يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصور الإلتقام بالكلاذرين بوساطة من G مستقبلات البروتين يقترن قرار واحد في الحدث عبر الميكروسكوب TIRF

70.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51805

⸱

أكتوبر 20, 2014

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

في هذه المقالة

ملخص

الالتقام الخلوي بوساطة كلاثرين ، وهي عملية سريعة وديناميكية للغاية تستوعب العديد من البروتينات ، بما في ذلك مستقبلات الإشارات. يصور البروتوكول الموصوف هنا بشكل مباشر حركية الأحداث الداخلية الفردية. هذا ضروري لفهم كيفية تنسيق الأعضاء الأساسيين في آلية الخلية مع بعضهم البعض ، وكيف تؤثر شحنة البروتين على هذه العملية.

الملخص

< p class = 'jove_content'>يتم استيعاب العديد من مستقبلات الإشارات المهمة من خلال عملية الالتقام الخلوي بوساطة الكلاثرين المدروسة جيدا (CME). حددت المقايسات البيولوجية للخلية التقليدية ، التي تقيس التغيرات العالمية في الالتقام الخلوي ، أكثر من 30 مكونا معروفا مشاركا في CME ، وقد أنتجت الدراسات الكيميائية الحيوية خريطة تفاعل للعديد من هذه المكونات. ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التعليم الطبي المستمر عملية ديناميكية للغاية وتنظيمها معقد ودقيق. في هذه المخطوطة ، نصف استخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) لتصور ديناميكيات مكونات الآلية الداخلية بوساطة الكلاثرين بشكل مباشر ، في الوقت الفعلي في الخلايا الحية ، على مستوى الأحداث الفردية التي تتوسط هذه العملية. هذا النهج ضروري لتوضيح التغييرات الطفيفة التي يمكن أن تغير الالتقام الخلوي دون منعه عالميا ، كما يتضح من التنظيم الفسيولوجي. سنركز على استخدام هذه التقنية لتحليل مجال الاهتمام الناشئ ، وهو دور تكوين البضائع في تعديل ديناميكيات الحفر المميزة المطلية بالكلاثرين (CCPs). يتوافق هذا البروتوكول مع مجموعة متنوعة من مجسات التألق المتاحة على نطاق واسع ، ويمكن تطبيقه لتصور ديناميكيات العديد من جزيئات الشحن التي يتم استيعابها من سطح الخلية.

المقدمة

عملية بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME) تعتمد عند وصول توقيت جيد لعناصر كثيرة من الآلات التقامي بوساطة بالكلاذرين لجمع البضائع والتلاعب غشاء البلازما إلى الحويصلات 1-3. يبدأ CME من تشويه الغشاء والبضائع محول البروتينات التي تأتي معا في مواقع الوليدة من الإلتقام 1. هذه البروتينات تجنيد بالكلاذرين البروتين معطف، والتي تجمع إلى بنية تشبه القفص الذي يشكل حفرة المغلفة بالكلاذرين (CCP) 4. مرة واحدة يتم تجميعها في CCP بالكامل في شكل كروي، انفصال الغشاء، في المقام الأول من خلال عمل GTPase كبير، dynamin، يولد حويصلات المغلفة بالكلاذرين مجانية (CCVs) 5،6. استيعاب هذا يؤدي التفكيك السريع للمعطف بالكلاذرين، مما يسمح المكونات ليتم إعادة استخدامها لجولات متعددة من التعليم الطبي المستمر.

