مقالة منهجية

الجمع بين الفرز المغناطيسي للخلايا الأم والاختبارات تذبذب لتحليل الجينوم عدم الاستقرار خلال الإنقسامية شيخوخة الخلايا في خميرة الخباز

14.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51850

⸱

أكتوبر 16, 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Rensselaer Polytechnic Institute

في هذه المقالة

ملخص

وتستخدم معدلات الطفرات في خلايا خميرة الخباز الشباب من خلال اختبارات قياس تذبذب التنبؤ الترددات تحور الخلايا الأم من مختلف الأعمار تنسخي. ثم يتم استخدام الفرز المغناطيسي والتدفق الخلوي لقياس الترددات الطفرة الفعلية وعمر الخلايا الأم لتحديد أي انحرافات من الترددات الطفرة المتوقعة.

الملخص

كانت خميرة الخباز نظام نموذجا ممتازا لدراسة آليات وعواقب عدم الاستقرار الجينوم. المعلومات المكتسبة من هذا النموذج الخميرة هي ذات الصلة لكثير من الكائنات الحية، بما فيها الإنسان، منذ إصلاح الحمض النووي والاستجابة الحمض النووي من التلف العوامل يتم حفظها جيدا عبر الأنواع المختلفة. ومع ذلك، S. لم يتم استخدامها لمعالجة الخباز تماما ما إذا كان معدل تراكم الطفرات التغييرات مع زيادة تنسخي (الإنقسامية) سن بسبب القيود التقنية. على سبيل المثال، والقياسات من الخميرة عمر تكاثري خلال المجهرية تشمل السكان صغيرة جدا من الخلايا، التي تحظر الكشف عن الطفرات النادرة. وقد تم تطوير أساليب الوراثية لإثراء للخلايا الأم في السكان عن طريق إحداث موت الخلايا الوليدة، ولكن لا تزال أحجام السكان محدودة بسبب التردد الذي الطفرات العشوائية التي تضر النظم اختيار تحدث. البروتوكول الحالي يستفيد من sorti المغناطيسينانوغرام من خلايا الخميرة الأم المسمى السطح للحصول على عدد كبير من السكان ما يكفي من شيخوخة الخلايا الأم لتحديد الطفرات النادرة من خلال التحديدات المظهرية. وأنشأت معدلات الطفرة، من خلال اختبارات قياس تذبذب، والترددات الطفرة الأولى للخلايا الشابة وتستخدم للتنبؤ وتيرة الطفرات في الخلايا الأم من مختلف الأعمار تنسخي. ثم يتم تحديد الترددات طفرة للخلايا الأم فرزها، ويتم تحديد سن الخلايا الأم باستخدام التدفق الخلوي بواسطة تلطيخ مع كاشف الفلورسنت التي يكشف الندوب برعم شكلت على سطوح الخلايا أثناء انقسام الخلية. يمكن مقارنة الترددات تحور توقع على أساس عدد من انقسامات الخلية إلى ترددات وحظ تجريبيا للخلايا الأم في سن تكاثري معين ثم تحديد ما إذا كانت هناك التغيرات المرتبطة بالعمر في معدل الطفرات تتراكم. أشكال مختلفة من هذا البروتوكول الأساسي توفر وسيلة لدراسة تأثير التغيرات في وظائف جينات معينة أوالظروف البيئية المحددة على تراكم الطفرات آليات لمعالجة عدم الاستقرار الكامن الجينوم أثناء الشيخوخة تنسخي.

المقدمة

الكائنات الدقيقة مثل الخميرة خميرة الخباز، هي نماذج ممتازة للتحقيق معدلات الطفرة، ولكن هذه النماذج لم استخداما كاملا لتحقيق تراكم الطفرات أثناء الشيخوخة الإنقسامية من الخلايا. وقد افترض تراكم الطفرات في الجينوم النووي للمساهمة في الشيخوخة قبل مما أدى إلى فقدان التدريجي لل(أو التباين في) وظائف الجينات 1. القدرة على استخدام نظام الميكروبي لدراسة الآليات والنتائج المترتبة على تراكم الطفرة خلال الشيخوخة يمكن أن تسرع إلى حد كبير تحديد العوامل الوراثية والبيئية التي تؤثر على هذه العملية، لأن النظم الوراثية السطحية وسهولة قياس التغيرات المظهرية نادرة في الكائنات الحية الدقيقة. عوامل إصلاح الحمض النووي والبروتينات استجابة الحمض النووي من التلف والحفاظ عليها جيدا عبر الأنواع المتنوعة 2، وتم تحديد أوجه التشابه الأساسية في الشيخوخة عضوي للكائنات متنوعة مثل S. الخباز ود 3 الثدييات، مما يجعل من المرجح أن النتائج التي تم الحصول عليها من دراسات في الخميرة سوف تكون ذات صلة الشيخوخة في العديد من الكائنات الحية.

دراسات الشيخوخة في S. الخباز الاستفادة من نموذجين الشيخوخة التي تقيس الشيخوخة الزمني أو الشيخوخة تنسخي من الخلايا. وتتميز الشيخوخة الزمني من الفقدان التدريجي للبقاء السكان في خلية الخميرة التي هي في حالة (الطور الثابت) غير تقسيم بسبب نضوب المغذيات 3. وقد استخدم نموذج الشيخوخة الزمني لإثبات أن الطفرات تتراكم مع زيادة العمر 4، حيث يتم الحصول عليها السكان الخلية بسهولة كبيرة في هذا النموذج لإجراء التحديدات المظهرية للخلايا متحولة. في هذه الحالة، يظهر تراكم الطفرات أن تتأثر مسارات، مما يشير إلى النمو والاكسدة 5، ولكل من هذه العوامل هو ذات الصلة لفهم الشيخوخة في حقيقيات النوى المتعددة الخلايا 3. نموذج الشيخوخة تكاثري يستغل divisi غير المتماثلةعلى بين S. خلايا الأم وابنتها الخباز عن التحقيق الشيخوخة الذي يحدث مع الأجيال المتعاقبة خلية 3. وكثيرا ما تقاس الخميرة الشيخوخة تنسخي من خلال المجهرية للسكان صغير من الخلايا الأم وابنتها، أو أكثر في الآونة الأخيرة، من خلال المجهر الفيديو من السكان صغيرة من خلايا الخميرة في أجهزة ميكروفلويديك 6،7. أحجام السكان محدودة تجعل هذه الأساليب ملاءمة سيئة للتحقيق تراكم الطفرة خلال الشيخوخة الإنقسامية ما لم يتم الحصول على المعلومات كامل الجينوم من الخلايا واحد أو يتم قياس التغيرات الجينية ذات تردد عال جدا 8. كامل الجينوم تسلسل الخلايا واحد يوفر مجموعات البيانات الكبيرة للتحقيق تراكم الطفرات، ولكن النظم اختيار المظهرية لديها ميزة هامة لتوفير وسيلة لقياس معدلات الطفرات لدراسة آليات تراكم الطفرات الكامنة. دراسات لدراسة الترددات طفرة ومعدلات من خلال التحديدات المظهرية في haploiحتى الآن لم يتم الإبلاغ عن سلالات الخميرة د أثناء الشيخوخة تنسخي.

يتم قياس معدلات الطفرات عادة باستخدام اختبارات تذبذب 9. قيم تردد طفرة تعكس العدد الكلي للخلايا إيواء طفرة في تسلسل الجينات في عدد السكان. وهذا يشمل الخلايا التي تحدث طفرات مستقلة وأي ذرية من تلك الخلايا أن مجرد وراثة الطفرات الموجودة مسبقا. في المقابل، ومعدلات الطفرة من خلال اختبارات قياس تذبذب تمثل عدد من الطفرات المستقلة التي تنشأ حديثا مع كل جيل الخلية. تشمل هذه الاختبارات عادة بتلقيح العديد من الثقافات تكرار بكثافة خلية منخفضة للحد من احتمالات مضيفا مع خلايا موجودة مسبقا الطفرات في تسلسل الهدف، وتزايد الثقافات إلى تشبع القريب، وتحديد خلايا متحولة من النمو في المتوسط ​​انتقائية. ثم يتم استخدام أعداد خلايا متحولة المحددة في تكرار السكان في واحد من عدة نماذج رياضية لتقدير عدد طndependent الطفرات التي نشأت أثناء نمو 9. مقارنة عدد من الطفرات مستقلة لمتوسط ​​حجم السكان يوفر مقياسا لمعدل الطفرات. في S. الخباز، كثيرا ما تقاس الترددات طفرة ومعدلات استخدام URA3 وCAN1 الجينات، منذ الخسارة من وظيفة الطفرات في هذه الجينات تنتج الظواهر اختيار. فقدان وظيفة URA3 يجعل خلايا مقاومة لل5 fluoroorotic حمض (5 FOA)، لأن البروتين المشفرة بواسطة URA3 تحويل 5 FOA في جزيء السامة 10. فقدان وظيفة خلايا CAN1 يسمح لتصبح مقاومة للcanavanine، وهو أرجينين التناظرية السامة، لأن البروتين المشفرة بواسطة CAN1 ينقل أرجينين وcanavanine إلى خلايا 11.

