

1. نقل 2 مل من كاشف تحلل تحتوي على البنكرياس هي lysed إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل. جمع اثنين من أنابيب microcentrifuge جناسة في العزلة. تجاهل جناسة المتبقية أو تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة الدراسات المستقبلية.
2. سنتrifuge في 4 درجات مئوية، 12،000 × ز لمدة 5 دقائق لبيليه الأنسجة عسر الهضم. هذا هو خطوة حاسمة كما المرحل من الأنسجة غير مهضوم إلى حلول لاحقة من الحمض النووي الريبي من المرجح أن تلوث العينة مع ريبونوكلياز (الخطوة 5.13).
3. نقل 1 مل من طاف في أنبوب microcentrifuge 2 مل. المضي قدما في عزلة فورا وتخزين أنبوب تكرار في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. وضع جميع الأنابيب التي تحتوي على جناسة على الجليد الرطب في حين الشروع في الخطوة التالية.
4. التخلص من المتبقي تحلل كاشف إلى وعاء النفايات الكيميائية المناسبة.

4 تنظيف من ريش الخالط

1. قبل الانتقال إلى العزلة المقبل، وتنظيف ريش الخالط عن طريق وضعها في 10 مل من الايثانول 70٪. تفعيل الخالط لمدة 20 ثانية لإزالة أي قطع من الأنسجة التي يمكن اصطيادها في ريش.
2. استخدام غيض 200 ميكرولتر الماصة لإزالة أي القطع التي تبقى في ريش الخالط. كرر الخطوة 4.1 في الماء، العام ريبونوكلياز inactivator والايثانول 70٪. تجفيف رمح الخالط مع كيم يمسح نظيفة.
3. كرر الخطوة 2.1 لعزل البنكرياس من الحيوانات المتبقية، وحفظ الحمض النووي الريبي معزولة عن كل حيوان منفصلة بدلا من تجميع الحمض النووي الريبي.

5. عزل الحمض النووي الريبي

المقطع التالي هو مطابق لبروتوكول طقم تنقية. الاستفادة من عدة تنقية هو أنه سوف عزل الحمض النووي الريبي مجموع بما في ذلك الرنا الصغيرة.

1. إذا باستخدام الحل جناسة المجمدة، وذوبان الجليد على الجليد الرطب واسمحوا الوقوف على RT لمدة 5 دقائق.
2. إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم، وكأب أنبوب ويهز بقوة باليد لمدة 15 ثانية. السماح للأنبوب الوقوف على RT لمدة 2-3 دقيقة.
3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12،000 x ج، 4 درجات مئوية.
4. نقل الطبقة المائية العليا في أنبوب microcentrifuge. إضافة 1.5 حجم الأيزوبروبانول ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
5. نقل ما يصل الى 700 ميكرولتر من العينة في عمود الدوران التي يتم وضعها في أنبوب جمع 2 مل. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 15 ثانية في RT.
6. تجاهل التدفق من خلال.
7. كرر الخطوات من 5،5-5،6، وذلك باستخدام ما تبقى من العينة.
8. إضافة 700 ميكرولتر العازلة RWT إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 8،000 ز س. تجاهل التدفق من خلال.
9. الماصة 500 ميكرولتر العازلة RPE في العمود تدور. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 8000 x ج لغسل العمود. تجاهل التدفق من خلال.
10. إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 8،000 x ج لتجف العمود.
11. نقل عمود الدوران إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. الماصة 80 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه مباشرة على غشاء عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8،000 x ج لأزل الحمض النووي الريبي.
12. إضافة 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع في حل الحمض النووي الريبي. تخزين في -80 درجة مئوية أو الشروع في 5.13.
13. للتحقق من صحة سلامة الحمض النووي الريبي، وحساب لأول مرة بغية دراسته واقراره الحمض النووي الريبيntration و260/280 نسبة استخدام الطيف.
14. تمييع جزء من الحل RNA إلى ما يقرب من 500 نانوغرام / ميكرولتر مع البيولوجيا الجزيئية المياه الصف.
15. تحديد النزاهة الحمض النووي الريبي (أي رين) باستخدام التحليل الكهربائي الشعري. حوالي 5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الريبي كافية للتحليل.
16. قسامة الحل الحمض النووي الريبي (انظر الشكل 2) وتخزينها في -80 درجة مئوية.

