مقالة منهجية

تحسن في جل β-القضاء الشامل للO-ربط وسلفو-glycomics الاختزالية التي كتبها الطيف الكتلي

DOI:

10.3791/51840

⸱

نوفمبر 20, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل استكشاف تنوع الجليكانات المرتبطة ب O بشكل شامل ، يتم تطبيق إجراء جديد لإزالة β المختزل داخل الهلام ، جنبا إلى جنب مع الكثافة الميثيل وطريقة تقسيم الطور السريع ، على تحليل الجليكان المرتبط ب O المنبعث مباشرة من البروتينات السكرية التي تم حلها بواسطة SDS-PAGE وقابلة لتحليل السكر اللاحق عن طريق قياس الطيف الكتلي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE متبوعا بالهضم المحلل للبروتين داخل الهلام لنطاقات البروتين التي تم حلها قد أنتج تحليلا بروتئيا عالي الدقة للعينات البيولوجية. تتطلب الأساليب المماثلة ، التي من شأنها أن تسمح بتحليل متعمق للجليكانات التي تحملها البروتينات السكرية التي تم حلها بواسطة SDS-PAGE ، اعتبارات خاصة من أجل تحقيق أقصى قدر من الاسترداد والحساسية عند استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) كطريقة للكشف. ومن العقبة الرئيسية التي يجب التغلب عليها في الحصول على بيانات عالية الجودة إزالة الملوثات المشتقة من الهلام والتي تتداخل مع تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. سير عمل العينة المقدم هنا قوي وفعال ويلغي الحاجة إلى تنظيف HPLC في الخط قبل MS. يتم غسل قطع الجل التي تحتوي على البروتينات المستهدفة في الأسيتونيتريل والماء وخلات الإيثيل لإزالة الملوثات ، بما في ذلك شظايا الأكريلاميد البوليمرية. يتم إطلاق الجليكانات المرتبطة ب O من البروتينات المستهدفة عن طريق التخلص من β المختزل داخل الهلام ويتم استردادها من خلال إجراءات تنظيف قوية وبسيطة. تتمثل إحدى مزايا سير العمل هذا في أنه يحسن الحساسية لاكتشاف وتوصيف الجليكان الكبريت. تنتج هذه الإجراءات فصلا فعالا للجليكانات الميثيلة الكبريتية عن الجليكان غير الكبريتات (السياليلات والممحايدة) عن طريق تقسيم الطور السريع قبل تحليل MS ، وبالتالي تعزيز التحليلات السكرية والكبريتية للبروتينات السكرية التي تم حلها بواسطة SDS-PAGE.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالغليكوزيل هو بروتين آخر متعدية التعديل الضروري، والمساهمة في الفيزيولوجيا العضوي، علم أمراض الأنسجة، والاعتراف الخلوي 1-3. على الرغم من التقدم الكبير في glycoscience التحليلي، تميز التنوع الكامل للglycans على بروتين معين لا يزال مهمة صعبة للغاية، خصوصا على البروتينات المعزولة من المصادر البيولوجية الأولية. ومع ذلك، فإن microheterogeneity من glycans سكري يؤثر كثيرا تفاعلات وظيفية مع بروتينات أخرى. لذا، وتوصيف التنوع غليكان ضروري لفهم مغزى الفسيولوجية الخلوية والأنسجة بالغليكوزيل 4،5. من أجل فهم مساهمة سكري بالغليكوزيل لعلم وظائف الأعضاء والأنسجة الفيزيولوجيا المرضية وقوية وحساسة، والتقنيات التحليلية glycomic شاملة أصبحت ذات أهمية متزايدة. في تحليل البروتين، وتتحقق التعرف البروتين عموما LC-MSتحليل / MS من الببتيدات زيتية 6. يمكن أن يتم هضم البروتين من استخدام البروتين أو البروتينات المنقى حلها بواسطة SDS-PAGE التالية في جل الهضم مع البروتياز مثل التربسين 7-9. قبل التخصيب للخليط البروتين بواسطة SDS-PAGE يعزز من عمق ودقة ID البروتين. تطوير استراتيجيات مماثلة لتحليل glycomic من بروتين سكري بالغليكوزيل تكمن في طليعة glycoscience.