تم اكتشاف الجذور وتوصيف البروتينات المشاركة في التعليم الطبي المستمر في bioch التقليديemical، الوراثية، وتقنيات الفحص المجهري 4-6،8. وقد أوضحت هذه المقايسات أدوار ونقاط التفاعل بين هذه المكونات التقامي. على الرغم من المفيد جدا لتحديد المكونات الأساسية للماكينات الاتجار، هذه المقايسات محدودة للغاية في الاستيلاء على السلوك الديناميكي مكونات CME أو تركيز البضائع. هذا هو الحد الحرج، منذ تحركها CME من قبل الجمعية فشلت مجموعات من وحدات البروتين في خطوات محددة، ومنذ التغيرات الصغيرة في ديناميات الأحداث التقامي الفردية يمكن أن تكون له عواقب تراكمية كبيرة على الإلتقام. وعلاوة على ذلك، فإن البيانات الأخيرة تشير إلى أن نقط التحكم الحرجة الفردية قد تختلف سواء في تكوين والسلوك، مما يشير إلى أن التنظيم الفسيولوجي لهذه العملية هو غاية مكانيا وزمانيا مقيدة 9-14. تصور الأحداث التقامي الفردية، وبالتالي، لا بد أن نفهم لماذا هناك بروتينات زائدة المتعددة التي ينطوي عليها ب CME وكيف يمكن التحكم هذه البروتيناتإشارات الفسيولوجية ذ لتنظيم استيعاب البضائع.

نحن هنا وصف استخدام التفكير إجمالي الداخلية مضان المجهري (TIRFM) لمراقبة CME على مستوى ديناميات نقط التحكم الحرجة الفردية في الخلايا الحية. TIRFM تعتمد على الفرق في معامل الانكسار بين ساترة الزجاج والبيئة السوائل من الخلايا 15،16. عندما يتم توجيه ضوء الإثارة تجاه الخلايا في أكثر من زاوية حرجة، وينعكس داخليا، وخلق موجة زائل التي تحافظ على حقل رقيقة من الإضاءة تمتد حوالي 100 نانومتر فوق ساترة. وهذا يضمن أن فقط جزيئات الفلورسنت في هذا المجال الضيق متحمسون. عمليا، هذا يسمح الإثارة من جزيئات الفلورسنت على أو بالقرب من غشاء البلازما، ويقلل من مضان من الأجزاء الداخلية للخلية. هذا يوفر أعلى بكثير نسبة الإشارة إلى الضوضاء وض محور قرار لتصور الأحداث في غشاء البلازما، وشاركmpared إلى طرق أكثر شيوعا مثل epifluorescence التقليدية أو متحد البؤر المجهري مضان. وصفنا أيضا، في أحد التمهيدية والمستوى العملي، واستخدام صورة منصة التحليل تستخدم عادة لتحليل وquantitate معالم شكلية بسيطة وديناميات الأحداث الفردية التقامي البضائع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التعبير عن الموسومة fluorescently CME في مكونات الخلايا المستزرعة

HEK293 الخلايا هي خلايا نموذج المفيدة التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة البيولوجيا النوع من الاختزال والإلتقام، وبالتالي تستخدم كنماذج في هذا البروتوكول. استخدام أي بروتوكول ترنسفكأيشن توفير تعبير موحد دون overexpression ومنخفضة السمية الخلوية.

