تصف هذه المقالة نظام زراعة الخلايا العصبية الذي يمكن استخدامه للحصول على كميات كبيرة من العينات المحورية النقية للتحليلات الكيميائية الحيوية والكيميائية المناعية. ستسمح هذه التقنية بفهم أفضل لفسيولوجيا المحور الطبيعي ومسارات الإشارات التي تؤدي إلى التنكس العصبي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنتاج وعزل محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية لتحليل الكيمياء الحيوية باستخدام مرشحات المسامية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تستخدم المحاور العصبية آليات محددة للتوسط في الامتداد والحفاظ على السلامة والحث على التنكس. مطلوب توازن مناسب لهذه الأحداث لتشكيل الدوائر العصبية الوظيفية. يشرح البروتوكول الموصوف هنا كيفية استخدام إدخالات زراعة الخلايا التي تحمل غشاء مسامي (مرشح) للحصول على كميات كبيرة من المستحضرات المحورية النقية المناسبة للفحص بواسطة التقنيات الكيميائية الحيوية أو الكيميائية المناعية التقليدية. سيتم توضيح وظيفة إدخالات المرشح هذه من خلال نماذج التقليم التنموي والتنكس الواليري ، باستخدام مستخلصات عقدة الجذر الظهري الجنينية. تتعرض السلامة والوظيفة المحورية للخطر في مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية العصبية. في الواقع ، من الواضح الآن أن الخلل الوظيفي المحوري يظهر في وقت أبكر بكثير من فقدان سوما العصبي في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، مما يشير إلى أن العمليات الخاصة بمحور عصبي تستهدف بشكل أساسي في هذه الاضطرابات. من خلال الحصول على عينات محورية نقية لتحليلها بواسطة التقنيات الجزيئية والكيميائية الحيوية ، فإن هذه التقنية لديها القدرة على إلقاء ضوء جديد على الآليات التي تنظم فسيولوجيا الفيزيولوجيا المرضية للمحاور. وهذا بدوره سيكون له تأثير في فهمنا للعمليات التي تؤدي إلى الأمراض التنكسية في الجهاز العصبي.
المقدمة
المقصورة محور عصبي من الخلايا العصبية يظهر على درجة كبيرة من الاستقلال الوظيفي من المقصورة-somato شجيري. في الخلايا العصبية الإسقاط، محاور عصبية تحتوي على أكثر من البروتين 1،2 العصبية. اكتسبت دراسة علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية من المحاور الزخم في المجتمع الأعصاب بسبب وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الخلل في وقت مبكر محور عصبي يبدو أن هناك سمة مشتركة بين الأمراض العصبية والاضطرابات العصبية والنفسية 3. يبدو من المرجح أن فهم أفضل لآليات محور عصبي الحصري في الظروف العادية والمرضية وتسليط الضوء على الأحداث في وقت مبكر التي تدفع ضعف.
يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام إدراج ثقافة تحمل غشاء مسامي (فلتر) للحصول على كميات كبيرة من المواد محور عصبي النقي الذي هو مناسبة لالبيوكيميائية ويحلل immunocytochemical. استخدام مرشح إدراج لدراسة البيولوجيا تم تنفيذ محور عصبي أول مرة من قبل ستيوارد و4 الزملاء وتطويرها من قبل تويس وزملاؤه 5 إلى تكوينه الحالي. والتقنية هي الآن في الاستخدام الحالي من قبل الجماعات دراسة جوانب مختلفة من محور عصبي والتغصنات البيولوجيا، مع تعديلات طفيفة في كل حالة لاستيعاب السكان من الخلايا العصبية التي تمت دراستها، وإجراء العلاجات نوع من التحليلات الكيميائية الحيوية المستخدمة 6-9. هذا البروتوكول لا تنوي استيعاب جميع البدائل لمثل هذه مجموعة متنوعة من التطبيقات، وإنما يقدم مقاربة بسيطة التي هي مناسبة لمعظم التطبيقات. على وجه الخصوص، وبروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الطلاء الثلاثي الذي يزيد العائد للمحور عصبي التحليلات البيوكيميائية و هو الأكثر مناسبة لدراسة محور عصبي الطلاء، تنكس الأخرى الموصوفة في الأدبيات تنتج أقل المحاور التي تتراجع وتتدهور بشكل أسرع عند المحرومين من العوامل الغذائية 9.
في هذا الإجراء، لا تزال أجسام الخلايا العصبية معزولة فوق ملحق مرشحالمحاور إيل تمر من خلال المسام وتنمو على طول سطحه السفلي. المحاور النقي (خالية من الملوثات الدبقية والخلايا العصبية خلايا الجسم) التي تنمو على السطح السفلي للمرشح يمكن جمعها عن التحليلات الكيميائية الحيوية أو يمكن ان تكون ثابتة في الموقع وفحصها بواسطة تقنيات immunocytochemical 9. يعتمد الإجراء على استخدام الخلايا العصبية الحسية الجنينية من العقد الجذرية الظهرية (DRG). وتستخدم على نطاق واسع DRGs الجنينية لدراسة البيولوجيا محور عصبي بسبب neurites التي من هذه الخلايا تخضع لنمو سريع وقوي في المختبر عند الاحتفاظ بها في عامل نمو الأعصاب (NGF)، وبسبب أنها تخضع بسرعة انحطاط عندما يحرم من هذا العامل. أيضا، الخلايا العصبية DRG تفتقر التشعبات، حتى يتسنى لجميع neurites التي تم جمعها بواسطة هذه الطريقة هي محاور عصبية بحتة.
تمثل مرشح إدراج ميزة كبيرة بالمقارنة مع المناهج الأخرى المستخدمة لدراسة محاور عصبية. الدراسات التي تعتمد على استخدام المجهر لتمييز العمليات التي تحدث في الخلية سوما من تلك الموجودة فيتوفير المعلومات xons البيوكيميائية محدودة. وكمثال آخر، ونظم الثقافة مجزأة (على سبيل المثال، غرف Campenot 10 أو الأجهزة ميكروفلويديك 11) مفيدة لنهج التصوير والمعاملة التفضيلية للمقصورات الخلية ولكن لا توفر سوى كميات صغيرة من المواد محور عصبي، مما يحول دون استخدام هذه التقنيات لتحليل الكيمياء الحيوية والتي تتطلب كميات كبيرة نسبيا من العينة. علاوة على ذلك، استخدامها يتطلب تدريبا كبيرا وكذلك الأجهزة المتخصصة، وأنها مضيعة للوقت. مقاربة أخرى غالبا ما تستخدم لعزل المحاور من إإكسبلنتس هو إزالة مركز ازدراع (التي تحتوي على أجسام الخلايا العصبية) يدويا قبل جمع العينات محور عصبي. على الرغم من أن هذا يمكن أن تنتج كميات كبيرة من المستحضرات التخصيب المحور، محاور في هذا المستحضر يمكن يلفها الدبقية وإزالة بسرعة الهيئات 20 ازدراع وعلى التوالي في الفترة من 6 آبار (كمثال على تجربة الحد الأدنى) هو مضيعة للوقت وعلى الحد من جدوى.
في المقابل، فإن الطريقة المعروضة هنا تنتج الاستعدادات محور عصبي وفيرة والنقية التي يمكن بعد ذلك يتم تحليلها من قبل تقريبا أي أسلوب البيوكيميائية التي يشيع استخدامها لتحليل لست] خلية كاملة، مثل لطخة غربية، 6 مناعي، لطخة الشمالية 5 6 مطياف الكتلة، وتنقية الحمض النووي الريبي 7،12،13، من بين آخرين. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول يمكن تطبيقها على التألق المناعي (IF) التقنيات، كما أنه من الممكن لإصلاح المحاور نموا في الجانب السفلي من مرشح لمزيد من دراستها من قبل IF. هذا النهج يسهل كثيرا من عمليات تحليل محور عصبي محددة حيث لا توجد أجسام الخلايا في الإعداد النهائي. هذا هو ميزة كبيرة منذ إشارة مناعي عالية من أجسام الخلايا غالبا ما يقوض فحص وتحليل إشارة أضعف منشؤها من الهياكل رقيقة مثل محاور عصبية.
تطبيقين من الأسلوب الثقافة لدراسة محور عصبي تنكس عه وصفها؛ نموذج للتشذيب التنموية ونموذجا للانحطاط الناجم عن الإصابة (يشار إلى انحطاط ولري ع). ويستند نمذجة تشذيب التنموية على حقيقة أن الخلايا العصبية الحسية في الجسم الحي المنافسة للحد من كميات المشتقة من الهدف NGF وتلك فشله في الحصول على دعم كاف عصبية المنحطة 14. يمكن تحاكي هذه الظاهرة في الثقافات DRG الجنينية من خلال سحب NGF من وسائل الإعلام والثقافة، والتي، كما يحدث في الجسم الحي، يبدأ تنكس محور عصبي تليها تدمير خلايا الجسم. لنموذج الضمور ولري، يتم كشط الجانب العلوي من التصفية مع الهيئات الخلية بعيدا. المحاور التي نمت على الجانب السفلي من مرشح انفصلوا جسديا من أجسام الخلايا والخضوع بعد ذلك عملية التنكسية السريع والنمطية المعروفة باسم ولري الضمور 15، سميت A. الر الذين ذكرت أول هذه الظاهرة في عام 1850 16.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: الإجراءات التالية وفقا للمبادئ التوجيهية التي وافق عليها المجلس الكندي للرعاية الحيوان. يتم بذل كافة الجهود لتقليل الألم والضيق من الحيوانات أثناء الإجراءات.
1. طلاء من الفلاتر
ملاحظة: عندما توضع إدراج مرشح الثقافة في الآبار لوحات متعددة جيدا، وتعرف اثنين من مقصورات: مقصورة الأعلى هو المنطقة فوق إدراج ومقصورة القول هي أقل من واحد في إدراج الشكل 1A.ab. هي المصنفة إإكسبلنتس في مقصورة كبار حيث نعلق على الجانب العلوي من مرشح؛ العديد من المحاور تنمو من خلال تصفية وتوسيع على الجانب السفلي من مرشح، داخل حجرة أسفل الشكل 1A.c. مجلدات العمل القياسية (أي لتطبيق حل طلاء، ويغسل، وسائل الإعلام والثقافة، وغيرها) هي 2 مل لمقصورة السفلي و 1 مل لمقصورة العلوية وستكون المشار إليها في البروتوكول بأنه "؛ وحدات التخزين القياسية ". إضافة الحلول بدءا من حجرة أسفل عن طريق وضع غيض من ماصة في الفجوة بين إدراج وجانب البئر. أيضا، إمالة إدراج إلى جانب واحد في حين الاستغناء الحل لمنع الفقاعات من الوقوع على الجزء السفلي من مرشح.
- بدء طلاء المرشحات في اليوم قبل الطلاء. تحت غطاء محرك السيارة الأنسجة الثقافة العقيمة، ووضع 24 ملم إدراج مرشح في لوحة تلقي 6 جيدا. احتضان إدراج مع بولي-D-يسين في الماء (1 ملغ / مل) لمدة 1 ساعة على RT باستخدام وحدات التخزين القياسية: 2 مل في حجرة أسفل و 1 مل في القمة.
- نضح بولي-D-يسين وشطف مرة واحدة مع الماء. نضح المياه، إغلاق الغطاء ويترك لوحات لتجف في غطاء محرك السيارة O / N. خلال تطلع السوائل، للتأكد من إزالة بقايا السائل الذي يصبح محاصرين مباشرة تحت التصفية.
- في صباح اليوم التالي، وتمييع laminin في الماء (10 ميكروغرام / مل)، ومزيج دافئ عند 37 درجة مئوية. احتضان إدراج مع laminin 1 ساعة في سلل حاضنة عند 37 درجة مئوية، وذلك باستخدام وحدات التخزين القياسية.
- laminin نضح وإضافة الكولاجين في الماء (0.1 ملغ / مل)، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. في هذه الحالة استخدام 2 مل لمقصورة السفلي و 2 مل لمقصورة أعلى.
- الكولاجين نضح ويغسل مرة واحدة مع الماء المعقم. المرشحات هي الآن جاهزة لاستقبال وسائل الإعلام والثقافة، وإإكسبلنتس DRG، كما هو موضح في الخطوة 3.
2. تشريح الجنينية ظهري الجذر العقدة (DRG) إإكسبلنتس
- تخدير ماوس الإناث الحوامل 13 يوما عن طريق الحقن IP من آفيرتين (250 ملغ / كلغ). الانتظار 10-15 دقيقة والتحقق من عدم وجود ردة فعل الانسحاب القرنية ودواسة. ردود الفعل مرة واحدة غائبة، نفذ خلع عنق الرحم.
- تطهير جميع الأدوات الجراحية والبطن الإناث مع الايثانول 70٪. تسمح الأدوات لتجف. عقد جلد البطن وقطع طريق الجلد والعضلات لفضح طبقات تجويف البطن.
- إزالة الرحم عن طريق فصل من عنق الرحم والمبايض. في STERIلو هود، وإزالة الأجنة من الرحم مع مقص وجمعها في طبق بتري مليئة سائل الإعلام L15 الجليد الباردة. الحفاظ على الجليد.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى التقارير الفنية السابقة لمزيد من التفاصيل حول كيفية الحصول على أجنة من 13 يوما من الحمل 17،18. - تحت المجهر، ووضع الجنين على الجانب واستخدام مقص الربيع صغيرة لإزالة الرأس. إجراء شق على طول الجانبين الجانبي لتجاهل الصدر والبطن والأطراف والذيل. الحفاظ على الجزء الخلفي الذي يحتوي على العمود الفقري، ووضع الجانب بطني حتى وإزالة كافة أجهزة الحشوية.
- مع مقص الربيع الصغيرة، وفضح الحبل الشوكي بأكمله عن طريق قطع العمود الفقري من الجانب بطني على طول خط الوسط. عقد الذبيحة أسفل مع زوج واحد من ملقط (# 3) واستخدام الزوج الثاني لعقد الحبل الشوكي عن طريق الجانب الأكثر منقاري.
- ببطء وبلطف سحب الحبل بعيدا عن تجويف الفقري وقرصة قبالة DRGs من الحبل الشوكي باستخدام ملقط رقيقة جدا (# 5). مجموعة DRGs التي سيتم جمعها علىالجزء السفلي من الطبق.
- جمع DRGs تجميعها بواسطة الشفط مع 200 ميكرولتر ماصة التي تم قطع لتكبير افتتاحه. وضع DRGs في أنبوب وترك على الجليد حتى يتم الانتهاء من جمع DRG.
ملاحظة: يفضل الأبيض / نصائح شفافة لأن DRGs لا تلتصق على جدران هذا غيض (بالمقارنة مع نصائح الأصفر قياسي). نصائح التنظيف مع وسائل الاعلام قبل الاستخدام مزيد يمنع DRGs من التمسك جدرانه.
3. البذر وصيانة الظهرية جذر العقدة إإكسبلنتس على الفلاتر
- إضافة كاملة سائل الإعلام DRG عند 37 درجة مئوية لإدراج المغلفة باستخدام وحدات التخزين القياسية. تكملة وسائل الإعلام حجرة أسفل مع 15 نانوغرام / مل من نيسان الخليج، مع الحفاظ على أعلى مجانا مقصورة نيسان الخليج.
ملاحظة: على الرغم من NGF ينشر بكفاءة عبر تصفية وتركيزه equilibrates في غضون ساعات، لاحظنا أن تطبيق NGF إلى حجرة أسفل مباشرة قبل البذر يزيد بشكل ملحوظ العائد على محور عصبي بسطح ottom للمرشح. - نقل DRGs من الأنبوب إلى الفلاتر باستخدام ماصة ميكرولتر 1،000 مع تلميح قلص لتكبير افتتاحه.
- رسم وسائل الاعلام الى طرف 2-3X قبل جمع DRGs. هذا يمنعهم من التمسك الجانب الداخلي من غيض. يمكن نفس غيض إعادة استخدامها لجميع الآبار. استخدام نصائح بغير لون (مقابل نصائح الأزرق قياسي) يقلل DRG العالقة إلى السطح غيض.
- لنقل DRGs، تعيين ماصة 800 ميكرولتر. نضح ما يقرب من 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام من الجانب العلوي من التصفية، ثم انتقل إلى أنبوب يحتوي على DRG وماصة حجم صغير صعودا وهبوطا - ل resuspend DRGs التي غرقت إلى أسفل. نضح حجم كله وDRGs ماصة غمر طرف في منتصف إدراج.
- مرة واحدة يتم تحميل كل إدراج، إغلاق الغطاء ودوامة لوحة لوحة 10X، والتنصت برفق على مقاعد البدلاء هود بين كل دوامة. هذه الحركات زيادة الغلة محور عصبي من خلال مساعدة إإكسبلنتس DRG تغرق ونعلق على التصفية. ويساعد هذا أيضا توزيع إإكسبلنتس بالتساوي بحيث محاور مختلفة من إإكسبلنتس لا تتداخل.
ملاحظة: الإجراء البذر ازدراع موضح في الخطوات السابقة يزيد بشكل كبير من المعدل العام للمرفق ازدراع إلى الركيزة (تصل إلى 75٪). الأهم من ذلك الإجراء pipetting ليمنع بسهولة إإكسبلنتس من تطفو على سطح سائل الاعلام بدلا من الغرق في قاع إدراج. - لتحليل الكيمياء الحيوية، وDRGs البذور من جنين واحد (حوالي 30) لكل مرشح. لالتحليلات المورفولوجية، استخدم إما نصف أو ثلث DRGs من جنين واحد (10-15). يجب أن يتم هذا القرار قبل جمع DRGs في أنابيب، بحيث يتم المصنفة جميع DRGs من أنبوب في بئر واحدة (سواء كانت 30، 15، أو 10 DRGs).
- الحفاظ على الثقافات في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية، وتغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. لتغيير وسائل الإعلام، ونضح المقصورة العليا الأولى، تليها حجرة أسفل. إضافة وسائط جديدة في حجم قياسيليالي بدءا من حجرة أسفل.
ملاحظة: لمنع الخلايا / محاور من التجفيف، لا تتغير وسائل الإعلام في أكثر من 3 إدراج في نفس الوقت. سوف DRGs نمت على المرشحات في حضور NGF تمديد محاور طويلة، تصل إلى 2 ملم بعد 2 أيام في الثقافة.
4. التغذية عامل سحب العلاج
NGF انسحاب يدفع تنكس محور عصبي مع تجزئة محور عصبي (يحدده الطوري وβ-III-تويولين IF) التي تظهر أولا حوالي 12 ساعة بعد الانسحاب. ويتحقق تجزئة كاملة بنسبة 36 ساعة. متى يتم ترك انحطاط المضي قدما لأن يتم اختياره من قبل المستخدم النهائي وفقا لتصميم التجريبية.
- بعد مرحلة تمديد محور عصبي 2 يوما، وتغيير وسائل الاعلام من المقصورات العلوية والسفلية إلى وسائل الإعلام التي تفتقر إلى NGF ويحتوي على أجسام مضادة لمكافحة NGF (1 ميكروغرام / مل) لعزل أي المتبقية (أو المنتجة التطور الطبيعي) NGF.
- العودة إلى الحاضنة لوحات خلية (37 درجة مئوية) للسماحNGF انحطاط الناجم عن الانسحاب والمضي قدما لمبلغ من الوقت المطلوب.
- الشروع في استخراج البروتين (الخطوة 6) للفحص من قبل لطخة غربية أو فحص مباشرة المرشحات التي كتبها IF (الخطوة 7).
5. محور عصبي Transection للحث على ولري البقعي
يترك هذا الإجراء محاور على الجانب السفلي من مرشح منفصل عن جسم الخلية، ولكن حالها خلاف ذلك. بعد ذلك، وهذه المحاور الشروع بسرعة ولري انحطاط. تجزئة محور عصبي (يتضح من مرحلة التباين أو β-III-تويولين IF) يبدو للوهلة الأولى بنسبة 3 ساعة بعد transection؛ قبل 9 ساعة، محاور مجزأة تماما وبعيدة عن التصفية. متى يتم ترك انحطاط المضي قدما لأن يتم اختياره من قبل المستخدم النهائي وفقا لتصميم التجريبية.
- كشط الجانب العلوي من التصفية، التي تحتوي على إإكسبلنتس DRG نمت، مع خلية مكشطة. ضمان إزالة كاملة من مواد أعلى عن طريق تحريك مكشطة في X، Y والتعميمالاتجاهات.
- تجاهل وسائل الإعلام من المقصورة التي تحتوي على أعلى لل explants العائمة التي تم كشط من مرشح واستبدالها مع 1 مل من قبل حرارة، واستكمال وسائل الإعلام التي تحتوي على DRG NGF (10 نانوغرام / مل).
- العودة إلى الخلية الحاضنة لوحة (37 درجة مئوية) للسماح ولري الضمور المضي قدما لمقدار الوقت الذي يختاره المستخدم النهائي.
- الشروع في استخراج البروتين (الخطوة 6) للفحص من قبل لطخة غربية أو فحص مباشرة المرشحات التي كتبها IF (الخطوة 7).
6. استخراج البروتين من العينات محور عصبي
- ملء أنابيب جمع (1.5 مل) مع 75 ميكرولتر من عينة Laemmli العازلة. إبقاء الأنابيب على الجليد بينما حصاد محاور عصبية من مجموعة كاملة من الفلاتر.
- غسل فلتر مع إإكسبلنتس DRG في برنامج تلفزيوني وكشط الجانب العلوي من التصفية. إزالة إدراج من لوحة، وتنظيف الجانب العلوي من التصفية مع قضيب من القطن طرف ونضح أي برنامج تلفزيوني إضافية من الجانبين العلوي والسفلي.
- وضع إدراج رأسا على عقبحملة على مقاعد البدلاء وقطع مرشح للخروج من إدراج باستخدام مشرط حاد. اضغط على فلتر مع ملقط، من أسفل إلى أعلى. اجراء خفض من محيط إلى مركز للتصفية مع مقص.
- مكان مرشح على رأس أنبوب جمع، ومع ملقط، اضغط وسط مرشح أسفل الأنبوب. في حين القيام بذلك، ينبغي أن تشكل القمع. دفع مرشح على شكل قمع في الجزء السفلي من الأنبوب بحيث يتم غمرها في عينة العازلة Laemmli.
- استخراج البروتين الكامل من الغليان الأنابيب لمدة 4 دقائق. إزالة عامل التصفية باستخدام ملقط وضعه رأسا على عقب في الجزء العلوي من الأنبوب وأداء تدور قصيرة (2،000 x ج لمدة 15 ثانية). تجاهل مرشحات المجففة.
- حل 10 ميكرولتر من إعداد البروتين محور عصبي في SDS-PAGE تليها طخة غربية للكشف عن البروتينات المثيرة للاهتمام.
ملاحظة: كما مرجعا، وإعداد محور عصبي من 20 إإكسبلنتس نمت لمدة 2 أيام و lysed في 100 ميكرولتر من العازلة RIPA تحلل وسوف يكون تركيز البروتين من 4-6ميكروغرام / ميكرولتر.
7. فحص المناعي من محاور عصبية على الفلاتر
توضح الخطوات التالية التلاعب العام لأداء IF تلطيخ على إدراج مرشح، والتي تجسدت في الكشف عن β-III-تويولين. تثبيتي، وأوقات الحضانة، وتركيزات وتفاصيل أخرى ينبغي أن يكون الأمثل للأزواج أخرى ضد مستضد.
- الاستفادة المستخدمة سابقا 6 لوحات جيدة، وتنظيفها جيدا، ليغسل وحضانات التالية للتدرج.
- لفترة وجيزة غسل إدراج في برنامج تلفزيوني. اصلاحها في الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT على شاكر.
- بعد التثبيت، كشط وتنظيف الجانب العلوي من إدراج لجمع المحاور التي نمت بشكل حصري على السطح السفلي من التصفية. المضي قدما في حضانات القياسية لIF.
- احتضان إدراج في عرقلة الحل (TBS، 0.05٪ توين 20، 5٪ الحليب الخالي من الدسم)، وذلك باستخدام وحدات التخزين القياسية، لمدة 1 ساعة على RT مع الهز لطيف.
- نقل إدراج إلى الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة العازلة (مكافحة β-III-تويولين، 1:5،000)، وذلك باستخدام وحدات التخزين القياسية. احتضان O / N (~ 18 ساعة) في 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
- يغسل الجسم المضاد الأول مرتين في برنامج تلفزيوني (2 X 10 دقيقة في RT).
- نقل إدراج إلى الأجسام المضادة الثانوية فلوري، مترافق المخفف في عرقلة العازلة (الماعز المضادة للماوس، 1:2،000)، وذلك باستخدام وحدات التخزين القياسية. احتضان تغطيتها من الضوء لمدة 2 ساعة على RT مع الهز لطيف.
- غسل 3X الضد الثانوية في برنامج تلفزيوني (3 × 10 دقيقة في RT).
- بعد IF كاملة، واتخاذ إدراج الخروج، صب بعيدا PBS من غسل وتنظيف مشاركة الجانب العلوي من التصفية مع قضيب من القطن طرف. نضح أي السائل من الجانبين العلوي والسفلي.
- مكان إدراج رأسا على عقب على مقاعد البدلاء، وقطع مرشح للخروج من إدراج مع مشرط حاد.
- اضغط على فلتر مع ملقط، حتى الهبوط، ووضع على شريحة المجهر. تراكب مع ساترة ومذكرة التفاهم الفلورسنت المتوافقةnting سائل الإعلام. دعونا شقة الجافة في غرفة باردة، تغطيتها من الضوء. فحص والتقاط الصور باستخدام المجهر الفلورسنت.
ملاحظة: عند تخزينها في 4 درجة مئوية، ومحمية من الضوء، وهذه الاستعدادات يمكن أن تظل لأسابيع مع فقدان الحد الادنى من مضان. - اختياري: بدلا من ذلك، إذا لا يمكن أن يؤديها على الفلاتر التي تم إزالتها من إدراج. للقيام بذلك، كشط وتنظيف الجانب العلوي من المرشحات مباشرة بعد التثبيت.
- تأخذ المرشحات للخروج من إدراج مع مشرط حاد ومكان مرشحات محاور المتابعة على الجزء السفلي من لوحة ستة جيدا.
- بعد ذلك، نفذ حضانات لIF كما هو مبين في 7،4-7،8 و7.11. ميزة هذا البديل هو أنه يوفر الكواشف، منذ ذلك الحين، على سبيل المثال، يمكن أن أحجام الحضانة تنخفض إلى 500 ميكرولتر (بالمقارنة مع 3 مل تستخدم عندما يتم ملطخة المرشحات مباشرة على إدراج كما هو مبين في 7،1 حتي 7،11).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إإكسبلنتس العقدة الجذرية الظهرية من الفئران E13.5 تنمو على نطاق واسع على مرشحات بالتتابع المغلفة مع بولي-D-يسين، laminin والكولاجين (الشكل 1B، يسار)، تصل إلى 2 ملم في غضون 2 أيام في الثقافة. هذا المزيج الركيزة ينتج نمو مندفعا بشكل خاص؛ مجموعات أخرى تسفر المحاور التي هي أقصر بكثير (الشكل 1B، يمين). علاوة على ذلك، DRGs الحفاظ على مرشحات تمتد أكثر وأطول من المحاور DRGs نمت على الشكل 1C البلاستيك.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتشمل المعلمات المهم أن تأخذ في الاعتبار عند التكيف مع هذه التقنية السكان العصبية التي سيتم دراستها، الركيزة، حجم المسام من مرشح ومساحة السطح. وجميع هذه المعلمات يؤثر على خصوصية ونوعية وكمية من إعداد محوار تم الحصول عليها، ويجب أن تدرس بعناية من قبل المستخدم النهائي. في الأمثلة الواردة في هذا البروتوكول، واستخدام الخلايا العصبية DRG لديه ميزة تمديد المحاور فقط، وبالتالي إعطاء النقي (محددة) إعداد المحاور.
نمو محور...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا المشروع من خلال MOP62827 منح من المعاهد الكندية للبحوث الصحية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فأر CD-1 ، الحمل الموقوت E13 | نهر تشارلز نهر | يمكن إجراء الحمل في المنزل عن طريق تزاوج الفئران والتحقق من وجود سدادات مهبلية (اليوم E0) | |
| إدراج ثقافة خلايا الصقر Corning | 353102 | 1 & micro; حجم المسام م ، يناسب 6 آبار لوحة استقبال | |
| مصاحبة لثقافة خلايا الصقر لوحات | 353502 | Corning لإدراج | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | تستخدم عند 1 مجم / مل في الماء. يمكن إعادة الاستخدام مرة واحدة. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | يستخدم في 10 & micro; جم / مل في الماء. خذ مخزون 100x من -80 درجة ؛ C وذوبان O / N عند 4 درجة ؛ ج |
| محلول الكولاجين البقري PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | يمكن استبداله ب DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 مكمل غذائي خال من المصل | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2 & prime ؛ -deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S ، وحدة فرعية بيتا) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| جسم مضاد مضاد ل NGF | محضر داخليا | كما هو موضح في: Acheson، A. et al.< / em> الكشف عن النشاط الشبيه بعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ في الخلايا الليفية وخلايا شوان: تثبيط الأجسام المضادة ل NGF. العصبيه. <قوي>7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | خيار | |
| الأجسام المضادة المضادة للتوبولين | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للجسم المضاد للفأر | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG وسط ثقافة < / strong> | |||
| Neurobasal Medium 2٪ B27 المكملات الغذائية العصبية 2 ملي مولار L-Glutamine 1٪ Penicillin-Streptomysin 10 & micro ؛ M FDU 15 نانوغرام / مل NGF (المقصورة السفلية فقط) | |||
| 2٪ SDS 50 ملي مولار DTT 60 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 6.8) 5٪ جلسرين 0.01٪ (وزن / حجم) بروموفينول أزرق |
المراجع
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