مجموع العائد الحمض النووي الريبي من 1 مل من تحلل جناسة هو 20-40 ميكروغرام. OD 260/280 نسب هي عادة حوالي 2.0 ورين أكبر باستمرار من 7.0. إذا كان رين و≤ 6، سيتعين على العزلة أن تتكرر. في بعض الأحيان، وحقق رين الذي هو أعلى من 8.0.

طريقتين الأكثر استخداما القتل الرحيم الفئران قبل إزالة البنكرياس هي CO 2 الاختناق أو استنشاق isoflurane و. ويتبع كل من التقنيات من قبل خلع عنق الرحم. نظرا لأنه من الممكن أن يكون وكيل و / أو إجراء الكيميائية الوقت قد تؤثر على سلامة الحمض النووي الريبي، ورين من الماوس الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام البنكرياس ومقارنة كل من التقنيات. تم تخدير الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 الاختناق أو استنشاق isoflurane و؛ وأعقب كل التقنيات من قبل خلع عنق الرحم. كان وقت التخدير الحيوانات قبل خلع عنق الرحم حوالي 1-2 دقائق أطول لCO 2 الخنق مقارنة isoflurane. الحمض النووي الريبي معزولة التالية استنشاق isoflurane وأنتجت رين 7.5 ± 0.31 مقارنة رين من 2.2 ± 0.3 (ع <10 -4، يعني ± SD، ثلاث نسخ العزلة) لCO 2 الاختناق. طريقة القتل الرحيم لديها تأثير كبير على سلامة الحمض النووي الريبي ويفضل أسلوب استنشاق isoflurane وإلى CO 2 الاختناق.

وتمت مقارنة على سلامة الحمض النووي الريبي معزولة عن بنكرياس الفأر التي تم المتجانس في 2 و 4 و 8 مل من تحلل كاشف. افترضنا أن زيادة حجم تحلل كاشف سيؤدي إلى درجة أكبر من ريبونوكلياز التعطيل. بخلاف حجم تحلل الكاشف، كانت كل ظروف مماثلة لتلك الواردة في البروتوكول. كان هناك علاقة مباشرة بين حجم كاشف تحلل المستخدمة في تجانس ووحدة الحمض النووي الريبي (الشكل 1). ورين من الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام 2 و 4 و 8 مل من تحلل كاشف كان 4.2، 6.5 و 7.4 على التوالي (يعني ثلاث نسخ هيolations). لذا 8 مل من تحلل كاشف ينبغي أن تستخدم في هذا البروتوكول.

بالنسبة لبعض التجارب، فإنه قد يكون من الضروري جمع كل من الحمض النووي الريبي والبروتينات من نفس البنكرياس. على سبيل المثال، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي لQRT-PCR ويمكن تصور البروتين باستخدام المناعية. إذا كان هذا هو الحال، فمن المستحسن لخفض البنكرياس في النصف من الرأس إلى الذيل. هذا أمر مهم لأن البنكرياس يختلف تشريحيا من الرأس إلى الذيل. لإثبات إن وجدت اختلافات في الحمض النووي الريبي سلامة القائم بين الحمض النووي الريبي معزولة عن إما نصف البنكرياس، تم إجراء التجربة التالية. تم عزل الحمض النووي الريبي من النصف الأول من البنكرياس. تحديد رين من هذا الحمض النووي الريبي ومقارنة بما كان عليه من الحمض النووي الريبي معزولة عن النصف الثاني من البنكرياس بعد أن جلس على RT لمدة 30 ثانية خلال workup من الشوط الأول. كان رين في النصف الأولي من البنكرياس 7.4 ± 0.20 مقارنة رين من 6.9 ± 0.55 للنصف اللاحقة. في حين خفض البنكرياس فيلا يبدو بهذه الطريقة لاطلاق سراح ريبونوكلياز وهضم الحمض النووي الريبي، إذا البنكرياس هو أن تكون مقطوع، فمن المستحسن استخدام النصف الأول لتحليل الحمض النووي الريبي والنصف الثاني للبروتين.