  1. ثقافة التعامل مع كل خلية في معقم غطاء تدفق الصفحي. ملء 4 آبار من لوحة 12 جيدا مع 1 مل من التعديل وسائل الإعلام Dulbecco والأساسي (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). من قارورة متكدسة T25 الخلايا HEK293 تمييع 01:50، 01:25، 01:16، 01:10 على التوالي في كل من 4 آبار.
    1. بدلا من ذلك، البذور الخلايا إلى لوحة متعددة جيدا من الحجم المطلوب، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. البذور 0،4-2 × 10 4 الخلايا في 12 لوحة جيدا. تنمو الخلايا خلال الليل في العقيمة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة.
      ملاحظة: نظرا إلى أن نمو صآتش تختلف تبعا لشروط وخطوط الخلايا، قد يكون من الأفضل أن البذور آبار متعددة لضمان confluency المثالي لترنسفكأيشن في اليوم التالي أو إمكانية أداء transfections في مكررة.
  2. في صباح اليوم التالي، حدد علاوة على ذلك هو ~ 70٪ متموجة لترنسفكأيشن (انظر الشكل 1B). إذا لم يتم التوصل الى جانب هذه الدولة، الانتظار ليوم آخر.
    ملاحظة: 70٪ confluency مثالية لHEK293 الخلايا. بنقل العدوى إلى خلايا التي هي نتائج أكثر متفرق في موت الخلايا والسمية. Transfecting نتائج الإفراط في خلايا متكدسة في سوء التعبير.
  3. إضافة 60 ميكرولتر العازلة EC (من عدة ترنسفكأيشن)، 400 نانوغرام من البلازميدات ترميز الموسومة GPCRs و / أو مكونات الماكينات بالكلاذرين، و 2.4 ميكرولتر من محسن في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. دوامة لمدة 2 ثانية لضمان خلط كاف، وتدور في microfuge في 2،000 x ج لمدة 2 ثانية لجمع السائل في الجزء السفلي.
  4. إضافة6 ميكرولتر Effectene كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. دوامة لمدة 2 ثانية، وتدور في 2،000 x ج لمدة 2 ثانية في microfuge لجمع السائل في الجزء السفلي. الانتظار لمدة 20 دقيقة للسماح لتشكيل المذيلات ترنسفكأيشن المعقدة.
  5. وسائل الإعلام نضح من البئر ليتم transfected. بلطف إضافة 0.8 مل من DMEM مع 10٪ FBS لترنسفكأيشن خليط كاشف ومزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا ببطء لتقليل كسر المذيلات. إضافة وسائل الإعلام وخليط ترنسفكأيشن إلى البئر ببطء شديد من الجانب. إضافة أي المتبقية خليط ترنسفكأيشن من أنبوب microcentrifuge إلى البئر باستخدام micropipettor.
    ملاحظة: اختياريا، إضافة اضافية 0.5 مل من DMEM مع 10٪ FBS إلى transfected جيدا لإعطاء خلايا التغذية الإضافية الناتجة في ترنسفكأيشن ألطف وأقل تعبير عابر.
  6. العودة الخلايا إلى 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 5 ساعة.
  7. نضح وسائل الإعلام التي تحتوي على خليط ترنسفكأيشن. استبدال مع 1 مل من DMEM مع 10٪ FBS. سماحالخلايا لتنمو بين عشية وضحاها.
  8. في اليوم التالي، وتمرير الخلايا لcoverslips غير المصقول، معقمة من قبل التعقيم.
    1. إضافة 0.5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 1 ملم EDTA إلى كل بئر. بدلا من ذلك، استخدم 0.5 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA. تترك في الحاضنة لمدة 1 دقيقة.
    2. وضع 3 جولة، معقمة coverslips 25 ملم في آبار منفصلة من لوحة 6 جيدا. ملء كل جيدا مع 2 مل من وسائل الإعلام. دفع برفق ساترة وصولا الى قاع البئر لمنع الخلايا من النمو على الجزء السفلي من ساترة.
    3. تستنهض الهمم يدويا البئر لرفع قبالة خلايا من قاع البئر. إضافة 1 مل من DMEM مع 10٪ FBS ل resuspend. توزيع الخلايا رفع من 1 بئر من لوحة 12 جيدا بالتساوي بين 3 coverslips. بدلا من ذلك، لوحة الخلايا على 3 أطباق ذات قاع زجاجي.
  9. تسمح للخلايا أن تنمو على لل coverslips لمدة 48 ساعة على الأقل قبل التصوير. تأكد من أن الخلايا تنتشر ومسطحة.

