مقالة منهجية

المثانة العضلات الملساء قطاع انقباض كوسيلة لتقييم المسالك البولية السفلى الصيدلة

DOI:

10.3791/51807

⸱

أغسطس 18, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المخطوطة بسيطة، لكنها قوية، في طريقة المختبر لتقييم انقباض العضلات الملساء ردا على وكلاء الدوائية أو تحفيز العصب. التطبيقات الرئيسية هي فحص المخدرات والأنسجة علم وظائف الأعضاء فهم، والصيدلة، وعلم الأمراض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا طريقة في المختبر لقياس المثانة انقباض العضلات الملساء، واستخدامه للتحقيق في الخصائص الفسيولوجية والدوائية من العضلات الملساء وكذلك التغيرات الناجمة عن الأمراض. وهذه الطريقة توفر المعلومات الهامة لفهم وظيفة المثانة في حين التغلب على الصعوبات المنهجية الرئيسية التي تعترض في التجارب المجراة، مثل التلاعب الجراحية والدوائية التي تؤثر على الاستقرار والبقاء للاستعدادات، واستخدام الأنسجة البشرية، و / أو استخدام المواد الكيميائية باهظة الثمن. كما يوفر وسيلة لتحقيق خصائص كل مكون المثانة (أي العضلات الملساء، الغشاء المخاطي، والأعصاب) في ظروف صحية ومرضية.

تتم إزالة المثانة البولية من حيوان تخدير، وضعت في حل كريبس ومقطعة إلى شرائح. توضع شرائح في غرفة مليئة حل كريبس الدافئ. ويرد أحد طرفيه إلى التوتر السطحي متساوي القياسن محول لقياس قوة الانكماش، ويرد الطرف الآخر إلى قضيب ثابت. يتم تحفيز الأنسجة بإضافة مركبات مباشرة إلى الحمام أو عن طريق الأقطاب الكهربائية التحفيز المجال التي تنشط الأعصاب، مشابهة لاثار تقلصات المثانة في الجسم الحي. نحن لشرح استخدام هذا الأسلوب لتقييم عفوية انقباض العضلات الملساء خلال التنمية وبعد إصابة الحبل الشوكي التجريبية، وطبيعة العصبي (أجهزة الإرسال ومستقبلات المعنية)، العوامل التي تدخل في تعديل نشاط العضلات الملساء، ودور المكونات الفردية المثانة، والأنواع والاختلاف الجهاز ردا على وكلاء الدوائية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامها للتحقيق في مسارات الخلايا المشاركة في الانكماش و / أو الاسترخاء في العضلات الملساء، والعلاقات هيكل النشاط المخدرات وتقييم الافراج الارسال.

وقد استخدم في المختبر السلس طريقة انقباض العضلات على نطاق واسع FOص أكثر من 50 عاما، وقدمت البيانات التي ساهمت بشكل كبير في فهمنا وظيفة المثانة وكذلك لتطوير المستحضرات الصيدلانية من المركبات المستخدمة حاليا سريريا لإدارة المثانة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرتاح العضلات الملساء للسماح المثانة تخزين البول، والعقود للحصول القضاء البول. وبوساطة من الاسترخاء الجوهرية خصائص العضلات الملساء والافراج منشط بافراز (NE) من الأعصاب متعاطفة، والذي ينشط مستقبلات بيتا الأدرينالية (β 3 AR في الإنسان) في النافصة. ويتحقق عن طريق تثبيط يفرغ مدخلات متعاطف وتفعيل الأعصاب الحركية التي تطلق أدن تشافيز / ATP للتعاقد المثانة العضلات الملساء 1. العديد من الحالات المرضية، بما في ذلك الدماغ و / أو إصابة الحبل الشوكي والأمراض العصبية، مرض السكري، وانسداد مخرج المثانة أو التهاب المثانة الخلالي، يمكن أن يغير بشكل عميق وظيفة المثانة، مع تأثير شديد على نوعية حياة المريض 2. هذه الظروف تغير انقباض العضلات الملساء التي تؤثر على واحد أو أكثر من مكونات المثانة: العضلات الملساء، وارد أو أعصاب صادرة و / أوالغشاء المخاطي.