وقد استخدمت كل من استراتيجيات الفرز الوراثية والبدنية بنجاح للحصول على السكان أكبر من S. خلايا خميرة الأم لتسهيل التحقيقات الشيخوخة تنسخي. وتشمل الاستراتيجيات الوراثية النهج ذكية حدد ضد بقاء الخلية ابنة في عدد السكان. برنامج تخصيب الأم (MEP) ينطوي بيتا استراديول تحريض لجنة المساواة العرقية recombinase التعبير فقط في الخلايا الوليدة، مما أدى إلى تعطل ابنة محددة من اثنين من الجينات الضرورية التي تم هندستها لاحتواء المواقع loxP 12. يمكن زراعة سلالات MEP عادة في غياب محفز، ولكن سوف تستمر الخلايا الأم فقط لتقسيم التالية الاستقراء، في حين أن الخلايا ابنة سوف القبض على M-المرحلة عادة في أول تطور من خلال دورة الخلية 12. في حين أن هذا النظام لم يستخدم على نطاق واسع لدراسة تراكم الطفرة خلال الشيخوخة، قد تم استخدامها لدراسة فقدان تغاير الزيجوت، وهو شكل متكرر نسبيا من عدم الاستقرار في الجينوم سلالات الخميرة مضاعفا، فضلا عن التغيرات البيوكيميائية في الخلايا الأم الشيخوخة 13،14. وبالمثل، فإن النظام ابنة صواعق ينطوي التعبير ابنة محددة من S. cereviSIAE URA3 الجين 15. سلالات ابنة صواعق تنمو بشكل طبيعي حتى يتم اضافة 5-FOA إلى المتوسطة، في الخلايا الوليدة التي تعبر عن نقطة URA3 سوف يموت، بينما تستمر الخلايا الأم في النمو 15. هذه النظم مفيدة لإثراء للخلايا الأم، لكنها تعتمد على الحفاظ على وظائف الجينات التي تشكل نظام اختيار. الطفرات العشوائية في واحد أو أكثر من مكونات نظام اختيار يمكن أن يؤدي إلى الخلايا الوليدة التي تفلت اختيار وتتكاثر باطراد. خلال تطوير سلالات الهندسة الكهربائية والميكانيكية، وكانت أحجام السكان المناسبة مصممة على تجنب ظهور الخلايا الوليدة الطافرة التي يمكن الهروب من اختيار 12. ومع ذلك، هذا الحد في حجم السكان التنازلات الكشف عن أشكال نادرة من عدم استقرار الجينوم أثناء الشيخوخة تنسخي. هذه قيود على حجم السكان يمكن التغلب جزئيا باستخدام سلالات الخميرة مضاعفا مع نسختين من كل جين تسهم في نظام اختيار، لأن معظمأن الطفرات المتنحية من المرجح أن تكون 12. ومع ذلك، واستخدام سلالات مضاعفا يقيد أنواع الأحداث طفرية التي يمكن الكشف بسهولة مقارنة مع تلك التي يمكن الكشف عنها بسهولة في خلايا الخميرة فرداني.

وتشمل استراتيجيات الفرز المادية عزل الخلايا الأم مع سطح الخلية المسمى من خلايا ابنة غير المسماة إلى إثراء للسكان كبير من الخلايا الأم. ملاحظة أن بروتينات سطح الخلية (البروتينات جدار الخلية) من S. وتوليفها الخلايا الوليدة حديثا الخباز خلال مهدها تم استغلالها لتسمية الخلايا الأم دون وصفها الخلايا الوليدة التي ينتجونها 16. على سبيل المثال، السكان الأولي من خلايا الخميرة المسمى على سطحها مع البيوتين يمكن زراعتها ثم عزل من خلايا ابنتهما باستخدام بلي مكافحة البيوتين ومغناطيسية فرز 16 لأن الخلايا الوليدة الناتجة عن السكان الأولي لن يحتوي على البيوتين سطحها . النمو التسلسلي ويسمح الفرز السكان كبار السن تدريجيا الخلايا الأم التي يمكن الحصول عليها وتحليلها. وقد استخدم هذا الإجراء بنجاح لدراسة التغيرات في الخلية وعلم وظائف الأعضاء التعبير الجيني أثناء الشيخوخة تنسخي من الخميرة 13،14،17،18. الطريقة الحالية يتكيف هذا التوسيم البيوتين وتقنية الفرز المغناطيسي لإثراء للخلايا الأم مع غرض قياس تراكم الطفرات يمكن أن تكون نادرة أو عدم استقرار الجينوم أشكال أخرى يعاير من خلال التحديدات المظهرية. النمو التسلسلي والفرز المادي يسمح تحليل تراكم الطفرات في الخلايا الأم تدريجيا القديمة، وكذلك في سكانها خلية ابنة. تحديد معدلات طفرة في الجيل يسمح تردد طفرة المتوقع أن تحسب للخلايا الأم التي خضعت لعدد معين من الانقسامات الخلوية. منذ تستند القيم تردد توقع على الزيادة المتوقعة نتيجة للجولات إضافية من انقسام الخلايا، وانحرافات كبيرة في mutati احظعلى ترددات مقارنة مع القيم المتوقعة تقديم أدلة لإجراء تغييرات في سن معينة في معدل الطفرات تتراكم. باستخدام هذا البروتوكول، وتلطيخ الفلورسنت الندوب برعم التي تتوافق مع مواقع انقسامات الخلية على الخلايا الأم إلى جانب تحليل التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتحديد بسرعة التوزيع العمري للسكان فرزها والتي لم يتم فرزها. ويمكن أيضا الكواشف فلوري إضافية، مثل تلك المستخدمة للكشف عن أنواع الاكسجين التفاعلية، أن تستخدم خلال هذا البروتوكول. عموما، هذا البروتوكول يتيح تحليل الفعال للتغييرات التي تعتمد على العمر في عدم استقرار الجينوم مع احتمال ارتباط إلى خلية التغيرات الفسيولوجية المرتبطة بالسن في كائن نموذج مناسبة تماما لدراسة العوامل الوراثية والبيئية التي تؤثر المتعلقة بالشيخوخة عدم الاستقرار الجينوم.

البروتوكول

1. إعداد وسائل الإعلام وحلول

  1. تنمو الخلايا باستخدام خلاصة الخميرة، ببتون الجلوكوز (YPD) متوسطة غنية لبروتوكول قياسي. إعداد 2٪ bacto-ببتون، 1٪ خلاصة الخميرة، محلول الجلوكوز 2٪ للYPD المتوسطة وإضافة 2٪ bacto أجار لمتوسطة الصلبة 19. الأوتوكلاف لتعقيم. استخدام وسيلة بديلة، إذا لزم الأمر، لاختبار حالة نمو معينة أو سلالة متحولة الخميرة.
  2. جعل المتوسطة الكامل الاصطناعية الصلبة التي تفتقر إلى أرجينين مع 60 ملغ / L canavanine (SC-ARG + canavanine) لتحديد طفرات مقاومة للcanavanine. إعداد الحل الذي هو 0.67٪ bacto الخميرة قاعدة النيتروجين دون الأحماض الأمينية، والجلوكوز 2٪، 0.2٪ كاملة دون أرجينين ملحق خليط (مزيج التسرب)، و 2٪ bacto آجار 19. الأوتوكلاف وبارد قبل إضافة canavanine من 20 ملغ / مل محلول المخزون (فلتر تعقيم، تخزينها في 4 درجة مئوية) 19.
    1. جعل المتوسطة الكامل الاصطناعية الصلبة التي تحتوي على حمض 5 fluoroorotic (5 FOA). إعداد 500مل من الحل الذي هو 1.34٪ bacto الخميرة قاعدة النيتروجين دون الأحماض الأمينية، والجلوكوز 4٪، 0.4٪ كاملة خليط ملحق، و 0.2٪ 5 FOA وفلتر تعقيم 19. الأوتوكلاف 500 مل من حل bacto أجار 4٪، بارد لفترة وجيزة، ثم تخلط مع فلتر تعقيم 500 مل المحلول المغذي. استخدام وسائل الإعلام البديل المناسب لفحوصات طفرة أخرى.
  3. لوضع العلامات البيوتين، وجعل 500 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) محلول يحتوي على 137 ملي كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 2.7 ملم، 10.14 ملم ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم، و1.77 ملم ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 8. مخزن في 4 درجات مئوية والحفاظ على الجليد أثناء الاستخدام.
  4. جعل الأسهم البيوتين 5 ملي العذبة في المعقم والماء عالى النقاء.
  5. لإرواء وضع العلامات البيوتين، وجعل 500 مل من 1X PBS، 100 ملي الجلايسين. تخزين عند 4 درجات مئوية، والحفاظ على الجليد أثناء الاستخدام.
  6. اعتمادا على عدد من الخلايا المستخدمة ومدة التجربة، وجعل 1-2 L من العازلة حبة وضع العلامات التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X، 2 مم EDTA، 0.5٪ بوفيشمال شرق ألبومين المصل. فلتر تعقيم وعازلة الغاز دي. تخزين عند 4 درجات مئوية، والحفاظ على الجليد أثناء الاستخدام.
  7. إعداد 0.4٪ التريبان الأزرق الحل في برنامج تلفزيوني 1X، فلتر تعقيم، وتخزينها في RT لاستخدامها في القياسات بقاء الخلية.
  8. كميات صغيرة قسامة (~ 100 ميكرولتر) من جنين القمح راصة (WGA) المترافقة الفلورسنت لتخزين في -20 درجة مئوية في احباط ملفوفة (أو مبهمة) أنابيب microcentrifuge لاستخدامها في تحديد عمر الخلية.