وتعلق الطبقات الكبرى اثنين من glycans العمود الفقرى للبروتين إما من خلال N-O-الربط أو الربط. وتعلق glycans N-مرتبطة الأسباراجين (الأسباراجين) وجدت بقايا كجزء من sequon يعرف الأسباراجين-X-سر / منتدى المجالس الرومانسية / السيستئين (X هو أي الأحماض الأمينية إلا البرولين)، ويمكن أن تنطلق من الهضم الأنزيمي مع peptide- N -glycanase (PNGaseF أو A)، إما في الحل، في هلام، أو على لطخة 10-12. وترد glycans مرتبطة أساسا ليا سيرين (سر) أو ثريونين (THR) المخلفات. ومع ذلك، فقد تم الاتساع إنزيم واحد فقطtified التي هي قادرة على اطلاق سراح glycans مرتبطة يا من بروتين سكري ولها خصوصية غليكان محدودة للغاية، والإفراج فقط أبسط glycans مرتبطة الإخراج. تبقى استراتيجيات الإفراج الكيميائية الأسلوب المفضل لإطلاق شامل للglycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية. الاختزالية أو غير الاختزالية β-القضاء، أو hydrazinolysis وتقنيات الافراج كيميائية تتميز كذلك وحاليا الأكثر شيوعا نهج لإطلاق glycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية 13،14. على الرغم من التخفيض β-القضاء قد استخدمت لإطلاق glycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية مفصولة SDS-PAGE، النهج السابقة تقتضي الفصل HPLC لتحليلها لاحقا 15-17.

يوفر متعدد الأبعاد MS (MS ن) التحليل حاليا أغنى مصدر البيانات الهيكلية للتميز glycans صدر من بروتينات سكرية معزولة في المبالغ المتوقعة من معظم المصادر البيولوجية. عمق MSوالتوصيف الهيكلي المستندة سهلت كثيرا permethylating وglycans صدر قبل تحليلها. Permethylation يعزز التأين ويميل إلى معادلة ردود إشارة المولي عبر مجموعة واسعة من الهياكل غليكان 18،19. بالإضافة إلى ذلك، permethylation الكلمات بشكل لا لبس فيه الأنصاف أحادي السكاريد الطرفية واستبداله مع الجماهير مميزة، وبالتالي تعزيز توضيح الهيكلي 20-23. على سبيل المثال، glycans الحمضية يصعب عادة للكشف عن الأنواع غير permethylated التي كتبها MS. على الرغم من glycans الحمضية يمكن اكتشافه في وضع الأيونات السالبة التي كتبها MS، فإنه من المستحيل للكشف عن كل من glycans الحمضية ومحايدة في وضع ايون نفسه. والميزة الرئيسية لpermethylation غليكان هي التي سيتم توج كل من مجموعات الهيدروكسيل مجانية (OH) على بدائل أحادي السكاريد وغليكان مع مجموعة الميثيل (OCH 3 أو OME)، وبذلك يتم تحييد التهم لغليكان sialylated، وجعلها كما كشفها كما permethylated محايد (آسيالو) glycans. ومع ذلك، فإن الهيدروكسيل من الأنصاف سلفات على sulfoglycans تقاوم permethylation، مما أدى إلى الإبقاء على تهمة أنيوني، الذي يقمع التأين ويقلل الحساسية. هذا القمع يمنع حاليا glycomic تحليل شامل للبروتينات سكرية معقدة جدا مثل mucins، التي تحمل فرة عالية من glycans مكبرت 24-26.

التقارير الأخيرة على تنقية مكبرت glycans استخدمت اتهم، عكس المرحلة اللوني لتنقية وglycans permethylated منفصلة قبل تحليل MALDI. تعتمد هذه الطريقة على الفصل التام بين glycans مكبرت وغير مكبرت باستخدام مراحل النقالة المختلفة للشطف، والتي وجدنا أن تكون أقل صرامة من مرحلة التقسيم العضوي. وبالتالي، يتم عرض تقنيات جديدة مناسبة للكشف وإثراء sulfoglycans هنا. هذه التقنيات تسمح لاسترداد الكمي للglycans مكبرت في المرحلة المائية التالية الماء: • قرار مجلس الوزراء (ثنائي كلورو ميثان)استخراج، والتي تتم بشكل روتيني في نهاية التفاعلات permethylation غليكان 27. الأهم من ذلك، هذا الفصل قوي من sulfoglycans permethylated من خليط من permethylated glycans غير مكبرت يثري متزامنة للأنواع مشحونة مع تبسيط MS 2 أنماط التجزئة. ويرد أيضا على بروتوكول شامل لتحسين مرتبطة يا التحليل غليكان في هلام. تحسن بروتوكول يعزز الانتعاش غليكان، ويزيد من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من خلال الهيكلية MS ن تحليل glycans permethylated، ويحسن حساسية التحليلات sulfoglycomic تطبيقها على بروتينات سكرية أساسية معزولة من مصادر بيولوجية.