عدة في الجسم الحي وطرق المختبر لدراسة وظيفة المثانة وضعت. في الجسم الحي، قياس المثانة هو القياس الأساسي من وظيفة المثانة. وإن كان هذا هو إعداد سليمة تسمح جمع المعلومات تحت بالقرب من الظروف الفسيولوجية، هناك عدد من الظروف التي يفضل استخدام شرائط العضلات الملساء. وتشمل هذه الحالات عندما الجراحية و / أو التلاعب الدوائية شأنه أن يؤثر على بقاء واستقرار إعداد في الجسم الحي، أو عندما تتطلب الدراسات استخدام الأنسجة البشرية أو المواد الكيميائية باهظة الثمن. هذه الطريقة تسهل أيضا دراسة آثار المخدرات والعمر وعلم الأمراض في كل مكون من المثانة، أي العضلات الملساء، الغشاء المخاطي، وارد والأعصاب صادرة.

وقد استخدمت شرائط المثانة على مر السنين العديد من المجموعات للإجابة على عدد من الأسئلة العلمية. كانت تستخدم لإيفاالتغييرات luate في النشاط العفوي عضلي الناجمة عن الأمراض. ويعتقد أن هذا النشاط إلى المساهمة في الاستعجال والتردد أعراض فرط نشاط المثانة (OAB)، وبالتالي فهي هدف للمخدرات التي يجري تطويرها لOAB 3-9. استخدمت شرائط المثانة أيضا للتحقيق في العوامل المنشأ العضلي والعصبية التي تعدل نبرة العضلات الملساء بهدف اكتشاف القنوات الأيونية و / أو مستقبلات و / أو المسارات داخل الخلايا التي يمكن أن تكون مستهدفة للحث إما الاسترخاء أو تقلص العضلات الملساء 3،10- 13. وقد ركزت دراسات أخرى على طبيعة العصبي، بما في ذلك أجهزة الإرسال ومستقبلات المعنية والتغيرات الناجمة عن أمراض 14،15. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام أسلوب المقارنات بين الأنسجة من مختلف الأنواع 16- 18، بين الأجهزة 19-21، وتقييم العلاقات المخدرات هيكل النشاط 22-24. وقد استخدم امتدادا لهذا الأسلوب لقياس آثافةالبريد تأثير المخدرات على الإفراج الارسال من أعصاب صادرة 25. وعلاوة على ذلك، مجموعة متنوعة من الأنسجة (المثانة ومجرى البول والجهاز الهضمي، GI) تحصد من الحيوانات أو البشر (من العمليات الجراحية أو الأنسجة المانحة الجهاز وافق لأبحاث) ومن مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية بما في ذلك إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي)، منفذ المثانة العرقلة (BOO)، أو التهاب المثانة الخلالي (IC) يمكن التحقيق باستخدام هذه التقنية.

نحن في هذه الورقة توضيح استخدام هذه الطريقة مع البروتوكولات التجريبية اللازمة، لمعالجة العديد من المسائل العلمية المذكورة أعلاه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة هنا من قبل لجنة IACUC في جامعة بيتسبرغ.

1. حلول

  1. إعداد الحل كريبس بحسب وصفه. تكوين في ملي: 118 كلوريد الصوديوم، بوكل 4.7، 1.9 CaCl 2، MgSO 4 1.2، NaHCO 3 24.9، KH 2 PO 4 1.2، سكر العنب 11.7.
  2. تهوية كريبس مع 95٪ O 2، 5٪ CO 2 ووضعه في حمام الماء 37 درجة مئوية ليتم استخدامها في كافة مراحل التجربة. ضع جانبا ~ 200 مل من محلول كريبس الهوائية في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها في تشريح الأنسجة.
  3. قياس الرقم الهيدروجيني (~ 7.4) والأسمولية (~ 300 الميلي أسمول) من الخلوية كريبس.

