Method Article

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

DOI:

10.3791/51794

⸱

October 1st, 2014

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في بروتوكول الفيديو هذا ، نتتبع - بسرعة عالية وبثلاثة أبعاد - الجسيمات الحالة المصنفة بالفلورسنت داخل الخلايا الحية ، باستخدام طريقة التتبع المداري في مجهر ثنائي الفوتون المعدل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا البروتوكول هو الفيديو لمناقشة كيفية تنفيذ وتحليل الفلورسنت المدارية التجربة تتبع الجسيمات ثلاثية الأبعاد باستخدام تعديل ثنائي الفوتون المجهر 1. على العكس من الأساليب التقليدية (مسح النقطية أو حقل واسع بناء على كومة من الإطارات)، تتبع المداري 3D يسمح لحصر ومتابعة مع مكانية عالية (10 دقة نانومتر) والقرار الزماني (استجابة التردد 50 هرتز) من تشريد 3D الجسيمات الفلورية تتحرك على طول جداول من مئات ميكرون 2. وتستند هذه الطريقة على خوارزمية ردود الفعل التي تسيطر على الأجهزة من ثنائي الفوتون مجهر المسح بالليزر من أجل أداء مدار دائري حول الكائن لتعقبها: فإن آلية التغذية المرتدة حفاظ على الكائن الفلورسنت في المركز عن طريق التحكم في تشريد مسح شعاع 3-5. للتدليل على مزايا هذه التقنية، تابعنا على عضية تتحرك بسرعة، ويحلول، داخل حركةتعيشان خلية 6،7. كانت مطلية خلايا وفقا لبروتوكولات القياسية، وملطخة باستخدام تجاريا يحلول صباغة. نناقش بإيجاز تكوين الأجهزة وبمزيد من التفصيل برنامج حاسوبي لمراقبة، لإجراء تجربة تتبع المدارية 3D داخل الخلايا الحية. نناقش بالتفصيل المعلمات المطلوبة من أجل السيطرة على مجهر المسح وتمكين الحركة من الحزم في مدار مغلق حول الجسيمات. نستنتج من خلال إظهار كيف أن هذا الأسلوب يمكن استخدامها بشكل فعال لتتبع حركة سريعة من يحلول صفت على طول الأنابيب الدقيقة في 3D داخل الخلية الحية. يمكن أن الجسيمات الحالة تتحرك بسرعات تتراوح بين 0.4-0.5 ميكرون / ثانية، وعرض عادة حركة موجهة على طول شبكة أنيبيب 8.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير عدد كبير من النهج حتى الآن لتعقب جزيئات الفلورسنت في ثلاثة أبعاد باستخدام المجهر. معظم المناهج تعتمد على استخدام كاميرات سريعة، مناسبة بشكل مثالي لتتبع في بعدين، جنبا إلى جنب مع التعديلات عادة مخصصة للبصريات انبعاث المجهر لتحقيق تتبع في الاتجاه المحوري. المجاهر المسح بالليزر (إما مبائر أو اثنين من الفوتونات) تقليديا يمكن تتبع الجسيمات الفلورية عن طريق إجراء تسلسل وقت ض مداخن، على الرغم من أن هذه العملية هي عادة وقتا طويلا، وغلة قرار زمنية معقولة (10 هرتز) فقط إذا كانت الجسيمات يجري تعقب هو أبقى في وسط منطقة التصوير النقطية الصغيرة من خلال آلية ردود فعل نشطة 2.

فكرة تأمين في أن الجسيمات هي قاعدة تتبع طريقة المداري. بدلا من خطوط المسح مسح يتم تنفيذ مدار دائري حول الجسيمات الفلورية. كثافة مضان على طولالمدار يموضع بالضبط موقف الجسيمات 4.

ويمكن بعد ذلك الموقف مترجم من الجسيمات أن تستخدم لتحفيز الماسحات الضوئية المجهر وإعادة مركز المدار على موقف الجسيمات. هي التي تحرك الماسحات الضوئية الجلفانومتر المجهر من قبل الجهد التناظرية. المكون AC هذا الجهد تتيح أداء مدار مع تركيز شعاع الليزر، أي الجيب وجيب التمام موجة تطبيقها على X و Y مسح المرايا سيسمح أداء مدار دائري. العاصمة إزاحة إشارة يسهل تغيير موقف مركز المدار. مرة واحدة يتم تحديد فترة المدار ويتم تكوين الموجي للإشارة AC، يحتاج نظام التغذية المرتدة لتحديث فقط المكون DC للإشارة.

مطلوب وهناك برامج قادرة على قراءة إشارة الفلورسنت التي تم جمعها من كشف للسيطرة على الماسحات الضوئية وأجهزة الكشف، لحساب الموقف من الجسيمات وتحديث DC خارجتعيين. عن ردود الفعل الناجح التصوير اختيار دقيق للمعلمات المدار (حجم وتوقيت) مطلوب وهذه المعايير يجب أن يتم تعديلها بناء على خصائص الجسيمات الفلورية أنه من الضروري أن تتبع.