ويهدف هذا البروتوكول لتحليل مرتبطة يا غليكان مقتطفات سكري بأكملها أو من بروتين سكري معين من الفائدة حلها بواسطة SDS-PAGE ويتكون من ثلاثة الإجراءات التجريبية. A) جل التنظيف، B) في جل التخفيض β-القضاء، وC) permethy غليكانlation. الهدف هو الحصول على بيانات شاملة مرتبطة يا glycomic عن بروتينات سكرية تحصد من المصادر الأولية من الفائدة البيولوجية (الشكل 1). وتصور البروتينات السكرية مفصولة SDS-PAGE من قبل تلطيخ ويتم استئصال عصابات من الفائدة وشرائح الناتجة الفرقة هلام الى قطع صغيرة. وdestained القطع جل وتعرض لغسيل خلات الإيثيل لإزالة الملوثات هلام (الشكل 2A). ويتحقق الإفراج غليكان من قبل في جل التخفيض β-القضاء (الشكل 2B) وpermethylated وglycans الافراج عنهم. استخراج مائي العضوي permethylation التالية أقسام كميا أنيوني مكبرت glycans بعيدا عن glycans محايدة غير مكبرت (الشكل 2C). في جل التخفيض β-القضاء إلى جانب استخراج مائي العضوي يمكن توصيف glycans مرتبطة يا وsulfoglycans صدر من كميات صغيرة من بروتين سكري مفصولة SDS-PAGE. نظرة عامة على الاستراتيجية هي summariوتظهر زيد في الشكل 1 والتفاصيل في الشكل (2). وبالإضافة إلى ذلك، جزء من القطع هلام destained وغسلها يمكن استخدامها لمعرف البروتين من خلال تقنيات البروتين LC-MS / MS القياسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: مختبر مخاوف الأمان

تمشيا مع أفضل الممارسات المختبرية القياسية، نلاحظ ما يلي. تخزين جميع المذيبات العضوية في المواقع المناسبة. إبقاء جميع مواد النفايات في حاويات النفايات الكيميائية مع وضع العلامات واضحة على التراكيب الكيميائية. عن العديد من الكواشف المستخدمة في هذه البروتوكولات المسرطنة المحتملة أو توليد الغازات القابلة للاحتراق المتقلبة، والتعامل مع جميع الكواشف في غطاء الدخان مع التهوية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية مثل القفازات، معطف المختبر، وحماية العين عند العمل مع المذيبات العضوية.

figure-protocol-1
الشكل 1. إجراءات في جل O-glycomics. يتم حلها (A) البروتينات ذات الاهتمام من قبل SDS-PAGE، من خلال الكشف عن الإجراءات تلطيخ المناسبة (Coomassie أو الفضة)، ورفعه. وقطع شرائح هلام رفعهإلى مكعبات صغيرة، destained، وغسلها مع خلات الإيثيل للحد من الملوثات التي تتداخل مع تحليل لاحق MS. جزء من شريحة الجل يمكن أن تكون محفوظة لفي جل الهضم زيتية وتوصيف بروتيوميك لاحق من قبل LC-MS / MS. وصدر (ب) glycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية تحلها في جل التخفيض β-القضاء. وتشمل الخطوات الأساسية تحلية وإزالة بورات من قبل حالة الأيزوتروب مع الميثانول. (C) glycans الصادرة عن التخفيض β-القضاء يا مرتبط وpermethylated وتقسيم لاحقا في المراحل المائية والعضوية. وعثرت Sulfoglycans كميا في (مائي) المرحلة العليا بينما glycans محايدة وsialylated التقسيم في الدنيا (DCM) طبقة.

figure-protocol-2
الشكل 2. تفاصيل الرسم البياني لفي جل glycomics. كل التجربهتل خطوة هو مبين في الشكل (1) ويتضح بشكل فردي. (A) جل destaining واستخراج EtOAc، (ب) مباشرة في جل التخفيض β-القضاء للإفراج غليكان المرتبطة O، و (C) permethylation ومرحلة التقسيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. جل الختان وإزالة الملوثات جل المشتقة