تحلل كاشف يعطل بنية البروتين وبالتالي يقلل من نشاط ريبونوكلياز. ويرجع ذلك إلى كمية كبيرة من ريبونوكلياز التي موجود في البنكرياس، فمن الممكن أن بعض ريبونوكلياز نشطة يبقى في جناسة تحلل وسوف تتوازن هذه ريبونوكلياز إلى المرحلة المائية. فإن أي ريبونوكلياز أن يبقى في حل RNA مشاركة تعيق النزاهة. للتغلب على هذا، واضاف نحن المانع ريبونوكلياز إلى محلول مائي من الحمض النووي الريبي. ومقارنة سلامة الحمض النووي الريبي من حل RNA التي تحتوي على ريبونوكلياز المانع لأحد أن لم يفعل ذلك. على واحدة ذوبان التجميد، كان رين من أجل حل RNA مع مثبط 7.3 ± 0.15 مقارنة مع 2.9 ± 0.65 (الشكل 2، ص <0.001، يعني ± SD، ثلاث نسخ العزلة) لالحل الذي لم يتضمن المانع. مسألة أخرى هي احتمال أن تتكرر سوف تجميد ذوبان تفسد ريبونوكلياز المانع جعلها غير فعالة. لدراسة هذا الاحتمال، وهو حل من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على ريبونوكلياز المانع جمد مرارا وإذابة. الحلول الحمض النووي الريبي التي تم تجميدها وإذابة تصل إلى 5 مرات تزال تنتج ورين من 7 أو أعلى بينما أنتجت تلك الحلول التي تم تجميدها وإذابة 6 مرات أو أعلى رين أقل من 7 (الشكل 2). فمن المستحسن أن قسامة الحل الحمض النووي الريبي قبل التجميد والحد من عدد دورات ذوبان التجميد.

للتدليل على فائدة هذه الطريقة، أجرينا QRT-PCR على الحمض النووي الريبي معزولة. كان متوسط ​​رين من العزلة RNA ثلاث نسخ 7.4 ± 0.20 (يعني ± SD). تم تصنيعه [كدنا] معبي عشوائية من الحمض النووي الريبي وتم قياس التعبير عن ثلاثة جينات التدبير المنزلي عن طريق QPCR باستخدام تقنيات القياسية. البيانات هو مبين في الشكل (3) بالتحقق من صحةقدرتنا على استخدام الماوس بنجاح RNA البنكرياس في تقنية البيولوجيا الجزيئية القياسية.

الشكل 1. عالية تحلل كاشف إلى نسبة الأنسجة ويحسن سلامة الحمض النووي الريبي. وسلامة الحمض النووي الريبي معزولة عن بنكرياس الفأر الذي كان المتجانس في 2 (A، D)، 4 (B، E) أو 8 (C، F) مل من تحلل كاشف كان مقارنة. بخلاف حجم تحلل الكاشف، كانت كل ظروف مماثلة لتلك التي في موضح في البروتوكول في هذه الوثيقة. وهناك علاقة مباشرة بين حجم تحلل كاشف المستخدمة في التجانس والحمض النووي الريبي النزاهة. (G) متوسط ​​± SD، العزلة ثلاث نسخ. ع <0.05، ** ع <0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبرمن هذا الرقم.

الشكل 2. يتحلل الحمض النووي الريبي في نهاية المطاف على تكرار ذوبان التجميد. الحمض النووي الريبي معزولة عن الماوس البنكرياس جمد مرارا وإذابة في وجود أو عدم وجود المانع ريبونوكلياز (ريبونوكلياز الأول). يعني ± SEM، ** ع <0.001.

الرقم 3. QRT-PCR RNA من الماوس البنكرياس. تم عزل الحمض النووي الريبي من ثلاثة البنكرياس الماوس باستخدام بروتوكول الأمثل. تم تحديد التعبير عن 18S الرنا الريباسي، β-2 المكروغلوبولين وsnoRNA251 باستخدام QRT-PCR (متوسط ​​± SD).

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.