2. تحديد الطفرة أسعار والتردد

  1. تحديد معدل الطفرات الأساسي لكل جيل الخلية باستخدام اختبارات التذبذب للخلايا نمت في ظل ظروف ثقافة القياسية. تنمو 7-11 تكرار 1 مل الثقافات من كثافة الأولى من 1،000-5،000 خلية / مل إلى مرحلة ثابتة في وقت مبكر (8 ~ 10 خلية / مل).
    1. لكل ثقافة تكرار، وتمييع الخلايا 1: 2،000 وتنتشر على 1-4 ميكرولتر المتوسطة غير انتقائي (YPD) لتحديد مستعمرة تشكيل وحدات / مل. بيليه المتبقية الخلايا في ~ 2،400 Xز لمدة 1 دقيقة في microcentrifuge وresuspend في 100 ميكرولتر المياه تنتشر على المتوسطة انتقائية لتحديد المسوخ. احتضان لوحات لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية قبل عد المستعمرات (ضبط فترة حضانة حسب الحاجة على أساس معدل نمو الخلايا).
    2. تحديد عدد من الطفرات مستقلة (م) التي وقعت في المحاكمة على أساس عدد من المستعمرات متحولة (ص) حصل على المتوسطة انتقائية. استخدام مقدر متوسط ​​ليا-كولسون لإيجاد م بالاستعاضة عن متوسط ​​عدد المستعمرات متحولة للبحث في الصيغة أدناه 9. ثم استبدال قيم م حتى الجانب الأيسر من المعادلة تكاد تكون معدومة.
      figure-protocol-1
    3. لتحديد معدل الطفرات، أولا حساب متوسط ​​عدد خلايا قابلة للحياة على نشر المتوسطة انتقائية بضرب مستعمرة تشكيل وحدات متوسط ​​/ مل من الثقافات تكرار وحجمالثقافة في انتشار مل المتوسطة على انتقائية. تقسيم قيمة م من الخطوة 2.1.2 بواسطة هذا متوسط ​​عدد خلايا قابلة للحياة للحصول على معدل طفرة في جيل الخلايا.
  2. حساب فردي عدد خلايا قابلة للحياة على نشر المتوسطة انتقائية لكل ثقافة تكرار في محاكمة كما هو موضح في الخطوة 2.1.3. تقسيم عدد من المستعمرات متحولة (ص) التي تم الحصول عليها للثقافة من قبل عدد من خلايا قابلة للحياة على نشر انتقائي المتوسطة للحصول على وتيرة الطفرة. استخدام متوسط ​​أو متوسط ​​من الترددات طفرة الفردية من الثقافات تكرار في الخطوة 2.1 كما تردد طفرة الأساسي.
  3. إجراء قياسات التردد قبل وبعد وضع العلامات خلايا البيوتين (الخطوات 3.2 و 3.4) لتحديد ما إذا كانت النتائج خطوة وضع العلامات في أي تغيير في وتيرة الطفرات التي سوف تحتاج إلى أخذها في الاعتبار عند اختبار للتغيرات في سن معينة في تراكم الطفرة.

3. البيوتين وصفها

  1. الحادي وREAK S. الخباز من الأسهم الجلسرين في -80 درجة مئوية على YPD المتوسطة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام.
  2. باستخدام طرف ماصة معقمة، وخلايا نقل من لوحة خط إلى 1 مل (أو أكثر) من حفظ المياه في الاعتبار أن 1-1.5 سم من جزء نمت غزيرا من خط سيعطي حوالي 10 8 خلايا. تحديد كثافة الخلية الدقيقة باستخدام عدادة الكريات.
  3. تسمية 10 8 خلايا لكل سلالة (أو حالة العلاج) لكل نقطة جمع الذي سيتم تحديد تردد طفرة أو حجم السكان كافية للحصول على ما لا يقل عن 5-10 المستعمرات متحولة في أخذ العينات على انتقائية المتوسطة (على أساس تردد طفرة من الخطوة 2.2). تشمل 10 8 خلايا إضافية لقياسات أساسية لكل سلالة / حالة.
  4. التسمية البيوتين وفقا للإجراءات القياسية من الشركة المصنعة، باستثناء استخدام 5 ملي الأسهم كاشف البيوتين والصخور بلطف أثناء الحضانة. تدور لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 3000 x ج لجميع الخطوات الطرد المركزي، قاينس الغزل في درجات حرارة أعلى من 4 درجات مئوية قد يؤدي إلى زيادة فقدان الخلية. بعد غسل النهائي، تعليق الخلايا إلى تركيز 10 8 المسمى خلية / مل في الماء.
  5. تحقق من صلاحية الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق. تمييع 10 ميكرولتر من الخلايا مع 23 ميكرولتر من المياه و 67 ميكرولتر من 0.4٪ أزرق التريبان في برنامج تلفزيوني 1X. احتضان لمدة 40 دقيقة على الأقل في RT قبل أن يسجل لايف (غير ملوثين) والميتة (الملون) الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  6. قياس القيم الأساسية لعدم الاستقرار الجينوم، عمر الخلية، وغيرها من الخصائص ذات الصلة (انظر القسم 5 و 6 و 7).
  7. نقل الخلايا المسمى البيوتين إلى 20 مل من YPD المتوسطة في 10 8 خلايا في دورق مخروطي (حوالي 5 × 10 6 خلية / مل). تنمو ثقافة (ق) 16-18 ساعة عند 20 درجة مئوية إلى الكثافة التقريبية ل10 8 خلية / مل (4-5 أجيال الخلية)، ولكن لا تسمح للخلايا للوصول إلى مرحلة ثابتة. استخدام أقصر فترة حضانة للنمو عند 30 درجة مئوية. المحافظة على البيوتين المسمى جملتعلمي في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة ساعات قبل إضافة إلى متوسطة، إذا لزم الأمر لتحسين توقيت فترة النمو والتحصيل.

4. الخرزة وصفها والفرز المغناطيسي

  1. بعد مرحلة النمو، وتمييع قسامة الثقافة لتحديد كثافة الخلية باستخدام عدادة الكريات. خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 3،000 ز س. تخلصي من طاف.
  2. غسل الخلايا قبل vortexing تعليق بيليه في 30 مل من العازلة حبة وضع العلامات، ثم الطرد المركزي وسكب قبالة طاف كما في القسم 4.1. تكرار غسل.
  3. و resuspend تماما الخلايا في 50 ميكرولتر عازلة حبة وضع العلامات لكل 10 8 مجموع الخلايا من قبل vortexing. إضافة 2 ميكرولتر حبات مغناطيسية في 10 8 مجموع الخلايا ودوامة لفترة وجيزة إلى المزيج. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة، عكس دوري لخلط (معدلة من بروتوكول الانترنت في http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ أ>).
  4. غسل خلايا ثلاث مرات مع 30 مل من العازلة حبة وضع العلامات.
  5. إضافة 0.5 مل حبة وضع العلامات عازلة في 10 8 مجموع الخلايا لفترة وجيزة دوامة بيليه على الإعداد المتوسط ​​فقط حتى يتم معلق الخلايا. يصب من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل لإزالة أي كتل الخلايا المتبقية. إذا لزم الأمر، وترك الخلايا على الجليد لمدة 1-2 ساعة قبل التحميل على العمود.
  6. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة الموصى بها للأعمدة لربط المغناطيسية، وغسل، وأزل الخلايا الأم المسمى حبة المغناطيسي. لزيادة الانتعاش من الخلايا المسمى، استخدم عمود واحد على الأقل في 2 × 10 9 مجموع الخلايا.
    1. إزالة أي فقاعات التي تحدث عند تحميل الأعمدة، كما أنها ستعمل على منع تدفق. إزالة واستبدال العمود على الفاصل بين يغسل لمنع الخلايا من أن تصبح محاصرين بين حبات (معدلة من بروتوكول الانترنت في http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
    2. انقاذ تتدفق من خلال من الخطوات ملزمة وغسل لتحليل الخلايا الشابة التي تنتجها الخلايا الأم، اذا شئت. التركيز الخلايا كما هو موضح في الخطوة 4.7.
    3. استخدام فواصل بأعمدة لمعالجة عينات متعددة في وقت واحد. أزل أعمدة متعددة من نفس العينة في نفس أنبوب جمع للحد من التعامل مع الوقت ويقلل فقدان الخلايا.
  7. التركيز خلايا الأم مزال بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح لكن كل 1 مل العازلة في 10 8 خلايا المسمى البيوتين الأصلية. دوامة لفترة وجيزة لتعليق الخلايا في عازلة المتبقية.
  8. تمييع قسامة من الخلايا وصمة عار مع الأزرق التريبان لتحديد كثافة الخلية وبقاء الخلية باستخدام عدادة الكريات (راجع الخطوة 3.5). حساب العدد الكلي للخلايا استردادها.
    1. إذا كان عدد الخلايا هو أعلى بكثير مما كان متوقعا، تمرير عينة شطف من خلال عمود آخر لمحاولة إزالة تلويث الخلايا الشابة.إذا كان عدد الخلايا هو أقل بكثير مما كان متوقعا، لتمرير تدفق حفظها من خلال عينة من خلال عمود آخر في محاولة لتحسين العائد من الخلايا الأم.
  9. استخدام الخلايا لإجراء المزيد من التحليلات، كما هو موضح في أقسام 5 6. وبدلا من ذلك، تنمو الخلايا في YPD مرق مرة أخرى لزيادة سنهم تكاثري (الخطوة 3.7) ومتابعة من قبل العلامات حبة والفرز (الخطوات 4.1-4.8.1)، دون تحتاج إلى تكرار وضع العلامات البيوتين.