2. التجريبية مجموعة المتابعة (تخطيطي الشكل 1A)

  1. ملء الغازي (95٪ O 2، 5٪ CO 2) غرف مع 10 مل كريبس.
  2. بدء ضخ المياه المنتشرة لتسخين الدوائر إلى 37 درجة مئوية؛ تشغيل المعدات اللازمة: مكبر للصوت (ق)، مشجعا (ق) وتسجيل البرامج.
  3. معايرة محولات مع 1 غرام من الوزن.

3. الأنسجة (الشكل 1B)

إزالة المثانة من شخص بالغ السذاجة أنثى سبراج داولي الفئران (200-250 غرام؛ ~ 10-12 أسابيع من العمر) باتباع الخطوات التالية:

  1. إعداد منطقة تشريح والأدوات اللازمة: ماكينة حلاقة كهربائية، مع ملقط الأسنان، شفرة مشرط، مقص تشريح، microscissors، وهما ملقط تشريح (الكتاب تفضل دومون ملقط 3 #)، ومقاطع الأنسجة (أو خياطة الحرير)، طبق تشريح Sylgard المغلفة مع كريبس و دبابيس تشريح الأنسجة.
  2. تخدير الحيوانات مع استنشاق الأيزوفلورين (4٪ في O 2) في غرفة الاستقراء. استخدام مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. باستمرار رصد مستوى التخدير من خلال مراقبة معدل التنفس، والاستجابة للمؤثرات الخارجية، وفقدان أطرافهم الخلفية سحب المنعكس.
  3. عندما يتم تخدير الحيوان حلق في أسفل البطنالجرمية. فضح أجهزة الحوض عن طريق شق البطن خط الوسط. التعرف على المثانة ومجرى البول. إزالة المثانة عن طريق قطع عند عنق المثانة قريبة من مجرى البول القريبة. وضع الأنسجة فورا في طبق المغلفة Sylgard مليئة حل كريبس الهوائية.
  4. إذا لزم الأمر، وإزالة النسيج إضافية في هذا الوقت: مجرى البول، قطعة من الجهاز الهضمي (GI) الجهاز و / أو البروستاتا، الخ
  5. التضحية الحيوانية باستخدام طرق IACUC الموافقة (على سبيل المثال، جرعة زائدة من مخدر أو CO 2 اختناق يليها طريقة الثانوي).
  6. إدراج دبابيس تشريح الأنسجة من خلال قبة المثانة والعنق، والحالب، لاستقرار الأنسجة لمزيد من تشريح. لا تمتد الأنسجة. إزالة الدهون، والنسيج الضام، الاحليل الداني، والحالب إذا كان موجودا.
  7. فتح المثانة من القاعدة إلى قبة لإنشاء ورقة مسطحة، المصلية الجانب أسفل / الجانب اللمعية يصل (الشكل 1B). وضع دبابيس تشريح في كل ركن من الأنسجة. إزالة المثانة دومه والأنسجة الرقبة.