وقد وصفت الأسس الفيزيائية والرياضية لهذه التقنية في الماضي 4،5 لكل من 2D و 3D التطبيقات. في هذا البروتوكول وصفنا لفترة وجيزة مكونات الأجهزة الرئيسية للالإعداد، وبمزيد من التفصيل اختيار المعلمات وإعداد العينات اللازمة لتجربة نموذجية السماح لنا بعد النزوح من يحلول في القرار الزماني عالية داخل الخلية الحية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد 1. عينة

  1. الحفاظ على خلايا CHOK1 في قوارير زراعة الأنسجة باستخدام DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. احتضان الخلايا في حاضنة ترطيب 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.
  2. الحصاد ومن ثم لوحة خلايا CHOK1 على 14 مم الصغيرة بشكل جيد مع سمك سطح 0.16 ملم. خلايا البذور لكثافة المثلى للتصوير، حوالي 60-70٪ confluency.
  3. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. غسل الخلايا ثلاث مرات في HBSS (هانك مخزنة محلول ملحي)، واحتضان الخلايا في محلول يحتوي على 50 نانومتر من Lysotracker DND26 الأخضر و 150 نيوتن متر من تويولين تعقب الأخضر. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. خطوة اختيارية: قبل الحضانة، وتؤدي إلى وصمة عار إضافية مع مصفوفة الميتوكوندريا صبغ تلطيخ (25 نانومتر).
  4. غسل الخلايا ثلاث مرات في HBSS لإزالة أي صبغة غير منضم. إضافة جديدة متوسطة النمو DMEM قبل ايماججي الخلايا.

2. المجهر تكوينات

يتم تجميع المجهر لتتبع الجسيمات موضح في البروتوكول الفيديو على إطار المجهر المقلوب المتاحة تجاريا (الشكل 4). لكن وحدات تجارية ل3D تتبع الجسيمات المداري هي متاحة الآن.

  1. استخدام الحرباء-II المتماسك الترا تي: سا الفيمتو ثانية مصدر ضوء الليزر الإثارة، مع الانضباطي نطاق الطول الموجي الناتج بين 690 نانومتر 1،040 نانومتر.
  2. تأكد من أن يتم محاذاة شعاع الليزر في ميناء الخلفي للالمجهر باستخدام المرايا المغلفة الأشعة تحت الحمراء. والموهن شعاع الليزر باستخدام الدورية لوحة نصف موجة تليها المستقطب الخطي الكالسيت. تخفيف شعاع بحيث متوسط ​​القوة في العينة ما بين 0.5 و 2 ميغاواط.
    ملاحظة: وينعكس شعاع الليزر من قبل زوج من الجلفانومتر الحركية دفعتها المرايا التي تسمح السيطرة على الموقف ومسار شعاع تركيزا في الطائرة العينة. فيتكوين نموذجي يتم توسيع موازى شعاع الليزر الخروج من المرايا الجلفانومتر (10X) يمر شعاع المتوسع، قبل الدخول في الجزء الخلفي من الهدف المجهر بعد التفكير في تمرير القصير مزدوج اللون المرآة.
  3. جمع ضوء مضان من العينة عن طريق وضع الهدف العددي ارتفاع المياه الفتحة (60X، NA 1.2) في مسار الضوء. اختيار مرشح مضان مكعب وفقا لموجات الانبعاثات المطلوبة في التكوين إما واحد أو اثنين من القناة. توظف مرشحات ممر الموجة الانبعاثات لزيادة تحديد النطاق الطيفي مضان المنبعثة.
  4. ضع العينة على مرحلة الآلية، وضبط حركة رائعة من الهدف المجهر باستخدام وحدة تحكم بيزو موضوعي.
  5. توجيه الضوء من المكعب مرشح في أنابيب مضخم حيث يتم التمييز الإشارة وإرسالها إلى I / O بطاقة الحصول على البيانات الرقمية.
    ولدت الحاسوب الطول الموجي هي الناتج التناظرية من بطاقة I / O هي ويقوم بتقديم ملاحظة:إد إلى الماسحات الضوئية السيطرة الإلكترونيات. يتم قياس مدخلات الفوتون عد من photomultipliers وإشارة خرج إلى الماسحات الضوئية والتحكم عن طريق بطاقة I / O عن طريق مختبر ديناميات الإسفار SimFCS البرمجيات.