5. تحديد العمر تنسخي

  1. تدور الخلايا لمدة 2 دقيقة في 5،000 x ج في RT لجميع الخطوات في هذا المقطع. وضع 25 ميكرولتر من الخلايا تعافى (~ 10 8 خلية / مل) في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي ويغسل مرتين مع 1 مل 1X PBS. نضح من طاف.
    1. ذوبان الجليد قسامة من WGA-المكورات، دوامة لخلط، وتدور لفترة وجيزة للقضاء على المجاميع البروتين. تعليق الخلايا في 180 ميكرولتر 1X PBS و 20 ميكرولتر من WGA مترافق إلى جزيء الفلورسنت لتسمية برعم ندوب على سطح عشرخلايا البريد. تغطية أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي مع احباط واحتضان مع هزاز لطيف عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. يغسل ثلاث مرات مع 1 مل 1X PBS.
  2. لالمجهري الفلورسنت، والشرائح التسمية وجبل في بروتوكول قياسي باستخدام عامل مكافحة تتلاشى. علاج تماما الشرائح في الظلام (إلى بضعة أيام) قبل أن ينتزع ساترة لتجنب حركة الخلية أثناء التصوير. الاعتماد على ندوب برعم لا يقل عن 50 خلايا لكل عينة للحصول على قياس تمثيلي من العمر الخلية. متجر الشرائح لمدة تصل إلى 1 في الشهر لعرض ندوب برعم، إذا لزم الأمر.
    1. بدلا من ذلك، تحديد شدة إشارة الفلورسنت من WGA-المكورات عن طريق أداء التدفق الخلوي في خلايا معلقة في 1 مل 1X PBS بعد الخطوة 5.1.2. استخدام 405 نانومتر ليزر الإثارة و530/30 نانومتر تصفية الانبعاثات مع 505 نانومتر مرشح تمريرة طويلة لWGA-اليكسا 488. تضمين عنصر تحكم غير ملوثين لجمع كل نقطة.
  3. ندوب الرسم البياني برعم على خلايا شابة والذين تتراوح أعمارهم بين الخلايا بواسطة المجهر تحسب علىالمحور الصادي ضد تطبيع المتوسط ​​الهندسي (الملون المتوسط ​​الهندسي / غير ملوثين الوسط الهندسي) من مضان WGA-مكورات من السكان الخلية نفسها على محور س. الحصول على معادلة خط الاتجاه الخطي لهذه العلاقة. لتجارب لاحقة، استبدل المتوسط ​​الهندسي تطبيع WGA-المكورات كثافة مضان من السكان خلية ل x في المعادلة وحلها لذ لتحديد متوسط ​​عمر خلية من عينة.

6. الطفرة التردد

  1. انتشار فرز الخلايا الأم معلق في المخزن من الخطوة 4.7 على YPD المتوسطة والمتوسطة انتقائية كما هو موضح في الخطوة 2.1.1. استخدام 1 مل من معلق الخلايا الأم للخلايا متوسطة وتدور انتقائية في 5،000 x ج لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: انتشار كميات أكبر من خلايا المخفف على YPD المتوسطة مع زيادة الخلايا في العمر لتعويض أعداد متزايدة من الخلايا غير قابلة للحياة وهرمة السكان في السن.
    1. احتضان YPD المتوسطة والمتوسطة لوحات مختارة منخطوة 6.1 عند 30 درجة مئوية لمدة 3 و 4 أيام، على التوالي. زيادة الحضانة زمنية تصل إلى أسبوع واحد لخلايا قديمة جدا أو سلالات تنمو ببطء. حساب تردد طفرة كما هو موضح في الخطوة 2.2.

7. حساب توقع الطفرة التردد لتنسخي نظرا العمر

  1. حساب متوسط ​​الزيادة في سن تكاثري من الخلايا المسمى البيوتين على مدى التجربة من خلال طرح متوسط ​​عمر السكان الخلية الأولي من متوسط ​​عمر الخلايا الأم فرزها لهذا النوع ذات الصلة. استخدام الأعمار خلية محسوبة في خطوة خطوة 5.2 أو 5.2.2.
  2. مضاعفة معدل الطفرات التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.1.3 من الزيادة في متوسط ​​عمر الخلايا المحسوبة في الخطوة 7.1. إضافة هذه القيمة إلى تردد طفرة الأساسي للسكان المحسوبة في الخطوة الأولي 2.2 لتحديد وتيرة الطفرة المتوقع للخلايا سن تكاثري ذات الصلة.

النتائج

رسم تخطيطي التدفق في الشكل رقم 1 يوضح الخطوات الشاملة لهذا الإجراء، بما في ذلك النقاط التي معدلات الطفرة، الترددات، وعمر الخلية تقاس. تحديد بدقة وتيرة ومعدل الطفرات (أو شكل آخر من أشكال عدم الاستقرار الجينوم) في السكان الخلية الشباب هو خطوة أولى مهمة، لأنه من الضروري لاختيار حجم السكان المناسب لوضع العلامات والفرز المغناطيسي. يمكن أن تنشأ قيم معدل التذبذب باستخدام الاختبارات 9. وأظهرت نتائج سبيل المثال لسلالات الخميرة في الخلفية الوراثية BY4741 20 المختارة للطفرات في الجين CAN1 التي تمنح مقاومة canavanine أو طفرات في الجين URA3 التي تمنح مقاومة ل5 FOA في الشكل 2. وقد نمت الخلايا عند 20 درجة مئوية لمدة ممثل تجارب معدل، وعند 20 درجة مئوية و 30 درجة مئوية لمدة التجارب تردد التمثيلية. واستخدمت هذه درجات الحرارة لسكان الخلية الأولي نماعند 30 درجة مئوية وبعد ذلك نمت عند 20 درجة مئوية لمدة ممثل فرز التجارب اللاحقة. كانت قيم معدل من محاكمات مستقلة قابلة للمقارنة لسكان الخلية الأولي والخلايا بعد وضع العلامات البيوتين لسلالة الذي يحتوي على الجين CAN1 في موقعه الطبيعي على كروموسوم V، ما يقرب من 32 كيلو قاعدة أزواج من التيلومير الذراع الأيسر ( www.yeastgenome.com ) ( الشكل 2A، والأعمدة الخزامى). كان معدل تحور CAN1 أعلى بكثير في السكان الأولي من سلالة الخميرة الثاني يحتوي على حذف الجين CAN1 من موقعه الطبيعي على كروموسوم V وإدخال CAN1 على الذراع الأيمن من الكروموسوم الثامن حوالي 25 كيلو قاعدة أزواج من التيلومير كانت 21 (الشكل 2B). CAN1 ترددات تحور الجين أيضا قابلة للمقارنة لسكان الخلية الأولي وخلايا البيوتين المسمى في أي درجة حرارة النمو (فايجوري 2A، والأعمدة الزرقاء). ومع ذلك، ترددات طفرة حصلت على 20 درجة مئوية وجدت لتكون أعلى من الترددات الطفرة عند 30 درجة مئوية. لاختبار ما إذا كان هذا التأثير كان محدودا لدرجة حرارة الجين CAN1، قمنا بقياس الطفرات في URA3 عن طريق اختيار لمقاومة 5 FOA باستخدام سلالة الخميرة التي لديها CAN1 إدراجها على الكروموسوم الثامن. لديه هذا النوع أيضا حذف URA3 من موقع طبيعي على كروموسوم V وإدخال URA3 على الذراع الأيمن من الكروموسوم الثامن حوالي 40 كيلو قاعدة أزواج من التيلومير 21. كانت ترددات طفرة أيضا أعلى عند 20 درجة مئوية لمدة URA3 في هذا الموقع الكروموسومات (الشكل 2C). وعموما، هذا يدل على أن درجة الحرارة يمكن أن يؤثر على نمو وتيرة الطفرات، ولكن لا يظهر وضع العلامات البيوتين أن تؤثر تردد الطفرة. لذلك، تحتاج معدلات الطفرات والترددات للسكان الأولي يتحدد في نفس تيمبي النموrature التي سيتم استخدامها لجولات من النمو والفرز. فإنه من المستحسن للتحقق من وضع العلامات البيوتين لا يؤثر عدم استقرار الجينوم قبل باستخدام بروتوكول للتحقيق في أنواع أخرى من الطفرات أو إعادة ترتيب الجينوم.

كما هو متوقع، فإن قيم معدل التحور هو مبين في الشكل 2A أقل عدة مرات من القياسات تردد المقابلة. يحدث هذا الاختلاف لأن معدل تحور يقيس الخلايا مع ظهور طفرات جديدة مع كل جولة من انقسام الخلايا، بينما التدابير تردد طفرة العدد التراكمي للخلايا متحولة في عدد السكان في نهاية فترة النمو. تظهر الأسعار وفواصل الثقة 95٪ لهذه التجارب أن النتائج استنساخه يمكن الحصول عليها باستخدام سبعة الثقافات تكرار في المحاكمة التي اقترح هو الحد الأدنى لعدد مكررات لهذا البروتوكول.

مرة واحدة يتم تحديد القيم وتيرة ومعدل الأولية، يجب أن يكون حجم السكان أتشاوسين الذي يضمن أن الخلايا كافية موجودة بعد جولات متعددة من الفرز لتحديد موثوق الترددات الطفرة. وصفها يبلغ عدد سكانها 10 8 خلايا في نقطة زمنية المراد تحليلها أثناء الشيخوخة من المناسب عند ترددات ومعدلات مماثلة لتلك التي تظهر في الشكل 2A. يعتمد هذا القرار أيضا على مدى كفاءة وصفت الخلايا الأم يتم استردادها بعد كل جولة من الفرز. كفاءة يتعافى خلايا الأم وصفت يمكن بسرعة وببساطة تقييمها باستخدام عدادة الكريات لتحديد عدد الخلايا مزال من الأعمدة لكل نوع ودراسة مورفولوجيا الخلايا. يتم توضيح نقطتين أساسيتين من كفاءة البيانات الانتعاش سبيل المثال (الشكل 3A): قد تظهر أرقام تعافى الخلايا أعلى من المتوقع بعد الفرز الأول، ومن المتوقع الفقدان التدريجي صغيرة من الخلايا مع استمرار الفرز. وأعلى مما كان متوقعا عدد الخلايا في بعض التجارب بعد النوع الأول يمكن احتياطULT من وضع العلامات من البراعم على الخلايا في السكان الأولي. خلية الخميرة مع برعم شأنه عادة أن سجل تبنى خلية واحدة عند تحديد عدد الخلايا لتسمية مع البيوتين. وسم براعم الحالية في عدد السكان الأولي، على الرغم من شأنه أن يسمح للخلايا التي تطور من تلك البراعم ليتم الاحتفاظ أيضا على أعمدة أثناء الفرز. تأثير هذا الحدث على تحديد كفاءة الانتعاش يعتمد على جزء من خلايا المبرعمة في السكان الخلية الأولي. والسبب الثاني المحتمل لعدد الخلايا العالي بعد الفرز واحد هو أن هناك يميل إلى أن يكون أكثر المبرعمة خلايا كبيرة في هذه المرحلة الزمنية التي يمكن الانتهاء من انقسام الخلايا أثناء الفرز. ونتيجة لذلك، براعم كبيرة لا تزال تعلق على الخلايا الأم قد يتم فرز ولكن بعد ذلك تظهر خلايا متميزة كما هو الحال عندما يتم فحص الخلايا مزال. في حين لوحظ فقدان بعض الخلايا مع كل جولة من النمو والفرز، يمكن للبروتوكول يؤدي إلى احتباس موثوق بها من 80-90٪ من الخلايا بعد كل جولة من لياليORTING. فمن يستحق كل هذا الجهد لممارسة الإجراء لضمان أن 80٪ أو أكثر من الخلايا المسمى يجري معزولة لتجنب الحاجة لتسمية السكان كبير دون داع الخلية الأولي. ولم علاج الخلايا مع الضغط الخفيف بعد الفرز الأول (1 ملي بيروكسيد الهيدروجين في YPD المتوسطة لمدة 30 دقيقة) لا يمنع استعادة كفاءة الخلايا جولات مع استمرار نمو والفرز، وإن كان هناك بعض التباين في الانتعاش للنوع الأول بعد الإجهاد (الشكل 3A).

التفتيش على مورفولوجيا الخلايا وقدرتها على البقاء أيضا مفيدة على حد سواء لتأكيد العزلة الناجحة للخلايا الأم والتخفيفات لتعديل / أحجام تستخدم عند نشر الخلايا على وسط غير انتقائية لتحديد كثافة وحدات تشكيل مستعمرة. خلايا الأم تزداد أكبر وأكثر على شكل غير منتظم مع تقدمهم في السن، مقارنة مع الخلايا الوليدة (الشكل 3B). لذا ينبغي أن تتألف العينات الخلية الأم في المقام الأول من واسع، IRRشكل egularly الخلايا كما تقدم التجربة من خلال كل جولة من الفرز. وجود العديد من الخلايا بيضاوية الشكل المنتظم يمكن أن تشير لا يتم فصلها أن الخلايا الأم كاف من الخلايا الوليدة. يجب بقاء الخلايا الأم أيضا تنخفض تدريجيا مع كل جولة من تزايد والفرز، على الرغم من قد لا يكون هناك الكثير من التغيير خلال أول 5-10 أجيال الخلية. عدد الخلايا قادرة على تشكيل مستعمرات يمكن أن تقلل بشكل كبير أكثر بكثير من عدد الخلايا التي تم تحديدها لتكون قابلة للتطبيق من قبل بعض شكل من أشكال تلطيخ المباشر لسلامة الخلية، وذلك بسبب تكوين خلايا هرمة. عندما تبدأ حيوية من خلال طريقة التلوين المباشر لأول مرة في الانخفاض (حوالي 80٪ أو أقل)، قد يكون من الضروري لضبط التخفيفات وأحجام تستخدم لقياس كثافة مستعمرة تشكيل وحدة تحسبا لانخفاض أكثر دراماتيكية في قدرة خلايا قابلة للحياة ل شكل مستعمرات (اثنين إلى عدة أضعاف الانخفاض).

وتحتاج الأعمار تنسخي من السكان فرزها والسكان السيطرة يتم تحديدها من قبل ويمكن تحليل البيانات تردد طفرة من خلايا الأم للتغيرات في سن معينة في معدل الطفرات تتراكم. ويمكن تحقيق ذلك من خلال الفرز اليدوي للندوب برعم على الخلايا الأم (الشكل 4) أو من خلال التدفق الخلوي لقياس إشارة للكشف كاشف برعم ندبة (الشكل 5). يمكن أن توصف ندوب برعم مع منخفضة نسبيا إشارة الخلفية باستخدام WGA-الفلورسنت تقارن (الشكل 4C). يبين الشكل 4A أن معظم الخلايا من التدفق من خلال عينات من إجراء فرز لديها صفر أو واحد برعم ندبة. الخلايا مزال من الأعمدة هي في معظمها خلايا الأم الذين تتراوح أعمارهم بين (أرقام 4B و 5). عادة،> 90٪ من الخلايا هي الخلايا الأم مزال، وهو ما يمكن ملاحظته بسهولة أكبر من التدفق الخلوي نتيجة في الشكل 5. الخلايا مع عدد قليل نسبيا من ندوب برعم (<6) OBTained بعد أكثر من جولتين الفرز يمكن أن تمثل تلويث الخلايا التي لم المسمى البيوتين التي خضعت بضع جولات من انقسام الخلية خلال الجولة ذات الصلة من النمو، بدلا من خلايا الأم التي يتم تقسيم ببطء شديد. التباين في سن الخلايا قد تزيد مع الجولات اللاحقة الفرز إن لم يكن كل الخلايا في السكان تتزايد بشكل موحد.

عدد السكان أكبر خلية يمكن استخدامها بسرعة أكبر لتقييم عمر الخلية إذا ثبت وجود علاقة خطية بين شدة إشارة WGA مضان وعدد من الندوب برعم لكل خلية. لهذا التحليل، يتم إنجاز تطبيع كل شدة إشارة WGA مضان بقسمة إشارة من الخلايا الملون بواسطة إشارة الحصول عليها بالنسبة للسكان غير ملوثين المناسب الخلية (ابنة أو أم) لحساب زيادة مضان الخلفية في الخلايا القديمة. أرقام 4 و 5 تحليل العرض من نفس السكان الخلية تمثيلي.العد اليدوي إنشاء متوسط ​​الأعمار تنسخي من 0.95 و 11.4 للخلية ابنة (الشكل 4A) والسكان الخلية الأم (الشكل 4B)، على التوالي. تم رسم تطبيع WGA إشارات لهذه التجمعات السكانية اثنين والسكان إضافي ثلاث (متوسط ​​أعمارهم بين 3.0، 6.9، و 14.4) مقابل متوسط ​​عدد ندوب برعم لكل السكان (الشكل 5B). ويمكن بعد هذه العلاقة الخطية استخدامها مع نفس السلالة والكواشف في التجارب المستقبلية لتحديد متوسط ​​عمر الخلية من تطبيع WGA إشارة الحصول عليها من خلال التدفق الخلوي، مما يتيح تحديد سريعة ودقيقة من عمر الخلية. لا يزال ينبغي إدراجها السكان السيطرة للتحقق الكفاءة تلطيخ مماثلة بين المحاكمات.

تأثير العمر على تراكم طفرات لا يمكن معالجتها مرة واحدة الخطوات السابقة للحصول على قيم معدل الطفرة، بكفاءة فرز الخلايا، وتحديد وإنجاز الأعمار الخلية. ونوmber من النقاط في الوقت الذي تردد يمكن تحديده يعتمد على حجم السكان الخلية المسمى البيوتين وعدد الخلايا التي تحتاج إلى نشر على انتقائية المتوسطة للحصول على نتائج موثوقة. إذا تغير معدل الطفرات مع تقدم العمر، ثم الترددات الطفرة الملحوظة للشيخوخة الخلايا الأم يجب أن تختلف عن تلك المتوقعة تستند فقط على جولات إضافية من انقسام الخلية. مقارنة بين تردد طفرة وحظ أن وتيرة طفرة تنبأ يمكن تحديد الفروق المرتبطة بالعمر في معدل الطفرات تتراكم. كما هو موضح في المادة 7 من البروتوكول، ويمكن الحصول على وتيرة وتوقع من المنتج من معدل الطفرات الأساسي للسكان الخلية الأولي والزيادة في سن تكاثري من الخلايا الأم تضاف إلى تردد طفرة للسكان الأولي. وقد لوحظت زيادات في CAN1 تردد طفرة مع زيادة متوسط ​​عمر خلية في سلالة مع CAN1 في موقعه الطبيعي على كروموسوم V(الشكل 6A) وسلالة مع CAN1 على الذراع الأيمن من الكروموسوم الثامن (الشكل 6B). منذ ترددات طفرة وحظ للخلايا الأم في الشكل 6A مماثلة لأو أقل بقليل من ترددات توقع، فإن البيانات لا توفر أي دليل لتغيير سن محددة في معدل الطفرات. في المقابل، كانت ترددات تحور الخلايا الأم من سلالة مع CAN1 على الكروموسوم الثامن أعلى من الترددات توقع (الشكل 6B). لاحظ أن ترددات توقع في الرسم البياني لا يبدو أن كثيرا بسبب زيادة نطاق سجل زيارتها لاستخدامها في المحور ص بسبب الزيادة الكبيرة في وتيرة التحول الملحوظ. ولذلك، فإن النتائج في الشكل 6B لم تقدم أدلة تدعم زيادة سن محددة في معدل الطفرات تتراكم. الفرق في النتائج لمجموعات البيانات في الشكل 6A و 6B ومن المرجح نتيجة لزراعية مختلفة استئجار مواقع الجينومية من CAN1. هذه الأنواع من الملاحظات توفر نقطة انطلاق لتطوير فرضيات لدراسة الآليات التي تؤثر على معدلات الطفرة كخلايا سن وتطوير نماذج لشرح تراكم الطفرات مع تقدم العمر تكاثري.

figure-results-1
الرقم 1. مخطط تدفق إجراء فحص شامل لتراكم الطفرات أثناء الخميرة الشيخوخة تنسخي. النص الأسود والسهام تشير الخطوات الرئيسية في الإجراء. يعكس السهم المنحني التي تستخدم جولات إضافية من إعادة نمو والفرز من نفس الخلايا للحصول على خلايا تدريجيا القديمة. الأرجواني السهام والنصوص تشير إلى الخطوات التي يتم إجراء القياسات المذكورة. التكرار - التردد.

تحميل / 51850 / 51850fig2highres.jpg "العرض =" 400 "/>
الرقم 2. تحديد تردد طفرة في معدل والسكان الخلية الشباب. وقد تم اختيار (A) المستعمرات متحولة عن طريق نشر الخلايا على SC-ARG + canavanine المتوسطة لتحديد لخسارة من وظيفة طفرات في الجين CAN1 وبالمقارنة مع العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة تنتشر على المتوسطة انتقائية لحساب الترددات / أسعار الفائدة. وقد نمت الخلايا من السكان الأولي قبل وضع العلامات البيوتين (IP) أو بعد وضع العلامات البيوتين (PB) باستخدام YPD المتوسطة من الكثافة الأولية من 5،000 خلية / مل في القريب التشبع. أعمدة الخزامى تشير قياسات معدل وتمثل الأعمدة الزرقاء قياسات الترددات التي قدمت في درجات الحرارة أشار (20 ° C و 30 ° C). وقد نمت مجموعات من سبعة الثقافات تكرار لكل محاكمة وأجريت 04:58 محاكمات مستقلة. وتظهر القيم الفردية يحسب معدل للمحاكمات مستقلة، وأشرطة الخطأ لهذه التجارب تمثل فترات الثقة 95٪ تحددد باستخدام آلة حاسبة على الانترنت 22. تمثل ترددات الوسائل والانحرافات المعيارية. معدلات (B) CAN1 حصلت طفرة وتمثل كما هو موضح الجزء ألف باستخدام سلالة مع CAN1 على الذراع الأيمن من الكروموسوم الثامن. الترددات (C) الطفرة التي تم الحصول عليها بعد اختيار المستعمرات متحولة في 5-FOA باستخدام سلالة مع الجين URA3 يقع على الذراع الأيمن من الكروموسوم الثامن. وكانت وسائل خلاف ذلك بالنسبة للجزء A، ويتم عرض وسائل والانحرافات المعيارية لمدة ثلاث أو أربع محاكمات مستقلة.

figure-results-2
الرقم 3. مثال فرز الكفاءة تحددها حساب عدد الخلايا مزال بعد كل جولة من الفرز. (A) والعدد الكلي للخلايا في كل السكان تبدأ بعد تم تعيين وضع العلامات البيوتين إلى واحد، ور تم تقسيم العدد اإلجمالي للخلايا الموجودة في عينات مزال من كل جولة من الفرز المغناطيسي خلية من تلك القيم الأولية للحصول على جزء من الخلايا المسمى. وتم تحديد إجمالي أعداد الخلايا من عدد الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام عدادة الكريات. الأعمدة البرتقالية تمثل المتوسط ​​والانحراف المعياري لثلاث محاكمات مستقلة بعد بروتوكول قياسي. الأعمدة الزرقاء تمثل المتوسط ​​والانحراف المعياري للتجربتين المستقلة التي تم علاج الخلايا مع 1 ملي بيروكسيد الهيدروجين لمدة 30 دقيقة مباشرة بعد الفرز الأول. (B) حجم ومورفولوجية الخلايا بعد وضع العلامات البيوتين (بعد البيوتين) والخلايا الأم تعافى بعد الجولة الثالثة من الفرز المغناطيسي (نوع الخلايا الأم 3) أظهرت باستخدام معيار مشرق المجهري المجال والهدف 20X. خطوط بيضاء في الخلفيات هي الخطوط التي تربط أصغر الساحات مرئية على عدادة الكريات القياسية.ك "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
وقد استخدم الرقم 4. تحديد سن تكاثري باستخدام اليدوي برعم ندبة العد. متحد البؤر المجهري لحساب ندوب برعم على خلايا فردية وصفت مع المكورات WGA-الفلورسنت (الإثارة في 488 نانومتر، والكشف مع 458/543 نانومتر تمريرة الفرقة و505 نانومتر تمريرة طويلة مزيج فلتر). (A) دليل التهم برعم ندبة من الخلايا من التدفق من خلال (الخلايا الوليدة) بعد الجولة الثالثة من الفرز المغناطيسي (ن = 62). (B) دليل برعم التهم ندبة الخلايا مزال (الخلايا الأم) بعد الجولة الثالثة من الفرز المغناطيسي (ن = 54). (C) الخلايا الأم احتفظت بعد الجولة الثالثة من الفرز المغناطيسي تصويرها باستخدام الهدف الغمر النفط 63X مع 3X التكبير بعد تلطيخ الطرافةهكتار المكورات WGA-الفلورسنت. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
وقد تم تحليل شخصية 5. تحديد سن تكاثري باستخدام التدفق الخلوي. عينات من 10،000 الخلايا الملون مع المكورات WGA-الفلورسنت التدفق الخلوي باستخدام الإثارة في 488 نانومتر، والكشف مع تمريرة الفرقة 530/30 و 505 مرشح تمرير مجموعة طويلة. (A ) المدرج الإحصائي تصور أعداد الخلايا مع شدة WGA مضان محددة لسكان الخلية ابنة أو شطافة (الخلايا الأم) بعد ثلاث جولات من الفرز المغناطيسي. السكان مماثلة لتلك التي تم تحليلها في الشكل 4. خطوط عمودية زرقاء تدل على موقف المقابلة لغالبية DAUتم حساب خلايا ghter على الرسم البياني الخلية الأم. (ب) الوسط الهندسي للتطبيع إشارة مضان من كل السكان هو مبين في ألف وثلاثة السكان إضافي من الخلايا (متوسط ​​أعمارهم 3.0، 6.9، و 14.4) ونسبة المتوسط ​​الهندسي لل الخلايا الملون والمتوسط ​​الهندسي للسكان الخلية غير ملوثين المناسب. يتم رسم هذه القيم في مقارنة لمتوسط ​​عدد من الندوب برعم لكل مجموع السكان (الشكل 4 والبيانات لا تظهر). ونظرا لقيمة R 2 لخط الاتجاه من هذه المقارنة على الرسم البياني.

figure-results-5
تم اختيار الشكل 6. مقارنة بين ترددات طفرة المتوقعة والتي لوحظت خلال الشيخوخة تنسخي. الخلايا مع طفرات في الجين CAN1 كما هو موضح في الشكل 2 النقيبز سلالات مع CAN1 في مكان طبيعي على كروموسوم V (A) أو على الذراع الأيمن من الكروموسوم الثامن (B). وقد نمت الخلايا في المتوسط ​​الصلبة عند 30 درجة مئوية قبل وضع العلامات البيوتين وعند 20 درجة مئوية بعد ذلك. وتظهر القيم المرصودة تردد مع الأعمدة البرتقال (أمراض النساء) والترددات المتوقع للخلايا سن تظهر مع الأعمدة البني (قبل). ويظهر العمود الأول لكل رسم بياني المتوسط ​​والانحراف المعياري وتيرة الطفرة الأولي بعد وضع العلامات البيوتين لأربع محاكمات مستقلة (PB). الأرقام أدناه الأعمدة تشير إلى متوسط ​​عدد ندوب برعم لكل السكان (خلية العمر). تم تحديد القيم المتوقعة مستقلة كما هو موضح في المادة 7 من البروتوكول باستخدام كل من القيم معدل الأولية هو مبين في الشكل 2A (الأعمدة IP) و 2B. وبعد ذلك بلغ متوسط ​​هذه القيم مستقلة. القيم المرصودة هي وسيلة من ثلاث محاكمات. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري.