  8. إذا كان الغرض من التجربة هو تحديد مساهمة المخاطية (الظهارة البولية والصفيحة المخصوصة - انظر الرسم البياني الشكل 1C) إلى تقلص العضلات على نحو سلس، مقارنة خصائص شرائط النافصة مع وبدون الغشاء المخاطي المرفقة. لهذا، قبل قطع الأنسجة في الشرائط، وإزالة بعناية الطبقة المخاطية باستخدام مقص القزحية الربيع وملقط غرامة تحت المجهر تشريح. في نهاية التجربة، وتحديد شرائح للH & E تلطيخ لتأكيد الإزالة الكاملة من الغشاء المخاطي. لاحظ أن هذا الإجراء هو أسهل في الماوس المثانة في المثانة من الفئران.
  9. قطع النسيج طوليا من القاعدة إلى قبة إلى شرائح من ~ 2 × 8 مم (الشكل 1B). ربطة عنق أو إرفاق مقطع الأنسجة لطرفي كل شريط.
    وعادة ما يمكن أن تقطع إحدى المثانة الفئران إلى 4 شرائح ولكن عدد من الشرائط يمكن أن تزيد أو تنقص تبعا لحجم الحيوان / المثانة: ملاحظة.
  10. نقل شرائط للEXPERغرف imental. إرفاق واحدة من نهاية كل قطاع لمحول القوة، الذي يقيس تقلص الأنسجة، والآخر إلى ثابت قضيب الزجاج / المعادن.
    ملاحظة: غرف الأنسجة تختلف في الحجم (0.2 مل إلى 20 مل أو أكبر). غرف نموذجية لقربة القوارض هي 5-20 مل، والتي توفر ارتفاع كاف للشرائط ليكون المغمورة تماما في الحل. بعض الغرف تأتي مع المدمج في أقطاب التحفيز، والبعض الآخر لا. ينبغي توخي الحذر لضمان أن كافة الاتصالات من الأقطاب الكهربائية هي في حالة جيدة، وإلا التحفيز مجال كهربائي ليست مضمونة.
  11. تطبيق كمية محددة من القوة لكل قطاع التي تمتد بلطف الأنسجة حتى يصل التوتر الأساسي 1 جم (10 مليون). في البداية الأنسجة تميل إلى الاسترخاء التي يتم تسجيلها وانخفاض في التوتر الأساسي. الأنسجة غسل تقريبا كل 15 دقيقة باستخدام الهوائية الدافئة كريبس وضبط التوتر الأساسي إلى 1 غرام بعد كل غسل. تسمح الأنسجة لكي تتوازن ل~ 1-2 ساعة أو حتى التوتر الأساسي هو مستقر (أي لا مزيد من الاسترخاء الأنسجة).
  12. يتم التوصل إلى اختبار قابلية الأنسجة بإضافة بوكل (80 ملم) مباشرة إلى الحمام ل~ 5 دقائق، أو حتى استجابة الهضبة. ويمكن أيضا الردود على تركيزات عالية من بوكل أن يتكرر خلال التجربة أو في نهاية التجربة وتستخدم لتطبيع الردود على أدوية أخرى أو بين شرائح (انظر التطبيع تحت قسم تحليل البيانات).
  13. الأنسجة غسل عدة مرات (3-5x) مع كريبس الهوائية الدافئة للسماح للأنسجة بالعودة إلى ظروف ما قبل المعالجة.