3. التصوير

  1. وضع الخلايا على المسرح والتركيز باستخدام تنتقل الإضاءة الخفيفة.
  2. التحول إلى التصوير النقطية مسح لتحديد الخلايا التي أدرجت الصبغة وتصور ميكروتثبول الأساسية. تحديد المنطقة الأولى حيث حركة حويصلة موجودة.
  3. مرة واحدة يتم تحديدها لحويصلة معزولة، تعيين المعلمات التالية لتتبع المداري:
    1. تحديد نصف قطر المدار لتحديد حجم مسح دائري وفقا لحجم الجسيمات يجري تعقب. لباعث نقطة، تعيين نصف قطر المدار يساوي وسطه من وظيفة نقطة انتشار (PSF) من شعاع الإثارة لتعظيم حساسية واستجابة.
    2. تعيين المحوريتنأى لتحديد المسافة بين اثنين مدارات التي يتم تنفيذها في توطين موقف الجسيمات على طول الاتجاه المحوري. تعيين المسافة المحورية ل1.5-3 أضعاف الخصر قوات الأمن الفلسطينية.
    3. تحديد مدة بقاء فقا للسطوع من الجسيمات لضبط الوقت الذي يقضيه في كل نقطة من المدار، التي ستحدد أيضا معدل تبيض صورة. استخدام مدة انتظار بين 10-100 μsec.
    4. تعيين عدد من النقاط في كل المدار إلى 64 أو 128 لانتاج مدار فترات في حدود 4-32 مللي ثانية وتقديم قرار زمنية عالية لتحديد موقف الجسيمات.
  4. تغيير العاصمة تعويض إشارة أرسلت إلى المرايا لمركز شعاع على الجسيمات من خلال واجهة المستخدم الرسومية عبر مجموعة المؤشر في الصورة الممسوحة ضوئيا-النقطية.
  5. بدء تتبع عن طريق التحول من وضع المجهر النقطية التصوير لمسح المداري.
  6. تفعيل الملاحظات والبيانات المجموعة.

4. Trajectتحليل أوري

  1. استخدام البرنامج لعرض مضان جمعها في كل نقطة على طول المدار وعند كل نقطة زمنية في شكل "السجاد كثافة. كثافة جمعت على طول السجادة تقدم معلومات عن تفاعل الجسيمات مع أجسام لامعة أخرى. استخدام البرنامج لعرض كل المعلومات الخاصة بالمسارات (أي نزوح DC مع مرور الوقت من س، ذ الماسحات الضوئية وض -piezo) فضلا عن كثافة مضان جمعها من أنبوب مضخم مع مرور الوقت في شكل سلاسل زمنية.
  2. استخدام تمثيل السلاسل الزمنية والمعلومات "السجاد كثافة" فقط لتحديد المنطقة ذات الاهتمام في هذا المسار.
  3. استخدام البرنامج لعرض الإسقاط 2D من الجزء المحدد من مسار الجسيمات. تحديد الضوابط المناسبة للون رمز مسار وفقا لكثافة الجسيمات مضان.
  4. حدد الخيار لعرض عالمادة مسار في 3D، ولون رمز وفقا لكثافة مضان. تدوير في مسار 3D باستخدام عناصر التحكم على تصور ملامح من الحركة يحلول على طول أنيبيب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا لهذا البروتوكول سريع 3D تتبع جسيم واحد لا يمكن أن يؤديها داخل الخلايا الحية باستخدام تعديل المجهر ثنائي الفوتون لتعقب النزوح من الجسيمات الحالة fluorescently المسمى. التجربة أجريت تتكون من تتبع ويحلول معزولة تتحرك داخل الخلية بعد عملية النضج دخلول؛ جسيم داخلي 9. كانت ملطخة الجسيمات الحالة باستخدام صبغة الفلورسنت الأخضر والسعادة في 930 نانومتر استغلال 2 الفوتون الإثارة. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أنه من الممكن الحصول على س، ص، ض مسارات النزوح مع القرار ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من تقدمات هائلة من تقنيات مضان المجهري وأدوات القياس على مدى السنوات الماضية، تحقيق مسارات الجسيمات الفلورية في ثلاثة أبعاد مع قرار زمنية عالية ظلت تحديا في هذا المجال. إذا تم تحقيق ارتفاع القرار الزماني الجسيمات تتبع في بعدين، والإرشاد إلى الاتجاه المحوري يجلب عادة ما يكون انخفاض كبير في استجابة التردد للنظام 10.

في هذا البروتوكول الفيديو ركزنا على تطبيق الإيضاح تتبع جسيم الفردية في ثلاثة أب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا المشروع من خلال منح NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 و P50-GM076516

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lysotracker DND 26Life TechnologiesL-7526
Tubuline Tracker GreenLife TechnologiesT34075
Mitotracker REDLife TechnologiesM7512
Chamelon المتماسك- الترا II TIمتماسك
Glan Taylor Calcite PolarizerMelles Griot03PTA001
مرآة الجلفانومتر بمحركCambridge TechnologiesM 6350
مرآة ثنائية اللونChroma Technologies700 DCSPXR
المرحلة الآليةASIMS2000
Piezo  PIP721-LLQ
أنبوب المضاعفHamamatsuH7422P-40
بطاقة الحصول على البياناتIO techPCI 1128-4000
برنامجالتصوير LFDGlobal للصور-SimFCS
الضوئي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
  2. Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
  3. Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
  4. Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
  5. Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
  6. Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
  7. Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
  8. Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
  9. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
  10. Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
  11. Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
  12. Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
  13. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Orbital TrackingTwo photon MicroscopeLysosome TrackingMicrotubule NetworkFluorescent Particle TrackingLaser Scanning MicroscopeIntracellular Vesicle MotionVesicle Transport AnalysisLive Cell ImagingParticle Trajectory Analysis

Related Articles