المناقشة

هذا البروتوكول يجمع بين أساليب متعددة لتمكين الموارد والنهج تتوفر في خميرة الخباز نظام نموذجي ليتم تطبيقها بكفاءة لدراسة الجينوم عدم الاستقرار خلال شيخوخة الخلايا الإنقسامية. مجموعة واسعة من فحوصات لقياس أشكال مختلفة من عدم استقرار الجينوم من خلال اختيار المظهرية يمكن الجمع بين الفرز المغناطيسي لدراسة التغيرات في سن معينة ممكنة في تراكم أشكال معينة من الطفرات أو إعادة ترتيب الكروموسومات. بينما نهج كامل الجينوم التسلسل يمكن أن توفر مزيد من المعلومات حول أنواع الشاملة للتغيرات التي تحدث في الجينوم مع التقدم في العمر، والقدرة على استخدام النظم اختيار المظهرية للحصول على قياسات معدل الطفرات وعزل تفضيلي أنواع معينة من التغيرات الجينية من المزايا الهامة لدراسة الآلية جوانب المتعلقة بالشيخوخة الجينوم عدم الاستقرار. تبسيط تحديد عمر الخلية والقدرة على جعل قياسات موازية من physiologiالتغييرات كال من خلال توفير تدفق الخلوي سيلة فعالة لربط الجينوم عدم الاستقرار مع التغيرات الخلوية الأخرى خلال نطاقات عمرية محددة. تحديد التغييرات التي تعتمد على سن المحتملة في معدلات الطفرات تتراكم يتطلب: 1) تحديد دقيق لمعدلات السكان في خلية الصغار، 2) تحديد دقيق لعمر الخلية، و3) القدرة على تخصيب موثوق أعداد كبيرة بما فيه الكفاية للخلايا الأم لقياس بتكاثر عدم استقرار الجينوم في سن الشيخوخة. هذا النهج يسمح للنظام نموذجي الخميرة للمساهمة في تحديد الآليات الكامنة المسؤولة عن التغيرات التي تعتمد على سن في معدلات و / أو الترددات من عدم استقرار الجينوم في الخلايا النشطة ميتوتيكلي. وعلاوة على ذلك، والعوامل الوراثية والبيئية يمكن تقييم سريع للمساهمات التي تعتمد على سن الجينوم عدم الاستقرار. في نهاية المطاف، يمكن لهذه الأوصاف تؤدي إلى تطوير النماذج التي تمثل الطريقة التي الطفرات تتراكم خلال الشيخوخة تنسخي.

يعتمد هذا الأسلوب على القدرة على الكشف عن الطفرات أو أنواع أخرى من عدم الاستقرار الجينوم من خلال ظهور الظواهر اختيار لقياس معدلات مثل هذه الأحداث. ومع ذلك، يمكن الإبداع في تصميم فحص تسمح العديد من جوانب عدم الاستقرار الجينوم للتحقيق معهم. على سبيل المثال، يمكن وضع URA3 والجينات CAN1 في مواقع الجينومية مختلفة لاختبار أي تأثيرات موقع الجيني على النتائج. الارتداد من الأليلات محددة الجين غير وظيفية لالأليلات الجينات الوظيفية اختبارا خاصة عمليات طفرية. أيضا، يمكن استخدام إدخال الأليلات الخاملة متعددة من الجين أو الجينات المرافقة مع تكرار تسلسل الأحداث لدراسة إعادة التركيب من خلال استعادة أو فقدان وظيفة الجين، على التوالي. اختبارات تذبذب هي نهج موحد لتحديد معدلات مختلف هذه الأحداث عدم استقرار الجينوم 9. هو مكتوب بروتوكول باستخدام ليا-كولسون مقدر متوسط ​​قبلت جيدا واضحة نسبيا لتحديد مؤتةمعدل نشوئها لجعلها في متناول الباحثين متنوعة، على الرغم من MSS-الحد الأقصى لطريقة احتمال مقدر يعتبر أفضل طريقة لتحديد معدلات الطفرة 9. تم استعراض MSS-الحد الأقصى لاحتمال مقدر سابقا بالتفصيل 9، ويمكن استخدامها كطريقة بديلة، ولكن يتطلب حسابات أكثر تعقيدا. بدلا من ذلك، أحرز البرمجيات الحرة لحساب معدلات الطفرات مع هذا الأسلوب متاح 22. الحصول على تدابير استنساخه من معدلات الطفرة يتطلب الانتباه إلى عدة جوانب التصميم التجريبي، بما في ذلك استخدام الثقافات تكرار كافية، بتلقيح الثقافات في كثافة منخفضة بما فيه الكفاية الخلية الأولية التي يزداد حجم السكان حسب الكميات المناسبة ثقافة 10،000 أضعاف أو أكثر، واختيار بحيث كامل يمكن أن ينتشر السكان من الخلايا على المتوسطة انتقائية. لهذه النقطة الأخيرة، وهي صيغة سبق وصفها يمكن استخدامها لضبط معدل الطفرات على أساس جزء من الثقافة بصدد إجراء تجاربد 9. التباين في معدل نمو الثقافات يمكن تعقيد تحديد معدل الطفرات استنساخه، وتعديل مقدر القائم على الوسطية التي قد تسفر عن نتائج أكثر استنساخه في مثل هذه الحالات وصفت مؤخرا 23.

القدرة على قياس بدقة عمر الخلية هي عامل آخر مهم لتحديد ما إذا ترددات عدم الاستقرار في جينوم الخلايا القديمة تختلف عن القيم المتوقعة بسبب معدل الأحداث في الخلايا الشابة. لقد وجدنا WGA تلطيخ لتكون أفضل من تلطيخ calcofluor الأبيض، سواء من حيث الخلفية والمرونة، منذ WGA متاحة مترافق لجزيئات الفلورسنت مختلفة. يمكن هذه المرونة توفر المزيد من الفرص للقياسات في وقت واحد من خصائص الخلايا الأخرى مع الكواشف الفلورسنت. العمل الأولي لإقامة علاقة بين كثافة إشارة لتلطيخ WGA وعدد المقابلة من ندوب برعم على خلايا يمكن بعد ذلك أن يؤدي إلى المزيدتقرير سريع من العمر الخلية من خلال التدفق الخلوي. هذا النهج يسمح أيضا استخدام أحجام أكبر من السكان سيتم فحصها بواسطة المجهر عادة لتحسين استنساخ القياسات. بينما يمكن إجراء جميع القرارات العمر من خلال الفحص المجهري للخلايا، ونحن نشعر أن التدفق الخلوي نهج يسهل الكشف السريع للعوامل التي تؤثر تعتمد على سن الجينوم عدم الاستقرار.

بالإضافة إلى قياس عمر الخلايا بشكل موثوق، يحتاج إلى النظر إلى عدد من انقسامات الخلية يسمح خلايا الأم إلى الخضوع مع كل جولة متتالية من النمو وفرز الخلايا. استخدام لحجم السكان الأولي أصغر أو أكبر حجم الثقافة يمكن أن تسمح للخلايا للخضوع لمزيد من انقسامات الخلية قبل الوصول إلى كثافة الخلية المطلوبة. على سبيل المثال، استخدم باحثون آخرون جولتين فقط من فرز للحصول على خلايا الخميرة قديمة جدا 16، والتي لديها ميزة واضحة للحصول على الخلايا القديمة مع عدد أقل من experimeخطوات ntal. عند النظر في ما إذا كانت زيادة حجم الثقافة للسماح للخلايا لاستكمال المزيد من انقسامات الخلية قبل الفرز، ونأخذ في الاعتبار الحد على العدد الكلي للخلايا التي يمكن معالجتها في عمود واحد. استخدام وحدة تخزين الثقافة أكبر قد يتطلب استخدام أعمدة متعددة لفرز السكان خلية واحدة. أيضا، إذا الخلايا تخضع لجولات أقل من انقسام الخلايا بين نقاط أنواع / جمع، ثم هناك المزيد من الفرص لمراقبة الانحرافات عن الترددات الطفرة المتوقعة في نقاط زمنية متميزة خلال العمر. على سبيل المثال، وأخذ العينات فقط في وقت مبكر ونقاط الوقت خلال أواخر العمر قد تنتج البيانات مما يشير إلى زيادة مطردة في وتيرة الطفرة، ولكن أخذ العينات في أوقات مستقطعة إضافية خلال عمر قد تبين أن زيادة تواتر الطفرات بسرعة ثم الهضاب. ومع ذلك، لأن هذا البروتوكول يعزل خلايا الأم القديمة، هناك فرصة للحصول على قياس أكثر مباشرة التغيرات في معدلات الطفرات مع تقدم العمر. اختبارات تذبذب يمكن بالبريد أجريت باستخدام الخلايا الأم من مختلف الأعمار لتحديد ما إذا كان معدل التحور سوف تختلف عن معدل الحصول عليها باستخدام الخلايا الشابة. في حين أن الثقافات لهذه الاختبارات تذبذب سيصبح خليط من الخلايا القديمة والشابة لأنها تنمو، ويمكن أن يعزى أي انحرافات عن المعدلات التي تم الحصول عليها بدءا من خلايا شابة لاستخدام السكان انطلاق السن.