4. تحفيز البروتوكولات

  1. للتحقيق في الآثار علم الأمراض على نشاط عضلي عفوية أو العضلات الملساء، استخدم شرائط العضلات الملساء من نماذج حيوانية مختلفة مثل اصابات النخاع الشوكي، BOO، أو حديثي الولادة. الشكل 2 يوضح استخدام هذا الأسلوب لتحقيق تغييرات في المثانة النشاط العفوي خلال تطوير و بعد اصابات النخاع الشوكي. بالإضافة إلى ذلك، وكلاء الدوائية يمكن استخدامها لتعديل ليرة سوريةالنشاط ontaneous. يوضح الشكل (3) تأثير جهري قناة KCNQ، flupirtine وXE991، على النشاط العفوي ونبرة العضلات الملساء.
  2. لتنشيط العضلات الدوائية بناء منحنيات استجابة سلسة تركيز بإضافة مركبات من الحلول الأسهم المركزة مباشرة إلى الحمام في فترات زمنية محددة. استخدام المخدرات والسيارة في شرائط متوازية لحساب السيارة والوقت الآثار.
    1. جعل الحلول الأسهم من المركبات المطلوبة في اختبار 1000X تركيز العمل النهائي. لكرباكول (لجنة التنسيق)، ومستقبلات المسكارينية ناهض، وإعداد الأسهم التالية: 10 -5 M، 3 × 10 -5 M، 10 -4 M، 3 × 10 -4 M، 10 -3 M، 3 × 10 -3 M 10 -2 م. تركيزات النهائي في الحمام هي 10 -8 M إلى 10 -5 M (أرقام 4C، D). لneuromedin B (NMB)، والنوع الفرعي 1 بومبيزين مستقبلات ناهض، وإعداد الأسهم التالية: 10 -8 M، 10 -7M، 10 -6 M، 10 -5 M، 10 -4 M، 10 -3 M وتركيزات النهائية في الحمام هي 10 -11 M إلى 10 -6 م. ومن المتوقع أن تزيد انقباض الأنسجة كلا من لجنة التنسيق وNMB.
    2. لحمام الأنسجة 10 مل، إضافة 10 ميكرولتر من كل محلول المخزون جنة التنسيق حالما تصل إلى استجابة هضبة (الشكل 4C، D). في شرائط متوازية إضافة كميات متساوية من السيارة (الماء). وبالمثل، إضافة 10 ميكرولتر من كل حل neuromedin الأسهم B ~ كل 5 دقائق.
      ملاحظة: لاحظ تأثير مثير للNMB وCCH على العضلات الملساء في شرائط من نوع مختلف في الشكل 4.
    3. التحقيق في خصائص ارتخاء العضلات الملساء في الأنسجة ما قبل التعاقد مع وكيل مثير، عادة لجنة التنسيق أو بوكل.
    4. لمنع استجابة ناهض، يمهد للمعالجة الأنسجة لمدة 10-20 دقيقة مع خصم للسماح اختراق الأنسجة، قبل ناهض التحفيز.
  3. لSTIM العصبيةulation من العضلات الملساء، وتسمى أيضا تحفيز الحقل الكهربائي (EFS) اتبع الخطوات من 1 حتي 3،13 والاستمرار كما هو موضح أدناه. والمقصود EFS لتنشيط الأعصاب انتقائي مقابل العضلات الملساء. المعلمات لتحفيز يجب اختيارها بعناية لتجنب تحفيز العضلات الملساء المباشر.
    1. إنشاء المعلمات التحفيز: نوع من التحفيز (البقول واحدة أو القطارات)، والمدة (مدة النبضة ومدة القطار)، وتواتر وشدة، كما هو موضح في الخطوات التالية ويتضح في أرقام 5A، B.
      1. لتحفيز نبض واحد، تعيين مدة النبضة، فاصل بين التحفيز وعدد من المحفزات المطلوبة. المعلمات المعتادة مدة التحفيز هي واحدة من البقول ،05-0،3 مدة ميللي ثانية تسليمها على فترات المطلوب (الشكل 5A). اتبع الخطوة 4.3.1.4 لكثافة التحفيز.
      2. لتحفيز القطار، وتعيين المدة الفاصلة القطار والقطار أمور. و3-10 ثانية سلمت القيم النموذجية للأنسجة المثانة لا يقل عن 1 مفي ما عدا (الشكل 5B). في حال حدوث التعب الأنسجة (أي EFS تقلصات تنخفض خلال فترة الرقابة)، وزيادة الفترة الفاصلة بين القطار.
      3. إنشاء تواتر المحفزات القطار (عدد النبضات في قطار - الشكل 5B). تشغيل منحنى استجابة التردد تتراوح 0،5 حتي 50 هرتز. ترددات نموذجية لالمثانة هي 10-20 هرتز، والتي تعطي تقلصات متكررة ومستقرة بوساطة ATP وأدن تشافيز. مراقبة استجابات تعتمد تردد لتحفيز EFS في شرائط الماوس المثانة في الشكل 5 يظهر كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم مساهمة الكوليني وآليات purinergic إلى العصبي.