2.التصوير CCP والبضائع عن طريق ديناميات TIRFM

  1. المكورات M1 الأجسام المضادة لمكافحة FLAG مع الأصباغ اليكسا اليكسا فلور باستخدام عدة وصفها البروتين وفقا لبروتوكول تصنيع. بدلا من ذلك، يمكن شراؤها قبل الأجسام المضادة مترافق.
  2. قبل احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة في 1: 1،000 التخفيف في 1 مل من قبل تحسنت المتوسطة يبوفيتش مع 10٪ FBS، أو غروب MEM مع 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4 و 10٪ FBS لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية (التصوير المتوسطة)، لتسمية GPCRs الموسومة FLAG على سطح الخلية. تخطي هذه الخطوات إذا البروتينات الفلورية المرمزة وراثيا، مثل GFP، وتستخدم من العلامات (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل).
  3. نقل ساترة لغرفة التصوير الخلية الحية. بدلا من ذلك، لأطباق ذات القاع الزجاجي، نضح وسائل الإعلام الأجسام المضادة وضع العلامات وإضافة 700 ميكرولتر من قبل تحسنت المتوسطة التصوير.
    1. استخدام زوج من ملقط وثني غيض من إبرة قياس 25 إلى الخطاف.
    2. عقد زوج من ملقط في اليد المهيمنة. عقد الإبرة عازمة في أوراسكوم تليكوم القابضةإيه. تحويل الإبرة حتى منحنيات هوك أسفل نحو الزجاج. بلطف سحب الإبرة، والجانب هوك أسفل، عبر الجزء السفلي من لوحة 6 جيدا حتى السنانير على ساترة. الحرص على عدم خدش سطح ساترة، كما أنه سيتم فصل الخلايا. رفع بلطف صعودا ساترة من قاع البئر. موازنة ساترة ضد جدار البئر حصول على الدعم.
    3. استخدام ملقط لفهم قرب حافة ساترة ونقل الجانب الخلية ساترة إلى غرفة التصوير، وتجميع الغرفة. إضافة 700 ميكرولتر (أو كمية مناسبة) من قبل تحسنت المتوسطة التصوير. التعامل مع لل coverslips بعناية دون ضغوط لمنع تشقق أو كسر.
  4. نقل غرفة على المجهر والحفاظ على درجة حرارة الخلايا عند 37 درجة مئوية باستخدام سخان مرحلة أو حاضنة المغلقة.
  5. جعل الخلايا في التركيز باستخدام هدف النفط الغمر أو 100X 60X TIRF (NA 1.45 أو أعلى). صورة الخلايا في epifluorescence التقليدية أو يخدعوسائط الاتصال من الإضاءة (أي لا TIRFM) لتحديد الخلايا معربا عن يبني المناسبة. خارج نطاق التركيز خلايا غير مرئية تقريبا في عمق رقيقة من TIRF الإضاءة مما يجعل من الصعب العثور على طائرة الوصل والخلايا.
    ملاحظة: بعض أنظمة تستخدم نفس الليزر لTIRFM إلى الصورة في epifluorescence التقليدية، عن طريق تحريك زاوية السقوط ليزر فوق الزاوية الحرجة. باعتبارها قائي مهم، يكون دائما على بينة من زاوية شعاع الليزر، ودائما توجيهها بعيدا عن المراقب.
  6. التركيز وصولا الى السطح السفلي للخلية حتى التعبير عن الخطوط العريضة للغشاء البلازما حول الخلية يختفي ويظهر مركز الخلية. وهذا هو أكثر وضوحا مع غشاء البلازما بروتين البضائع المحلية مثل مستقبلات المواد الأفيونية μ (انظر الشكل 2A).
  7. التبديل إلى TIRF التصوير.
    1. إذا باستخدام نفس الليزر للتصوير في epifluorescence التقليدية، وزيادة زاوية السقوط للليزر حتى خارج التركيز مضان في داخل الخلية يختفي، ويعتبر أي مخطط من غشاء البلازما حول الخلية. (قارن الشكل 2C إلى أرقام 2A و 2B)
      ملاحظة: في TIRFM، والانتقال البؤري يسبب الصورة للذهاب تماما من التركيز و / أو قاتمة، ومستويات مضان الشاملة يتناقص نظرا لعمق أقل من الإضاءة. ولذلك، أسلوب بديل للتبديل إلى TIRFM الإضاءة هو التركيز الأول على مركز الخلية في epifluorescence مبائر / التقليدية، ثم زيادة زاوية السقوط حتى تفقد معظم مضان، ومن ثم التركيز وصولا الى غشاء البلازما.
    2. مرة واحدة في TIRFM، وضمان الليزر الإثارة يعكس مرة أخرى من خلال موضوعي وغير مرئية فوق الهدف. تأكيد هذا عن طريق فحص إذا كانت بقعة الليزر مرئيا.
      ملاحظة: في epifluorescence مبائر أو وسائط التقليدية، وإضاءة الليزر مرئيا فوق الهدف،مثل على السقف.
    3. صقل التركيز للحصول على صورة واضحة. المكونات الرئيسية لآلية التقامي، مثل بالكلاذرين، سوف تكون واضحة في نقاط و. ضبط التركيز على غرامة، وبالتالي فإن نقاط والجولة هي كما ممكن.
      ملاحظة: للحصول على البضائع المترجمة الغشاء، وضبط التركيز بشكل جيد حتى تظهر أرجل كاذبة خيطية متميزة.
    4. استخدام برنامج الاستحواذ على حفظ كافة المعلمات التصوير مثل المرايا وTIRF زاوية. نفعل ذلك لجميع الأطوال الموجية اللازمة.
  8. مسح حول ساترة للعثور على الخلايا معربا عن علامات التقامي المطلوب: مستقبلات μ-الأفيونية ومحول β-arrestin في المثال هو موضح في الشكل 3A. حدد الخلايا التي يتم التعبير لكن ليس على التعبير عن. انظر المناقشة للحصول على التفاصيل.
  9. مرة واحدة يتم تحديد خلايا، الحصول على صور كل 3 ثانية لمدة 10 دقيقة. هذا يكفي للقبض على عمر من CCP، لأن متوسط ​​عمر من CCP في HEK293 خلايا تصويرها في ظل هذه الظروف هو آرواوند 40 ثانية 10-11. هذا يسمح لحوالي 12-14 الأطر لمراقبة CCP. انظر على سبيل المثال فيلم 1. كرر جميع الخطوات لصورة خلايا إضافية.

3. تحليل ديناميات التقامي بواسطة التحقق اليدوي

على الرغم من التحقق اليدوي للأعمار CCP يقتصر إلى حد كبير على عدد من نقط التحكم الحرجة التي يمكن أن يتم الكشف عن، فإنه لا يزال وسيلة دقيقة للكشف دون أن يعترضها التغيرات العالمية في الصورة وكشف القطع الأثرية. انظر المناقشة للحصول على التفاصيل.

  1. فتح الملف في ImageJ. يتم تخزين الصور كما كومة واحدة من ملفات TIFF مع قنوات معشق. تحويل الصور إلى hyperstacks. اذهب إلى صورة> Hyperstacks> كومة إلى Hyperstack. أدخل عدد من القنوات المكتسب (أي إذا كان التصوير β-arrestin ومستقبلات المواد الأفيونية μ، أدخل 2)، أدخل 1 لZ كومة (TIRFM هو طائرة واحدة)، وعدد من الأطر من الفيلم (أي 10 دقيقة الفيلم في إطار كل ط 1 3 ثانيةق 200) في نافذة منبثقة.
  2. شكل hyperstack غلة نافذة مع اثنين من أشرطة التمرير. استخدام الشريط العلوي للتنقل عبر القنوات وأسفل للانتقال عبر الزمن. انتقل إلى القناة من البروتين الذي سوف يعاير عمر.
  3. الانتقال إلى تأطير 10 أو 15 من الفيلم للحد من إدراج نقط التحكم الحرجة الموجودة من قبل والتي تكون غير مرئية فترات بأكمله. رسم مربع ROI حول بقعة المختارة عشوائيا.
  4. حساب عدد من الأطر بقعة مرئيا.
    ملاحظة: انظر الشكل 3B و 3C للحصول على أمثلة من ثلاث فئات شكلية من الأحداث التقامي 10،11،16-19.

4. تحليل ديناميات التقامي بواسطة الاعتراف الهدف

اعتراف موضوعي يسمح الكشف عن تقريبا كل من نقط التحكم الحرجة تصوير في زنزانة، ولكن يمكن أن يكون عرضة للخطأ بسبب الكشف زائفة هياكل خاطئة. انظر المناقشة للحصول على تفاصيل الموازنة بين مزايا وعيوب البريدطريقة منظمة العمل ضد الجوع. العديد من البرامج، بما في ذلك الخوارزميات مبنية خصيصا، يمكن استخدامها للكشف عن بموضوعية نقط التحكم الحرجة. يصف هذا البروتوكول الاعتراف الموضوعي للنقط التحكم الحرجة باستخدام Imaris، وهو برنامج تحليل صورة (انظر المواد).

  1. للبدء، افتح ملف الصورة الخام في صورة برامج التحليل. افتراضيا، تظهر صورة ملونة المدمجة. استخدام إطار "عرض تعديل" لضبط سطوع قناة. انقر على اسم قناة لتغيير لون المعروض. قم بإلغاء تحديد المربع الموجود بجوار القناة لمنع عرض لها (انظر الشكل 4A).
  2. خلق "النقاط" من خلال النقر على أيقونة مع بقع برتقالية. انظر الشكل 4B. تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) حول الخلية. انظر الشكل 4C. استخدام العائد على الاستثمار لاستبعاد المناطق التي سيتم الكشف عن الحواف الأمامية المشرقة واللوحات بشكل غير صحيح. تحليل خلايا متعددة مع مستويات التعبير المختلفة بشكل منفصل.
  3. قياس قطرها من بقعة إلى ال Øالتقديرات الأولية لدي الخوارزمية. التبديل إلى وضع "شريحة"، وانقر على طرفي القطبية من بقعة لقياس قطرها. انظر الشكل 4E. القيام بذلك لمدة 4 أو 5 البقع الجولة التي تبدو يدل على CCP في ذروة استقرارها، بعد تشكيل وقبل انفصال. تستخدم هذه القياسات لحساب متوسط ​​قطرها إلى أقرب عشر من ميكرون.
  4. كشف البقع. عودة إلى وضع "فق". اختيار القناة المناسبة للكشف. أدخل متوسط ​​قطرها قياسه، عادة 0.3 أو 0.4 ميكرون. انقر فوق السهم إلى الأمام الزرقاء لتحديد المواقع. انظر الشكل 4E. إذا تم التقليل قطر البقع، وسيتم تحديد نقاط زائفة من مضان على شكل بقع. إذا كان القطر كبير جدا، سيتم تجاهل البقع الحقيقية. عندما لم تكن متأكدا، تقدير أقل قليلا، وتصفية المكتشفة غير صحيحة في وقت لاحق.
  5. تصفية البقع من الجودة. ضبط مرشح لالتقاط أكبر عدد ممكن من النقاط ممكن دون العودةالأرض. يتم تحديد مرشح الجودة افتراضيا 20. انظر الشكل 4F.
    1. استخدام "الجودة" منحنى كدليل لوضع عتبة المناسبة. نقل العتبة السفلية للمرشح مع زر الماوس الأيسر لهذا الانخفاض الأول في المنحنى. هذا هو نقطة انطلاق جيدة لمرشح، وهذا الموقف عادة بتكرير لكشف البقع المرئية فقط. انظر الشكل 4F.
    2. تظهر بقع الكشف على الفيلم والمجالات أو مركز بكسل. باستخدام "ألوان" علامة التبويب، وضبط لون البقع للون مغاير لجعله أسهل لرؤيتهم. التمرير من خلال فيلم لمراجعة البقع في كل إطار. الهدف هو الكشف عن العديد من البقع ممكن لمجمل حياتهم.
    3. إزالة البقع باهتة أو يدويا ربطها في المسارات مستمرة في وقت لاحق، كما لم يتم الكشف عنها بشكل جيد من خلال مسار حياتهم.
    4. إزالة لوحات مشرقة مع "كثافة" فيلثالثا، إذا لزم الأمر. انقر فوق علامة الجمع الأخضر لإضافة فلتر جديد. انظر الشكل 4F. إنشاء فلتر لتصفية الكثافة داخل أو خارج البقع من إشارات مضان معين. استخدام منحنى الكثافة ولدت، (مماثلة لجودة المنحنى مناقشتها في 4.5) لتعيين العتبة. استخدم زر الماوس الأيسر لإزالة نهاية اليسار المتطرف المنحنى الذي يمثل ألمع البقع.
      ملاحظة: الهياكل وحة كبيرة وعادة ما تكون بين ألمع العناصر في الخلية، ويتم استبعادها بسهولة أنهم مع هذا الفلتر.
    5. التمرير من خلال الفيلم لضمان اكتشاف نقط التحكم الحرجة كبقع ولم يعد يتم الكشف ألمع ويحات. يبين الشكل 3D خلية حيث كشف نقط التحكم الحرجة (الرمز بواسطة المجالات البيضاء) تم الأمثل مع فلتر الجودة واستبعدت لويحات مع نوعية التصفية.
    6. تقليل الحواف خلية مشرقة مع مرشح الجودة. قد لا تزال بحاجة أجسام لامعة لإزالتها يدويا، في الخطوة التالية. تواصل مع الأزرقالسهم.
    7. إزالة البقع الشاذة في شاشة تحرير البقع. التحول إلى "حدد" واسطة. انقر على الفور. وسوف تتحول الصفراء. انقر على "حذف". انقر على السهم الأزرق لمواصلة بناء الخوارزمية. انظر الشكل 4G.
  6. مسارات التدبير. تحديد المسارات ل"الحركة البراونية". وCCP يجب أن لا تظهر أي حركة موجهة، فقط الحد الأدنى من الانجراف عبر غشاء البلازما. هذه الخوارزمية هي الأنسب لهذا الاقتراح. انظر الشكل 4H.
    1. تعيين المسافة القصوى إلى قيمة صغيرة مثل 0.7 ميكرون. انظر الشكل 4H.
      ملاحظة: وضع مسافة صغيرة يقلل من البقع اتصال المجاورة والتي لا تزال تسمح لاستمرار تتبع مكان الخلية من خلال CCP أو حركة الخلية.
    2. تعيين ماكس الفجوة الحجم إلى 1. هذا يسمح مسار لمواصلة إذا كان هناك واحد فقط في عداد المفقودين في إطار الخلافة. انقر على السهم الأزرق لحساب المسارات. انظر الشكل 4H.
      ملاحظة: Gأحجام ا ف ب أكثر من 3 أسباب مسارات مختلفة ليتم ربطها معا بشكل غير صحيح.
    3. التبديل إلى عرض المسار "التنين الذيل." انتقل من خلال فيلم مراقبة الجودة الكشف. إذا أن يكون متصلا البقع المجاورة، تقليل المسافة القصوى أقل من 0.7 ميكرون. إذا كان يتم كسر البقع تصل بسهولة جدا، وزيادة الفجوة ماكس الحجم. انقر على السهم الأزرق لخلق المسارات. هذا يؤدي إلى الشاشة المسارات التصفية. انظر الشكل 4H.
  7. مرشح المسارات وتصدير البيانات. استخدام "كثافة" فلتر لإزالة اللويحات مشرقة إضافية. استخدام "إزاحة" فلتر لإزالة الإندوسومات التي تدخل مجال TIRF. توخي الحذر، والبقع أطول وسيكون نزوح أطول أيضا. انقر فوق السهم المزدوج الأخضر لإتمام البروتوكول. انظر الشكل 4I.
    1. استخدم علامة التبويب تحرير المسارات، مع رمز قلم رصاص، لإزالة المكتشفة إيجابية كاذبة من المسارات التي لا يمكن إزالتها عن طريق المرشحات. التحقق من وجود discontinuities أو اتصالات كاذبة. للاتصال مسارين، حدد لهم باستخدام السيطرة اليسار انقر، ثم انقر على "الاتصال" في مربع تحرير المسارات. لقطع المسارات الى بقع منفصلة، ​​حدد المسار وضرب "قطع الاتصال". تحديد البقع متعددة مع السيطرة + اليسار انقر وانقر على "اتصال" لإنشاء المسار الجديد. والأسلوب هو نفسه بالنسبة البقع التحرير، وصفها في 4.5.7. انظر الشكل 4J.
    2. تصدير البيانات، انتقل إلى علامة التبويب الإحصائيات. انقر على أيقونة قرص مرن واحد لتصدير الإحصائية المختارة. انقر على الأيقونة التي تشبه سلسلة من الأقراص المرنة لتصدير جميع الإحصاءات. "المسار المدة" إحصائية تحتوي على طول المسارات التقامي. انظر الشكل 4K.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام الخلية الحية TIRF المجهر سجلنا ديناميات التقامي للμ مستقبلات المواد الأفيونية (MOR)، ومستقبلات البروتين يقترن G-(GPCR) ولها التقامي البروتين محول β-arrestin. تم transfected في بناء β-arrestin عابر في خط خلية MOR التعبير عن ثابت باستخدام بروتوكول المبين في الشكل 1، وتصوير 96 ساعة في وقت لاحق. وMOR في خط الخلية مستقرة هو N-عضال الموسومة مع GFP الحساسة الرقم الهيدروجيني. هذا بروتين فلوري تتفلور فقط في السائل خارج الخلية محايد. أيضا، وMOR endocytoses تنشيط مر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن هنا وصف استخدام TIRFM لتصور بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME) على مستوى الأفراد نقط التحكم الحرجة في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي. CME هو الحدث السريع والديناميكي للغاية بوساطة الأثر التراكمي لأحداث فردية العديد مكانيا وزمانيا منفصلة. معظم المقايسات التي يتم استخدامها حاليا، مثل القياسات البيوكيميائية لتدخيل باستخدام biotinylation السطح أو يجند ملزم، التدفق الخلوي أو خلايا ثابتة فحوصات قياس كمية البروتينات المنضوية، أو الإلكترون المجهري التعريب من البروتينات، ورصد التغيرات في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة C. Szalinski و H. Teng و M. Bruchez للمساعدة في Imaris و R. Vistein و D. Shiwarski على المساعدة الفنية والمشورة ، والدكتور M von Zastrow ، والدكتور T Kirchhausen ، والدكتور D Drubin ، والدكتور W Almers على الكواشف والمناقشة المفيدة. NS007433 التمويل المقدم من منحة T32 إلى SLB و NIH DA024698 و DA036086 إلى MAP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM / ارتفاع الجلوكوز مع L-الجلوتامين وبيروفات الصوديومفيشر Scientific   ؛SH3024301
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ، خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيومGibco ، من Life Technologies21600-010
EDTA Free AcidAmresco0322-500G
مصل الأبقار الجنينيGibco ، بواسطة Life Technologies10437-028
Leibovitz's L-15 Medium ، بدون فينول أحمرGibco ، بواسطة Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco ، من Life Technologies
HEPESCellPURE by Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425كاشف النفقة
25 مم غطاءزجاجي فيشر ساينتفيك12-545-86
قوارير معالجة بزراعة خلايا كورنينج ، 25 سم 2< / sup>فيشر Scientific10-126-28
ثقافة الخلايا 6 آبار لوحةGreiner Bio-One ، بواسطة VWR82050-896
أحادي النسيلة ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG
[D-Ala2< / sup> ، N-Me-Phe 4< / sup> ، Gly5< / sup>-ol] - ملح أسيتات Enkephalin (DAMGO)مجموعةملصقات
Alexa Fluor 647Life TechnologiesA20173
ImageJ NIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris برنامج تحليل الصورBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris ، للتحليل الآلي
Nikon Eclipse Ti المجهر المقلوب والملحقات المطلوبة بما في ذلك مكعبات المرشح والمرشحاتنيكون
ذراع TIRF مع المحولات المطلوبة ل نيكون كسوف Tiنيكونلضبط زاوية الحدوث
iXon + EMCCD الكاميرا والمحولاتAndor
البروتين Sigma Aldrich E7384-5MG نيكون

المراجع

  1. McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
  3. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
  4. Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
  5. Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
  6. Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
  7. Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
  8. Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
  9. Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
  10. Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
  11. Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
  12. Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
  13. Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
  14. Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
  15. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
  16. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
  17. Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
  18. Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
  19. Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
  20. Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  21. Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
  24. Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
  25. Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
  26. Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
  27. Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
  28. Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
  29. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
  30. Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تصور الإلتقام بالكلاذرين بوساطة من G مستقبلات البروتين يقترن قرار واحد في الحدث عبر الميكروسكوب TIRF
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.