القدرة على الحصول على بتكاثر عدد كبير من السكان ما يكفي من خلايا الأم الذين تتراوح أعمارهم بين لقياس بدقة الجينوم عدم الاستقرار أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا النهج. بينما يصف بروتوكول استخدام نظام الفرز المغناطيسي معين لهذا الغرض، وفرز المجموعات الأخرى خلايا الخميرة الأم مع أنظمة بديلة 14،18 (انظر جدول المواد). وينبغي لهذه النظم البديلة أيضا العمل مع هذه الطريقة، على الرغم من بعض التحسين من البروتوكولات الصانعين قد تكون مطلوبة. بغض النظر عن نظام معين المستخدمة، وحجم السكان تتطلبد تختلف تبعا للتردد من نوع الطفرات أو إعادة ترتيب الجينوم المختارة للدراسة. على الأقل، يجب أن يكون هناك ما يكفي من خلايا الأم للحصول على مستعمرة متحولة واحد على الأقل لكل السكان لحساب تردد الطفرة. في الواقع، يمكن أن تكون النتائج مختلفة تماما إذا كان من المتوقع من حجم السكان، وحتى زيادة صغيرة في حجم السكان فقط صفر إلى خمسة المستعمرات متحولة، بحيث 09:55 المستعمرات متحولة من المتوقع، يمكن أن تحسن كثيرا التكاثر. عندما البيوتين وصفها السكان بدءا، وكفاءة الانتعاش لكل نوع بحاجة إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار للمساعدة في تحديد حجم السكان المناسب ضروري لقياس تردد طفرة في الخلايا الأم القديمة. مع استعادة 90٪ من الخلايا الأم بعد كل نوع، سيتم استرداد 59٪ فقط من السكان الأصلي بعد خمس جولات من النمو والفرز. تنخفض هذه النسبة إلى 33٪ ~ التعافي من السكان الأصلي بعد خمس جولات من النمو والفرز إذا فقط 80٪ من خلايا الأم وصفت واستردادإد خلال كل نوع. قياس وتعظيم الانتعاش أمر بالغ الأهمية عند قياس الأحداث التردد المنخفض، منذ 2-3 أضعاف الانخفاض في حجم السكان يمكن أن يؤدي بسهولة إلى أرقام يمكن الاعتماد عليها من المستعمرات متحولة في السكان.

هناك العديد من الخيارات لتوسيع أو تعديل هذا البروتوكول للحصول على فهم أوسع من عدم الاستقرار خلال الجينوم شيخوخة الخلايا الإنقسامية. وتشمل أمثلة بسيطة تحليل كيفية إحداث تغييرات في وظائف الجينات، التغيرات وسائل الإعلام، أو غيرها من التغييرات البيئية تغير حالة تراكم الطفرات مع تقدم العمر. سيتم قياس معدلات الطفرات للخلايا الشابة مع وظيفة الجينات المتغيرة أو في حالة ملائمة واستخدامها لتحديد ما إذا كانت الطفرات تتراكم بشكل مختلف من المتوقع في قيم معدل ومختلف عن السكان في خلية السيطرة. يمكن أن يتعرض السكان الخلية في نقاط مختلفة خلال الشيخوخة تنسخي لضغوطات معينة، مثل أنواع الاكسجين التفاعلية أو وكلاء ضررا DNA. ولم تعرض عابرة وخفيفة الى الاكسدة لا يغير كثيرا من القدرة على أداء الخلية الفرز (الشكل 3)، ولكن أقسى الضغوط قد تعقد الانتعاش من الخلايا. أن التجارب الأولية تكون ضرورية للتحقق من أن خلايا الأم ما زالت قائمة يمكن استردادها بكفاءة بعد ضغوط معينة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل الخصائص الخلوية للخلايا الأم المعزولة في التفاصيل، بما في ذلك مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية، مورفولوجيا الميتوكوندريا وفجوي، والخصائص الفسيولوجية الأخرى التي ترتبط مع الشيخوخة 3. وعلاوة على ذلك، يمكن للخلايا الأم أن يكون السكان بدءا لمزيد من العلاج أو التلاعب. منذ يتم فصل الخلايا الأم وابنتها جسديا أثناء الإجراء، والخلايا الوليدة لا تزال متاحة أيضا للتحليل. على سبيل المثال، التغيرات في الخصائص الفسيولوجية للخلايا ابنة الميراث أو غير المتماثلة من الجزيئات التالفة بين الأم الخميرة والخلايا الوليدة 24 إلى توقيت أي تغييرات مثيرة للاهتمام في طفرة الترددات / أسعار الفائدة. كما يمكن الحصول على ترددات تحور للسكان الخلية ابنته في محاولة لنمذجة ما إذا كان هناك وراثة غير المتماثلة من الطفرات أثناء الشيخوخة تنسخي. وخلاصة القول، والجمع بين تخصيب الخلايا الأم من خلال الخلايا المغناطيسية الفرز مع اختبارات تذبذب يتيح مزايا S. نظام نموذجي الخباز ليتم تطبيقها بكفاءة في التحقيق الآليات المسؤولة عن تراكم التغيرات الجينية خلال شيخوخة الخلايا الإنقسامية.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل في جزء من منحة R00AG031911 من المعهد الوطني للشيخوخة التابع لمعاهد الصحة الوطنية لحركة صحة الشعوب محتويات هذا المقال لا تعكس بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335100 مجم
ميكروبيدات مضادة للبيوتينMiltenyi Biotec130-090-4852 مل MicroBeads مترافقة مع الأجسام المضادة للبيوتين أحادية النسيلة (النمط المموي: الماوس IgG1) أعمدة
MACS LSMiltenyi Biotec130-042-40125 عمودا مناسبة لفاصل QuadroMACS
فاصل QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976فاصل فقط
QuadroMACS مجموعة بدءMiltenyi Biotec130-091-051يشمل: فاصل QuadroMACS (130-090-976) ، MACS MultiStand (130-042-303) ، أعمدة LS (130-042-401) ، رف أنبوب MACS 15 مل (130-091-052) ، وحدة واحدة 2 مل من MACS MicroBeads. ملاحظة: تشمل الأنظمة البديلة Dynabeads Biotin Binder و MagnaBind Magnetic Beads
BD Falcon Cell Strainer ، 40 & micro ؛ مBD Biosciences35234040 & micro; م للاستخدام مع BD Falcon 50 مل أنابيب مخروطية. 50 لكل عبوة
مسحوق Trypan BlueSigma-AldrichT6146، الترشيح بعد الذوبان مهم لإزالة الجسيمات
جنين القمح Alexa Fluor488Life TechnologiesW11261المترافقات ذات أطياف الإثارة / الانبعاث
المختلفة ProLong Gold الكاشف المضاد للبهتانLife TechnologiesP3693010 مل ، ويمكن أيضا استخدام الكواشف الأخرى المضادة للبهتان
التشغيل يمكن أيضا استخدام تراص

المراجع

  1. Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).
  2. Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability. J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).
  3. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metab. 16, 18-31 (2012).
  4. Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
  5. Madia, F., et al. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
  6. Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).
  7. Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11, 599-606 (2012).
  8. McMurray, M. A., Gottschling, D. E. An age-induced switch to a hyper-recombinational state. Science. 301, 1908-1911 (2003).
  9. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).
  10. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5"-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).
  11. Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates. Genetics. 91, 35-51 (1979).
  12. Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 183, 413-422 (2009).
  13. Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 7, e1002015(2011).
  14. Feser, J., et al. Elevated histone expression promotes life span extension. Mol Cell. 39, 724-735 (2010).
  15. Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations. Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).
  16. Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae. Cell. 84, 633-642 (1996).
  17. Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).
  18. Dang, W., et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan. Nature. 459, 802-807 (2009).
  19. Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  20. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  21. Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).
  22. Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis. Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).
  23. Wu, X., et al. A robust estimator of mutation rates. Mutat Res. 661, 101-109 (2009).
  24. Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299, 1751-1753 (2003).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Saccharomyces cerevisiae

مقالات ذات صلة