      4. إنشاء شدة التحفيز: زيادة منهجية كثافة (جهد) من التحفيز حتى اتساع انكماش تصل إلى الهضبة (في حال استخدام قطارات تبقي ثابت التردد).
      5. تعيين شدة التحفيز اعتمادا علىتهدف التجربة. إذا كان الهدف هو زيادة تقلصات-أثار العصبي، ثم استخدم كثافة submaximal ان هذه السعة من الانكماش هي ~ 50٪ من انكماش القصوى. إذا كان الهدف هو تقليل تقلصات-أثار العصبي، ثم تعيين كثافة إلى ~ 80٪ من السعة القصوى لتجنب التعب الأنسجة.
    2. مرة واحدة يتم وضع المعلمات التحفيز (مدة وتواتر وشدة)، تسمح ~ 20-30 دقيقة لEFS- أثار تقلصات لتحقيق الاستقرار قبل الاختبار المخدرات.
      ملاحظة: للتحقق من الانتقائية في EFS لنقل العصبي، كتلة الإرسال العصبي مع حاصرات قنوات الصوديوم، سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 0.5-1 ميكرومتر). تنفيذ هذه الخطوة في بداية التجربة، كما TTX يغسل من السهل نسبيا. وبالإضافة إلى ذلك، نفذ هذا في نهاية التجربة (راجع الخطوة 4.3.5. أدناه).
    3. إعداد الحلول الأسهم في 1،000x تركيزات العمل النهائية ل: ألفا، بيتا الميثيلين ATP (ABMA، مستقبلات المنشط purinergicوdesensitizer) 10 -2 M، الأتروبين (أ مستقبلات المسكارينية) 10 -3 M (الشكل 5C). نلاحظ أمثلة أخرى في الشكل 6. و5HT4 مستقبلات ناهض، سيسابريد (3 × 10 -6 M، 10 -6 M، 3 × 10 -5 M، M 10 -5، 3 × 10 -4 M، 10 -4 M، 3 × 10 -3 M، 10 -3 M)، ويزيد من انقباض الأنسجة وSB-203186 (3 × 10 -3 M)، وهو 5HT4 مستقبلات، عكس آثار سيسابريد ل.
    4. لاختبار آثار ABMA والأتروبين على EFS (الشكل 5C)، نفذ اثنان السيطرة منحنيات استجابة التردد. إضافة 10 ميكرولتر من 10 -2 M ABMA إلى الحمام لتركيز النهائي من 10 ميكرومتر. وهذا التعاقد الأنسجة بسبب التحفيز المباشر للمستقبلات purinergic في العضلات الملساء. بعد عودة ردا على خط الأساس، كرر منحنيات استجابة التردد. إضافة 10 ميكرولتر من 10 -3 M الأتروبين لويركز النهائيايون من 1 ميكرومتر. ~ بعد 10 دقيقة (اللازمة لالأتروبين لمنع مستقبلات المسكارينية)، كرر منحنيات استجابة التردد. في شرائط متوازية إضافة 10 ميكرولتر من السيارة، والمياه، في كل خطوة.
      ملاحظة: للحصول على أمثلة أخرى في الشكل 6، إضافة 10 ميكرولتر من كل محلول المخزون سيسابريد على فترات محددة الوقت (~ كل 15 دقيقة، انظر المناقشة)، تليها 10 ميكرولتر من SB-203186 حل الأسهم مباشرة إلى الحمام ورصد تأثيرها على EFS الناجم عن الانكماش. في شرائط متوازية إضافة 10 ميكرولتر من السيارة، DMSO. رصد آثار سيسابريد، ناهض مستقبلات 5HT4، على تقلصات EFS أثار في المثانة والأنسجة البشرية الدقاق في الشكل 6. بالإضافة إلى ذلك، يلاحظ تأثير DMSO، وسيلة لسيسابريد، على EFS-أثار تقلصات في المثانة والأنسجة البشرية الدقاق .
    5. في نهاية البروتوكول EFS التحقق من الانتقائية EFS من خلال منع انتقال العصبي مع حاصرات قنوات الصوديوم، سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 0.5-1 و# 181، M). إذا TTX تقلصات المقاومة لا تزال موجودة، فمن المستحسن لضبط مدة وشدة التحفيز في التجارب اللاحقة.
  4. لتحديد آثار المخدرات على مواقع ما قبل أو ما بعد متشابك (الشكل 7A) اتبع الخطوات من 1 إلى 4.3.2. إنشاء استجابات استنساخه لكرباكول وEFS، ثم يضاف اكس المخدرات
  5. في نهاية التجربة، قم بفك أو فك الشرائط، وصمة عار لهم بلطف على قطعة من المناديل الورقية لإزالة السوائل الزائدة وقياس الوزن كل قطاع باستخدام التوازن. أيضا قياس طول الأنسجة باستخدام الفرجار لتحديد مساحة المقطع العرضي. وتستخدم هذه المعلومات لتطبيع البيانات (انظر القسم 5.4).