  1. قبل البدء في الإجراء، وإعداد المواد الكيميائية والمواد الكيميائية المدرجة في قائمة المواد.
  2. حل البروتين على جل SDS-PAGE باستخدام أنظمة عازلة تريس، جليكاين القياسية. وصمة عار حل البروتينات مع أي Coomassie بريليانت الأزرق أو الفضة وصمة عار. بشكل عام، والانتعاش من glycans مرتبطة يا من فضة ملطخة المواد الهلامية ما يقرب من 80-90٪ من الانتعاش يتحقق من Coomassie ملطخة المواد الهلامية.
  3. بعد الكهربائي، ووضع الجل على طبق من الزجاج والمكوس رانه المنطقة ذات الاهتمام باستخدام مشرط أو شفرة حلاقة نظيفة.
  4. لزيادة العائد من O-glycans، ونقل الفرقة جل الاهتمام على لوحة زجاجية أخرى وقطع قطعة هلام المستأصل إلى حوالي 2 مم مكعبات. تجنب الوقوع في قطع هلام أصغر من 1 مم مكعبات لأن انخفاض الانتعاش غليكان. نقل القطع هلام صغيرة إلى رأس المسمار أنبوب زجاجي (13 × 100 ملم) مع microspatula الفولاذ المقاوم للصدأ.
  5. إضافة 1 مل من 25 ملي بيكربونات الأمونيوم (AMBIC، NH 4 HCO 3) إلى أنبوب العينة، سقف أنبوب زجاجي مع غطاء رأس المسمار تفلون مبطنة، وتخلط بلطف عبها الأنبوب قبل السماح الوقوف لمدة 10 دقيقة. لا توظف الانفعالات قوية من أجل تجنب تمزيق القطع هلام.
  6. إزالة بعناية AMBIC من أنبوب زجاجي باستخدام ماصة باستير الزجاج أو ماصة مجهزة غيض من البلاستيك طويل خارج. تجنب تحطيم ونقل القطع الصغيرة هلام أثناء إزالة الحل AMBIC.
  7. إضافة 1 مل من أسيتونتريل (ACN) للأنبوب زجاجي، وكأب، وتخلط بلطف بواسطة أنبوب عبها قبل السماح الوقوف لمدة 10 دقيقة. تأكد من أن القطع هلام مغطاة تماما مع المذيب. إذا لزم الأمر، ودفع قطع هلام قبالة جدار الأنبوب وإلى المذيبات مع ماصة.
  8. ماصة قبالة ACN من أنبوب زجاجي وكرر الخطوات من 1،5-1،7 حتى يتم التخلص من اللون الأزرق مشرق. أكرر ما لا يقل عن خمسة متتابعة يغسل AMBIC / ACN إذا لزم الأمر. للفضة ملطخة المواد الهلامية، استخدام عدة يزيل اللون. انتقل إلى الخطوة التالية عندما قطعة هلام يتحول في حين الأبيض بشكل موحد في ACN.
  9. ماصة إيقاف أي السائل من أنبوب زجاجي، خلاصة الأنبوب، إضافة 1 مل من AMBIC واسمحوا الوقوف لمدة 5 دقائق.
  10. إزالة AMBIC وإضافة 2 مل من خلات الإيثيل (EtOAc) إلى أنبوب زجاجي. خلاصة أنبوب مع غطاء تفلون مبطنة ومكان في 4 درجات مئوية خلال الليل مع نهاية الإفراط في نهاية التحريض أو بدلا من ذلك إجراء ثلاث يغسل EtOAc في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لكل منهما. ويعد غسل EtOAc، وأكثر كفاءة في إزالة الملوثات.
  11. نقلوEtOAc النهائي يغسل ثلاث غسلات وأداء كل منها 2 مل من H 2 O. سوف الإزالة الكاملة للEtOAc ضمان التخفيض رد فعل قوي β-القضاء.
  12. ماصة من H 2 O ويذوى هلام عن طريق الغسيل مرة واحدة مع 1 مل من ACN.
    ملاحظة: بعد التجفيف، والمواد الهلامية المجففة جاهزة للفي جل β-القضاء. ويمكن تخزين قطع هلام المجففة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  13. إيقاف عملية الغسيل في أي خطوة وتخزين القطع هلام في 4 درجات مئوية خلال الليل، بغض النظر عن أي عازلة أو حل يتم تطبيقها على هلام (AMBIC، ACN، H 2 O). إعادة تشغيل إعداد العينة في أي وقت خلال الأيام القادمة 2.
  14. استخدام جزء من القطع هلام destained والمجففة لمعرف البروتين النهج البروتين القياسية.

2. في جل الإصدار-O غليكان قبل التخفيض β-القضاء

  1. إعداد محلول المخزون من 1 هيدروكسيد الصوديوم M (هيدروكسيد الصوديوم) باستخدام 50٪ هيدروكسيد الصوديوم أو هيدروكسيد الصوديوم الصلبة تخزين وعند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      أخذ 5.2 مل من 50٪ هيدروكسيد الصوديوم (أو 4 غرام من هيدروكسيد الصوديوم الصلبة) وضبط مستوى الصوت إلى 100 مل لجعل 1 M هيدروكسيد الصوديوم الحل. تمييع الحل الأسهم 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم، والتي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية تصل إلى 6 أشهر دون فقدان الكفاءة في التفاعلات β-القضاء الاختزالية.
  • جعل 2 M بوروهيدريد الصوديوم (NaBH 4) في 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم. حل 38 ملغ من NaBH 4 في 0.5 مل من 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم. عموما، استخدام 0،5-1،0 مل من محلول بوروهيدريد لكل عينة. تختلف حجم محلول التفاعل على كمية من القطع هلام المجففة أعدت في الخطوة 1. نتوقع أن تستخدم 0.5 مل من محلول بوروهيدريد لمدة 1-2 قطع هلام رفعه (الخطوة 1.3).
  • إضافة 500 ميكرولتر من 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم إلى قطع هلام المجففة واسمحوا الوقوف لمدة 3-5 دقيقة على الجليد لكي تتوازن الجل على الشروط الأساسية التي تعزز الانتعاش غليكان.
  • إضافة 500 ميكرولتر من 2 M NaBH 4 في 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم، مما يؤدي إلى تركيزات النهائية من 1 M NaBH
  • خلال الساعة الأولى من الحضانة، مزيج بلطف أنبوب كل 15 دقيقة. تجنب الانفعالات القوية، لأنه قد تفتيت قطع هلام. أداء رد فعل في حاضنة معايرتها بشكل جيد / الفرن أو في كتلة التدفئة. تأكد من أن القطع هلام مغطاة مع محلول التفاعل.
  • وقف رد فعل عن طريق إزالة أنبوب عينة من الحاضنة أو كتلة التدفئة ووضعه على الجليد.
    ملاحظة: بعد السماح للرد فعل β-القضاء والمضي قدما لمدة 18 ساعة، يجب إجراء عملية تحلية في نفس اليوم.

    • 3. تحلية على الموجبة لتبادل اللوني

    1. مع الحفاظ على أنبوب العينة على الجليد لمنع تشكيل الحرارة المفرطة، إضافة ببطء 10٪ حامض الخليك (AcOH) قطرة قطرة لتحييد القاعدة. دوامة بلطف أنبوب عينة من بين الإضافات AcOH. كن حذرا لإضافة حمض ببطء وإسقاط الحكمة باسم additiعلى من الحمض وإنتاج "بركان" من الفقاعات. أجهزة الطرد المركزي أنبوب للقضاء على فقاعات ومنع امتداد، إذا لزم الأمر.
      1. من أجل إزالة كمية كبيرة من الصوديوم في خليط التفاعل، وتمرير خليط التفاعل من خلال عمود صغير الموجبة لتبادل (Dowex أو الراتنج AG-50W-X8، H + النموذج).
      2. غسل راتنج تبادل الأيونات الموجبة مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك M 1 قبل استخدامها وذلك لإزالة الملوثات التي تتداخل مع تحليل MS، حتى لو كان هو من الراتنج الصف التحليلية.
      3. نقع في الراتنج 1 M هيدروكسيد الصوديوم وإزالة حل عن طريق الترقيد. إضافة غير المتأينة المياه، وإزالة الماء، ثم يضاف 1 M حمض الهيدروكلوريك.
    2. كرر هذه الخطوات حتى حل فوق الراتنج عديم اللون. غسل الراتنج تنظيفها بالماء منزوع الأيونات وتخزينها في 5٪ AcOH في 4 درجات مئوية.
    3. لجعل كوب صغير العمود، والصفر، وكسر غيض من الزجاج ماصة باستور باستخدام قطع السيراميك بحيث تفتق من طرف ماصة هو حوالي 1 سم طويل. ندف بعيدا المكونات من الصوف الزجاجي ودفع نحو الطرف تشكيل دعم للسرير الراتنج. تأمين العمود ماصة مع المشبك أو الغسيل ومكان على أنبوب اختبار زجاجي.
    4. غسل ماصة الفارغة مع 1 مل من الميثانول (MeOH) و 3 مل من 5٪ AcOH. دوامة H + Dowex أو AG50 تبادل الأيونات الموجبة راتنج الطين تخزينها في 5٪ AcOH ونقل ما يكفي من الطين لإنتاج حجم السرير 1 مل في العمود ماصة باستور.
    5. شطف العمود باستخدام خمسة مجلدات من 5٪ AcOH. تحقق تتدفق من خلال لظهور جزيئات الراتنج وعدم استخدام العمود إذا تم الكشف عن الراتنج.
    6. وضع عمود جديد خلال أنبوب زجاجي رأس المسمار (16 × 125 مم) والعينة الحمل. جمع التدفق من خلال وأزل glycans مع لا يقل عن 3 مجلدات من 5٪ AcOH في نفس الأنبوب.
    7. تغطية أنبوب مع بارافيلم وجعل فتحات صغيرة بإبرة. وضع أنبوب العينة في -80 درجة مئوية أو على الجليد الجاف. مرة المجمدة، تجفيف عينة بالتجفيد. تخزين المواد المجففة في -20 درجةC حتى الاستخدام.

    4. إزالة بورات

    1. إعداد 10٪ AcOH في MeOH. خذ 10 مل من حمض الخليك الجليدي وضبط مستوى الصوت إلى 100 مل مع الميثانول. تخزين هذا الكاشف في زجاجة مع غطاء تفلون مبطنة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. إضافة 300 ميكرولتر من 10٪ AcOH في MeOH إلى المجفف، مجفف بالتجميد أنبوب عينة ودوامة. إزالة الناتجة بورات ثلاثي ميثيل عن طريق التبخر تحت تيار N 2.
      ملاحظة: خلط الأملاح بورات مع الميثانول في ظل الظروف الحمضية تنتج بورات ثلاثي ميثيل وهو مركب متطاير.
    3. الجافة تحت N 2 تيار عند 37 درجة مئوية. بعد التجفيف، إضافة قسامة آخر من AcOH في MeOH كما هو موضح في الخطوة 4.2. تجفيف السائل لمدة 5 دقائق تحت النيتروجين (N 2) تيار عند 37 درجة مئوية.
      1. تكرار إعادة تعليق وتجفيف 3 مرات على الأقل. تخزين المواد المجففة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

    5. C18 النظيفة المتابعة

    1. تتوازن عمود C18 خرطوشة(حجم 1 مل، 100 ملغ الراتنج) باستخدام ثلاثة مجلدات من ACN وخمسة مجلدات من 5٪ AcOH. تسريع مرور الحلول توازنه من خلال تطبيق خفيف ضغط الهواء الإيجابي.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من 5٪ إلى AcOH المحلاة وخالية من بورات أنبوب العينة وحل من قبل دوامة.
    3. تحميل عينة معلق على عمود C18 معايرتها وجمع من خلال تدفق في أنبوب زجاجي سقف المسمار (13 × 100 مم). أزل مع 3 مل من 5٪ AcOH في نفس أنبوب glycans-O.
    4. بارافيلم الأنبوب، وجعل ثقوب صغيرة بإبرة صغيرة أو استخدام غطاء مغلق فضفاضة مبطنة PTFE لتغطية الأنبوب، وتجميد العينة في -80 درجة مئوية أو على الجليد الجاف. إزالة المذيب بالتجفيد. تخزين العينة المجففة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

    6. إعداد قاعدة للPermethylation

    ملاحظة: من أجل تحقيق permethylation قوية، وإعداد هيدروكسيد الصوديوم الطين الطازجة. جميع الأواني الزجاجية المستخدمة للتفاعلات permethylation يجب تنظيف على نطاق واسع.

    1. لإعداد قاعدة كاشف للpermethylation، إضافة 400 ميكرولتر من 50٪ هيدروكسيد الصوديوم إلى كوب نظيف المسمار أعلى أنبوب (13 × 100 مم). إضافة 800 ميكرولتر من MeOH اللامائية ودوامة.
    2. إضافة 4 مل من اللامائية سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) ودوامة لتوليد راسب أبيض.
    3. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 1 دقيقة لتكوير راسب. ماصة قبالة طاف وتجاهل. إضافة 4 مل إضافية من DMSO اللامائية لبيليه. دوامة.
    4. كرر الخطوة 6.2 و 6.3 كحد أدنى من ثلاثة أضعاف أو حتى أي أشكال راسب أبيض.
    5. حل قاعدة مكعبات في 3 مل DMSO اللامائية وتخلط بلطف بواسطة pipetting صعودا ونزولا مع ماصة باستير نظيفة.
    6. استخدام قاعدة الفور للتفاعل permethylation التالية لأنه لا يمكن تخزينه.

    7. Permethylation من Glycans المفرج عنهم

    1. إضافة 200 ميكرولتر من DMSO اللامائية إلى عينة C18 تنقيته ودوامة أو يصوتن ل resuspend.
    2. إضافة 300 ميكرولتر من resuspانتهت قاعدة الطين لعينة وإضافة على الفور 100 ميكرولتر من iodomethane (MEI). ختم أنبوب مع غطاء تفلون مبطنة ومزيج بقوة لمدة 5 دقائق قبل الدوامة.
    3. لوقف رد فعل permethylation، إضافة 2 مل من 5٪ AcOH على الجليد ودوامة. ماصة الحل صعودا وهبوطا 5 مرات للحد من حجم ما تبقى من مي عن طريق التبخر.
      ملاحظة: إن AcOH يحيد الحل وإزالة مي زيادة كفاءة استخراج glycans مكبرت إلى مرحلة المياه خلال مرحلة التقسيم.
    4. إضافة 2 مل من ثنائي كلورو ميثان (DCM) ودوامة. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لفصل المراحل المائية والعضوية.
    5. نقل الطبقة العليا (المرحلة المائية التي تحتوي على غالبية permethylated glycans مكبرت) في أنبوب زجاجي جديد (13 × 100 مم).
    6. إضافة 2 مل من H 2 O إلى مرحلة العضوية ودوامة. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 1 دقيقة لفصل المراحل المائية والعضوية والجمع بين هذه المرحلة المائية الثانية مع التنوبالحادي المرحلة المائية (الخطوة 7.5).
    7. كرر الخطوة 7.6 و 7.5 ثلاث مرات أكثر، لكن ليست هناك حاجة لانقاذ المراحل المائية الناتجة عن الأقسام التالية.
    8. إزالة الطبقة العلوية النهائية (المرحلة المائية) إلى أقصى حد ممكن من الطبقة السفلية (المرحلة العضوية) ونقل الطبقة السفلية (المرحلة العضوية) في أنبوب زجاجي جديد مستقل باستخدام نظيفة باستور ماصة.
    9. تجفيف المرحلة العضوية تحت N 2 تيار في 42 درجة مئوية.
    10. تغطية أنبوب مع بارافيلم وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

    8. C18 تنظيف Permethylated مكبرت O-glycans من المرحلة مائي

    1. تتوازن عمود C18 خرطوشة مع ثلاثة مجلدات من ACN وخمسة مجلدات من 5٪ AcOH.
    2. تحميل المراحل المائية التي تم جمعها ومجتمعة من الخطوات 7.5 و 7.6 على العمود.
    3. يغسل العمود مع 10 مل من H 2 O للتحلية.
    4. أزل permethylated مكبرت يا glycans-في أنبوب زجاجي جديد مع 2 مل50٪ ACN. استخدام شطف إضافي بنسبة 85٪ حثيث لتعزيز الانتعاش من permethylated مكبرت O-glycans على يغوساكاريدس أكبر.
    5. eluates الجافة تحت دفق النيتروجين عند 42 درجة مئوية.
    6. تخزين المواد المجففة في -20 درجة مئوية تصل إلى 6 أشهر السابقة للتحليل MS.

    9. الطيف الكتلي من Permethylated O-glycans

    1. تحليل permethylated يا glycans عن طريق الحقن المباشر إلى مطياف الكتلة المناسب باستخدام مصدر nanoelectrospray بمعدل تدفق الحقنة من 0،40-0،60 ميكرولتر / دقيقة عند 210 درجة مئوية درجة الحرارة الشعرية. للتجزئة من قبل إدارة البحث الجنائي في MS / MS و MS ن من فخ أداة أيون، وتطبيق 30-40٪ من الطاقة الاصطدام.
    2. لوضع الأيونات السالبة، إعادة permethylated مكبرت O-glycans في 50 ميكرولتر من الميثانول / 2-بروبانول / 1-بروبانول / 13 ملي خلات الأمونيوم المائية (16: 3: 3: 2 من حيث الحجم). لوضع أيون إيجابي، وإعادة permethylated محايدة / sialylated O-glycans في 50 ميكرولتر من 1 ملم الصوديوم المائيةشي ده في الميثانول / الماء (1: 1).
    3. استخدام الخرائط إجمالي أيون (TIM) ومحايد فقدان الفحص (فحص NL) وظيفة من إصدار حزمة البرمجيات Xcalibur 2.0 لتحليل MSN إلى تميز الهياكل-O غليكان الفردية 13،19.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    تأثير خلات الإيثيل العلاج قبل في جل الاختزالية β-القضاء

    ويرد الطيف الكتلي تمثيلية من permethylated عينات غليكان مرتبطة يا صدر من الأبقار باستخدام الميوسين في جل التخفيض β-القضاء في الشكل 3، وغسل EtOAc من القطع الجل يزيل بشكل فعال SDS وpolyacryl الملوثات التي تتداخل مع تحليل لاحق MS 27.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    إن الجمع بين التخلص من β الاختزالي داخل الهلام والاستخراج المائي العضوي يعزز حساسية وعمق البيانات الهيكلية التي يمكن الحصول عليها لتوصيف الجليكانات المرتبطة بالكبريتات وغير الكبريتات O التي يتم حصادها من كميات صغيرة من البروتينات السكرية من نوع الميوسين التي تم حلها من بروتينات أخرى بواسطة SDS-PAGE. التطورات الأساسية للأساليب التقنية المعروضة في هذه الدراسة هي: (أ) الإزالة السهلة للملوثات المشتقة من الهلام بخطوات غسيل بسيطة. (ب) الاسترداد الكمي للسلفوغليكان المنفذ للميثيل في المرحلة المائية بعد الانقسام السريع للماء - DC...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    يعلن المؤلفون عدم وجود مصلحة مالية متنافسة.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    تم دعم هذا العمل من خلال P01HL107151 المنحة من NHLBI / NIH. كما يقر المؤلفون بامتنان بالدعم والوصول إلى الأجهزة المقدمة من خلال P41GM103490 المنح من NIGMS / NIH.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    الماء ، المياه منزوعة الأيوناتSigma-Aldrich   ؛270733-4LCHROMASOLV ، لحمض الخليك HPLC
    ، GlacialFisherA38-500معتمد من ACS & ge ؛ 99.7٪ وزن / وزن
    الميثانولسيجما ألدريتش   ؛34860-4L-RCHROMASOLV ، ل HPLC ، & 99.9٪
    بيكربونات الأمونيومفلوكا09830-500GBioUltra ، > 99.5٪ (T) ، الخطوة 1
    AcetonitrileSigma-Aldrich   ؛34998-4LCHROMASOLV Plus ، ل HPLC ، & 99.9٪ ، الخطوة 1
    أسيتات الإيثيلFluka34972-1L-RLC-MS CHROMASOLV ، الخطوة 1
    بوروهيدريد الصوديومAldrich213462-25GReagentPlus ، 99٪ ، الخطوة 2
    IodomethaneSigma-Aldrich   ؛289566-100GReagentPlus ، 99.5٪ ،   الخطوة 6.  يخزن في درجة حرارة 4 درجات. C حتى الاستخدام.  اجلس في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    محلول هيدروكسيد الصوديوم ، 50٪ وزن / وزنمن فيشرSS254-1، الخطوة 6
    ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، لا مائيسيجما ألدريتش   ؛276855-1Lلامائي ، & ge ؛ 99.9٪ ، الخطوة 6
    الميثانول ،Sigma-Aldrich اللامائي   ؛322415-100 مللا مائي ، 99.8٪ ، الخطوة 6
    ثنائي كلورو ميثانسيجما ألدريتش   ؛34856-4LCHROMASOL ®, ل HPLC, & ge ; 99.8٪ ، يحتوي على مادة الأميلين كمثبت ، الخطوة 7
    شكل الهيدروجين Dowex 50WX8شكل الهيدروجين 100-200 & nbsp ؛ شبكةسيجما ألدريتش   ؛217506-500Gالخطوة 3
    AG 50W-X8 الراتنج  Bio-Rad142-1441الخطوة 3
    BAKERBOND spe 1 مل × 100 مجم عمود استخراج الطور الصلب ، PP ، Octadecyl (C18) المرحلة العكسيةJT BakerJT-7020-01الخطوة 5 و 8
    7.5٪ Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب   ؛Bio-Radالخطوة 1
    الصديقة للبيئة Coomassie Stain Bio-Rad161-0786G-250 ، الخطوة 1
    طقم البقع الفضية لقياس الطيف الكتليبيرس24600الخطوة 1
    مجموعة السكريات قليلة السكاريد (Maltotriose ، Dp3: R474140)Supelco   ؛47265
    مجموعة السكريات قليلة (Maltotetraose, Dp4: R474135)Supelco 47265
    ماصات باستور يمكن التخلص منها ، زجاج ، طرف قصيرVWR14673-010اغسل قبل الاستخدام
    PYREX 13 × 100 مم أنابيب ثقافة ملولبة مستديرة القاع يمكن التخلص منهاCorning99447-13اغسل قبل الاستخدام
    PYREX 16 × 125 مم أنابيب الثقافة الملولبة ذات القاع المستدير القابل للتصرفCorning99447-16اغسل قبل الاستخدام
    أغطية / إغلاق الفينول مع بطانة مطاطية ذات وجه PTFEKimble45066C-13اغسل قبل الاستخدام
    أغطية / إغلاق الفينول مع بطانة مطاطية ذات وجه PTFEKimble45066C-15اغسل قبل الاستخدام
    حقنة هاميلتون HPLCهاميلتون81265الحجم 500 & nbsp ؛ مو ل ، حجم الإبرة 22 جرام
    حقنة هاميلتون HPLCهاميلتون81165حجم 250 & nbsp ؛ مو ل ، حجم الإبرة 22 جرام
    حقنة هاميلتون HPLCهاميلتون81065الحجم 100 & nbsp ؛ مو ل ، حجم الإبرة 22s G
    هاميلتون HPLC حقنةهاميلتون80965حجم 50 & nbsp ؛ مو ل ، حجم الإبرة 22s G
    هاميلتون محاقن معايرةهاميلتون80300حجم 10   ؛ مو ل ، حجم الإبرة 26s G
    بتري طبق زجاج 100 مم × 15 ممGSC INTERNATIONAL INC1500-4اغسل قبل الاستخدام ، الخطوة 1
    شفرات الجراحة Bard-Parkerفيشر371310الخطوة 1
    التسخين / التحريك Reacti-Thermبيرس18870الخطوة 1 و 4 و 7
    كتل التسخينفيشر125Dالخطوة 2
    بيركس الألياف الزجاجية الصوف بورسليكات حجم المسام 8   مو مألدريتشCLS3950الخطوة 3
    السيليكا المنصهرقاطع الأنابيبalltech3194الخطوة 3
    دوامات متعددة الأنابيب   ؛VWR444-7063الخطوة 6
    المجفف 25EL FreezemobileVirtis25EL
    جهاز طرد مركزيVWRسريري 50
    LTQ Orbitrap DiscoveryThermo Fisher Scientific
    معتمد وحدة قاطع

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    O SDS PAGE C18

    مقالات ذات صلة