أبلغنا عن إجراء لعزل الحمض النووي الريبي ذو السلامة العالية من بنكرياس الفأر الغني بالريبونوكلياز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمثل عزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة عن الأنسجة الغنية بالريبونوكلياز مثل بنكرياس الفأر تحديا. نظرا لأن الوظيفة الأساسية للبنكرياس هي المساعدة في الهضم ، فقد يحتوي البنكرياس الفأر على 75 مجم من الريبونوكلياز. أبلغنا عن تعديلات على بروتوكولات كاشف تحلل الفينول / الجوانيدين ثيوسيانات القياسية لعزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر. ثيوسيانات جوانيدين هو ممسخ قوي للبروتين وسيعطل بشكل فعال نشاط الريبونوكلياز في معظم الظروف. ومع ذلك ، فإن التعديلات الهامة على البروتوكولات القياسية ضرورية لعزل الحمض النووي الريبي بنجاح عن الأنسجة الغنية بالريبونوكلياز. تشمل الخطوات الرئيسية نسبة كاشف التحلل إلى الأنسجة العالية ، وإزالة الأنسجة غير المهضومة قبل فصل الطور وإدراج مثبط الريبونوكلياز في محلول الحمض النووي الريبي. باستخدام هذه التعديلات وغيرها ، نقوم بشكل روتيني بعزل الحمض النووي الريبي برقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) أكبر من 7. الحمض النووي الريبي المعزول ذو جودة مناسبة لتحليل التعبير الجيني الروتيني. يجب أن يكون تكييف هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة الغنية بالريبونوكلياز إلى جانب البنكرياس قابلا للتحقيق بسهولة.
المقدمة
مطلوب عزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية للروتين تجارب البيولوجيا الجزيئية مثل شمال النشاف 9، QRT-PCR 1 أو التعبير الجيني التنميط 5. وتستند معظم الطرق المعاصرة لعزل الحمض النووي الريبي على إدخال تعديلات على البروتوكولات ثيوسيانات الجوانيدين 2، 3. الجوانيدين ثيوسيانات هو ممسخ بروتين قوي وفعال وتعطيل نشاط ريبونوكلياز في معظم الظروف. طريقة شعبية من Chomczynski وساكي 3 مجتمعة الفينول في حل الجوانيدين ثيوسيانات تحلل، مما يقلل من الوقت العزلة إلى حوالي 4 ساعة. وتقوم العديد من الكواشف المتاحة تجاريا استخراج الحمض النووي الريبي على Chomczynski وطريقة ساكي 3.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد
الممارسات التالية الالتزام بالسياسات التي وضعتها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسة ل(IACUC).
- فمن المستحسن لعزل ما لا يزيد عن 6 البنكرياس الماوس في أي يوم من الأيام. لديك كل الأدوات الجراحية نظيفة وتعقيمها، مجموعة واحدة لكل حيوان.
- تسمية كل أنابيب microcentrifuge. أربعة أنابيب 2 مل لكل حيوان.
- وضع 8 مل من تحلل كاشف في 50 مل أنابيب الطرد المركزي على الجليد. ملاحظة: ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مجموع العائد الحمض النووي الريبي من 1 مل من تحلل جناسة هو 20-40 ميكروغرام. OD 260/280 نسب هي عادة حوالي 2.0 ورين أكبر باستمرار من 7.0. إذا كان رين و≤ 6، سيتعين على العزلة أن تتكرر. في بعض الأحيان، وحقق رين الذي هو أعلى من 8.0.
طريقتين الأكثر استخداما القتل الرحيم الفئران قبل إزالة البنكرياس هي CO 2 الاختناق أو استنشاق isoflurane و. ويتبع كل من التقنيات من قبل خلع عنق الرحم. نظرا لأنه من الممكن أن يكون .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة التي يتم ريبونوكلياز الغنية يمثل تحديا كبيرا للتجارب البيولوجيا الجزيئية. والمتاحة تجاريا التي تستند الكواشف المختلفة ومجموعات في المقام الأول على طريقة الفينول الجوانيدين ثيوسيانات من استخراج الحمض النووي الريبي. الجوانيدين ثيوسيانات يبدل طبيعة البروتين وبالتالي يقلل من نشاط ريبونوكلياز. ومع ذلك، فإن ضخامة ريبونوكلياز في البنكرياس يتطلب تعديلات إضافية على البروتوكولات القياسية للعزل الحمض النووي الريبي. وتفيد التقارير بروتوكول هنا أن يتم على أسا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر جيان هوا لينغ، ريموند ماكدونالد، جالفين سويفت، ميشيل غريفين، بول Grippo وساتيانارايانا Rachagani الخاصة بهم مفيدة تعليقات واقتراحات وتبادل بروتوكولاتها. وأيد هذا العمل من قبل U01CA111294 منحة وجائزة تنمية فكرة من برنامج بحوث جماعية جامعة ولاية أوهايو.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| باور جين 500 | فيشر ساينتفيك | 14-261-03 | الخالط |
| 5424R | Eppendorf | المبردة الطرد المركزي | |
| كاشف Trizol | Invitrogen | 15596018 | كاشف التحلل |
| الطالب Vannas الربيع مقص | فيشر | 91500-09 | يستخدم لقطع البنكرياس من الأنسجة المرفقة |
| مقص جراحي ، 6 بوصات | فيشر | 08-951-20 | استخدم لقطع ملقط نهاية الفأر |
| الحاد فيشر | 1381239 | استخدم لعقد البنكرياس أثناء تشريح | |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µ ل) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | عام معطل Rnase معطل |
| HPLC درجة المياه | فيشر | W5-4 | لغسل شفرات الخالط |
| المياه بدرجة البيولوجيا الجزيئية | Hyclone | SH30538.03 | شطف الحمض النووي الريبي |
| miRNeasy مجموعة صغيرة | Qiagen | 217004 | Purification |
| Kit2 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، معتمدة من Rnase Dnase الحرة | من الولايات المتحدة الأمريكية Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي | Falcon | 352099 | |
| 70٪ إيثانول | فيشر | ||
| 100٪ إيثانول | فيشر | ||
| 200 & مايكرو ؛ ل نصائح الماصة | Rainin | GPL200F | لتنظيف شفرات الخالط |
| الكلوروفورم | فيشر | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | الطيف الضوئي |
| المحلل الحيوي | محلل الرحلان الكهربائي الشعري الرشيق لقياس سلامة الحمض النووي | ||
| RNeasy أعمدة الدوران | أعمدة Qiagen | Spin كجزء من مجموعة miRNeasy Mini | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL / 6 | تراوح أعمارهم من 4 إلى 12 شهرا. |
| الفئران | جاكسون لاب | 129 | تراوحت أعمارهم من 4 إلى 12 شهرا. |
المراجع
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