تحليل البيانات 5.

تحليل البيانات باستخدام برنامج الكافي (على سبيل المثال، Windaq، LabChart).

  1. عن النشاط العفوي، حدد نافذة لا تقل عن 30 ثانية قبل و في ذروة الاستجابة المخدرات التي يسببها لي وASURE اتساع وتيرة النشاط عضلي (الشكل 3).
    1. استخدام تحليل سريع لتحديد تحويل فورييه طيف الترددات المساهمة في مقلص الردود وإذا كانت هناك اختلافات بين أجزاء مختلفة من المثانة (على سبيل المثال، مقابل قبة الرقبة) أو مع التنمية، علم الأمراض، والأدوية 8.
  2. للآثار على العضلات الملساء تحديد نافذة من 10-30 ثانية على الأقل قبل وفي ذروة الاستجابة المخدرات التي يسببها وقياس السعة من الانكماش.
  3. للآثار على تقلصات أثار العصبي، قياس السعة والمدة والمساحة تحت منحنى تقلصات (3 على الأقل) قبل وفي ذروة الاستجابة المخدرات التي يسببها.
    ملاحظة: من الضروري قياس كل من السعة والمساحة تحت المنحنى من تقلصات يسببها EFS لمكونات purinergic والكوليني لها حركية مختلفة. المكون purinergic سريع وعابر (ATP ينشط purinergiج ionotropic قنوات مثل P2X1 التي تسمح تدفق سريع للكالسيوم، ثم أنها توعي)، مما يسهم أكثر إلى الاستجابة ذروة السعة وأقل إلى المنطقة تحت المنحنى. المكون الكوليني أبطأ وتستمر (أدن تشافيز ينشط مستقبلات المسكارينية metabotropic، والتي تتطلب المزيد من الوقت لتنشيط مسارات الخلايا التي تنشط في النهاية القنوات الأيونية أن يزيل الاستقطاب العضلات الملساء للحث على انكماش). وبالتالي، يتم التقاط المكون المسكارينية أفضل من خلال قياس المساحة تحت المنحنى.
  4. تطبيع البيانات لتكون قادرة على مقارنة النتائج عبر شرائط والعلاجات الدوائية. لا ينبغي أن تتأثر المعلمة الذي تم اختياره لتطبيع من قبل مركبات الاختبار، الحالة المرضية المدروسة أو التصميم التجريبي. ومن بين هذه المعايير، الوزن استخدام الشريط، مساحة المقطع العرضي، والاستجابات بوكل (الشكل 4B)،٪ من الاستجابة القصوى (الشكل 7B) أو٪ من الاستجابة القصوى إلى وكيل مقلص آخر(على سبيل المثال، لجنة التنسيق) أو وكلاء الاسترخاء (على سبيل المثال، بابافيرين).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عفوية نشاط عضلي

عضلي النشاط العفوي هو سمة العضلات الملساء الهامة التي يخضع لتغيرات مع التنمية ما بعد الولادة 6-9 وعلم الأمراض (مثل اصابات النخاع الشوكي، BOO) 3-5. لأنه يعتقد هذا النشاط إلى المساهمة في أعراض فرط نشاط المثانة (OAB) 2، وتقييم المستقبلات، مسارات داخل الخلايا وكلاء الدوائية التي تعدل فيه، هو من مصلحة كبيرة لتطوير علاجات فعالة لOAB وغيرها من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة وصفنا بسيطة في المختبر السلس طريقة انقباض العضلات التي يمكن استخدامها لمعالجة عدد من المسائل العلمية المهمة المتعلقة المثانة علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض، وكذلك تساعد على اكتشاف أدوية جديدة لعلاج اختلالات المثانة. لقد يتضح استخدام هذه الطريقة لتقييم الخصائص التنموية والمرضية والدوائية من انقباض المثانة العضلات الملساء (الشكلان 2-4)، التشكيل العصبي (أرقام 5-7A)، فإن الاختلافات بين الأنواع (الشكل 4)، والاختل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة R37 R01 DK57284 DK54824 ومنح لLB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الحيواني < td colspan = "4" >< قوي > المواد والأدوات الجراحية< / قوي> كيت كينت طاقة محول الطاقة < td colspan = "4" >< قوي > مواد كيميائية < / قوي >

Equipment< / strong>
Tissue Bath System with ReservoirRadnoti، LLC159920حمامات الأنسجة المعزولة
مضخة إعادة تدوير الماء الدافئKent Scientific Corporation   ؛TPZ-749للحفاظ على حمامات الأنسجة إلى 37 &# 176; C
بيانات الكمبيوتر اكتساب نظامDataQ InstrumentsDI-710-UHلعرض وتسجيل وتحليل البيانات
محول الجسر مضخمالصوت World Precision InstrumentsSYS-TBM4Mمحول محول مضخم
للصوت محفز العشبتقنياتالعشب نموذج S88محفز
نظام التخديركينت المؤسسة العلمية ACV-1205Sلتخدير صندوق
التخديرجهاز هارفارد500116لتخدير أقنعة التخدير الحيوانية
شركةكينت العلمية   ؛AC-09508لتخدير
سيلجاردداو كورنينج كورب184 SIL ELAST KITلتثبيت وتشريح وقطع الأنسجة
طبق بتريكورنينج3160-152لتشريح / قطع دبابيس الحشرات الأنسجة
ENTOMORAVIA Austerlitz دبابيس الحشراتمقاس 5لتثبيت الأنسجة
وسادة مقاعد البدلاءVWR الدولية56617-014وسادات سفلية ماصة
للجرذان الجراحيةالعلمية كوربوريشن INSRATKITلإزالة وتشريح الأنسجة
2 Dumont # 3 ملقطKent Scientific Corporation   ؛INS500064لإزالة وتشريح الأنسجة
ملقط الأنسجةشركة كينت العلمية  INS500092لإزالة وتشريح الأنسجة
ScalpelKent Scientific Corporation INS500236لإزالة وتشريح الأنسجة
شفرة مشرطشركة كينت العلمية  INS500239لإزالة وتشريح الأنسجة
Professional Clipper شركة برينتري العلميةCLP-223  45لإزالة
خياطة الفراء خيوطأدوات العلوم الدقيقة18020-50مقاطع الأنسجة الرابطة
Radnoti، LLC158802إرفاق الأنسجة بقضيب / محول
1 جم الوزن  ؛ Mettler Toledo11119525لمعايرة
محلول كريبس:
كلوريد الصوديوم
كلوريد البوتاسيوم
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة
كبريتات المغنيسيوم
سكر العنب
بيكربونات الصوديوم
كلوريد الكالسيوم
كلوريد		المغنيسيوم 
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		 
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		لتحضير محلول كريبس
Isofluraneهنري شاين029405إلى تخدير
  ; خزان الأكسجينMatheson Tri Gasox251للاستخدام مع نظام التخدير
خزان الكربوجين (95٪ أكسجين ؛ 5٪ ثاني أكسيد الكربون)   ؛ماثيسون ثلاثي غازMoxn00hn36Dلتهوية محاليل كريبس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
  2. Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
  3. Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
  4. Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
  5. Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
  6. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
  7. Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
  8. Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
  9. Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
  10. Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
  11. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
  12. Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
  13. Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
  14. Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
  15. Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
  16. Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
  17. Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
  18. Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
  19. Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
  20. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
  21. Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
  22. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
  23. Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
  24. Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
  25. Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
  26. Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
  27. D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
  28. Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
  29. Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
  30. Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
  31. Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
  32. Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
  33. Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
  34. Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
  35. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
  36. Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
  37. Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
  38. Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
  39. Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة