يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

15.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51857

⸱

أكتوبر 28, 2014

 , 
1Institute for Physiology, Pathophysiology, & Toxicology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke, 2Institute for Immunology & Experimental Oncology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke

في هذه المقالة

ملخص

ويشارك الكالسيوم في العديد من مسارات الإشارات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. تصوير الخلايا الحية يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون مضيعة للوقت. تم تحسين A، طريقة بسيطة سريعة باستخدام عداد الكريات تدفق لتحديد التغيرات النسبية في الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية ملتصقة جلبت الى تعليق.

الملخص

تتطلب مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، سواء الفسيولوجية أو الفيزيولوجية المرضية ، الكالسيوم أو تحكمه ، بما في ذلك إفراز الخلايا ، ووظيفة الميتوكوندريا ، وموت الخلايا ، واستقلاب الخلايا ، وهجرة الخلايا على سبيل المثال لا الحصر. عادة ما يتم الحفاظ على الكالسيوم العصاري الخلوي بتركيزات نانومولية منخفضة. بدلا من ذلك ، يوجد في تركيزات عالية من micromolar إلى millimolar في الشبكة الإندوبلازمية ومصفوفة الميتوكوندريا والحيز خارج الخلية. عند التحفيز ، تعمل الزيادة العابرة في الكالسيوم العصاري الخلوي على الإشارة إلى الأحداث النهائية. عادة ما يتم الكشف عن التغيرات في العصارة الخلوية باستخدام تصوير الخلايا الحية التي تم إعدادها باستخدام أصباغ ربط الكالسيوم التي تظهر إما زيادة في شدة التألق أو تحول في الطول الموجي للانبعاث عند ارتباط الكالسيوم. ومع ذلك ، فإن إعداد تصوير الخلايا الحية لا يمكن الوصول إليه مجانا لجميع الباحثين. تم تحسين طرق الكشف البديلة للخلايا المناعية مع قياس التدفق الخلوي وللخلايا الملتصقة غير المناعية مع قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية. هنا ، نصف طريقة محسنة وبسيطة للكشف عن التغيرات في الخلايا الظهارية باستخدام قياس التدفق الخلوي باستخدام صبغة ربط الكالسيوم ذات الطول الموجي الواحد. تم تحميل الخلايا الظهارية للنبيبات الكلوية القريبة الملتصقة ، والتي يصعب تحميلها عادة بالأصباغ ، بصبغة ملزمة للكالسيوم قابلة للاختراق للخلية الفلورية في وجود مسبار ، وتم إحضارها إلى التعليق ومراقبة إشارات الكالسيوم قبل وبعد إضافة thapsigargin و tunicamycin و ionomycin.

المقدمة

الكالسيوم هو رسول الثاني المهم مسؤولة عن نقل الإشارات الخلوية والفسيولوجية المرضية 1. يتم الاحتفاظ تركيزات الكالسيوم عصاري خلوي منخفض من خلال نشاط مضخات الكالسيوم والمبادلات الكالسيوم. و/ هيولي باطني أتباز شبكية الهيولى العضلية الكالسيوم (SERCA) الغيارات الشبكة الإندوبلازمية (ER) تخزين الكالسيوم كجزء من نظام "تسرب مضخة" في حين أن أتباز الكالسيوم غشاء البلازما (PMCA) يقذف الكالسيوم إلى الخلية مقصورة، سواء في الأدب ATP التي تعتمد على 2. رسل الفسيولوجية، مثل الهرمونات أو الناقلات العصبية، نقل إشارات من خلال مستقبلات البروتين G-جانب، وتفعيل فسفوليباز C، والتي تتحلمأ فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate (PIP2) في الغشاء البلازمي لتوليد مادة ال diacylglycerol واينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) 3. في حين لا تزال مادة ال diacylglycerol في غشاء البلازما، IP3 ينشر في العصارة الخلوية وتربط لمستقبلات IP3يتم تحريرها ل (IP3Rs)، والتي يتم تفعيلها يجند قنوات الكالسيوم، وجدت في الغشاء ER والكالسيوم من مخزن ER اللمعية وبلغت ذروتها في زيادة تركيز الكالسيوم عصاري خلوي 4. طريق بديل للكالسيوم للوصول إلى العصارة الخلوية هو من خلال قنوات الكالسيوم والمبادلات موجودة في غشاء البلازما. وقد وصفت الحديث المتبادل بين هذين القسمين: الإفراج الكالسيوم الناجم عن الكالسيوم (CICR) حيث يدفع الكالسيوم خارج الخلية إطلاق الكالسيوم من ER 5 مخازن، ومتجر يعمل دخول الكالسيوم (SOCE) حيث تفريغ مخازن ER هو الذي تشعر به STIM ويسبب افتتاح Orai قنوات الكالسيوم في غشاء البلازما لتعزيز إعادة تعبئة مخازن ER 6.

في ظل الظروف المرضية في جسم المريض، والاستجابة الخلوية هي زيادة الكالسيوم الكالسيوم تحرير سعر وعصاري خلوي في غياب محفزات الفسيولوجية 1. قد تتأثر الاستجابة الكالسيوم في عدد من الطرق: لفترة طويلة الكالسيومإشارة، تأخر إزالة الكالسيوم من العصارة الخلوية، ونضوب مخازن الكالسيوم أو تغيرات محلية في الكالسيوم. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا تأخذ على دور مركزي في التخزين المؤقت والإفراج عن الكالسيوم 7. لفترات طويلة و / أو فوق الأعظمي زيادة الكالسيوم عصاري خلوي يؤدي إلى موت الخلايا. في الحقيقة، الكالسيوم هو في كثير من الأحيان لا تشارك في الاستجابة المرضية الخلوية ويعد حدثا رئيسيا في مجموعة واسعة من الأمراض، مثل أمراض الاعصاب، أمراض القلب، والسرطان، وأمراض العظام وأمراض الكلى، والتي ترتبط بشكل رئيسي مع موت الخلايا وفقدان أو تغيير الجهاز أو الأنسجة ظيفة 8-10. وعلاوة على ذلك، وقد تم ربط اضطراب الإشارات الكالسيوم إلى التكيف الخلوي والتغيرات في الوظائف الخلوية والاستجابات.

تقليديا، يتم قياس اشارات الكالسيوم مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت سالبة الشحنة التي يتم تحميلها إلى الخلايا في خلية acetoxymethyl نفاذية (AM) شكل استر. مرة واحدة من قبل المشقوق esteras الخلويةوفاق، لا تزال المؤشرات الفلورسنت داخل حجرة داخل الخلايا وتزيد في كثافة مضان عندما يرتبط الكالسيوم. مؤشر الكالسيوم أكثر من المعروف جيدا والمستخدم هو ratiometric FURA-2 التي وضعها روجر تسين وزملاؤه 11. مؤشرات الكالسيوم مع اختلاف الانتماءات للكالسيوم تسمح حمامات الكالسيوم مختلفة ليتم رصدها. وتشمل طرق الكشف التصوير الخلية الحية، ومضان قارئ صفيحة ميكروسكوبية والتدفق الخلوي. حركية سريعة نسبيا من إشارات الكالسيوم (عادة في غضون بضع ثوان إلى دقائق) يجعل الخلية الحية التصوير أفضل طريقة لكسب أكبر قدر من المعلومات عن خصائص إشارة الكالسيوم. وبصرف النظر عن حركية السريعة للإشارات الكالسيوم (داخل ميلي ثانية)، تصوير الخلايا الحية هو أفضل طريقة لدراسة التقسيم الخلوي للإشارات الكالسيوم داخل خلية واحدة (12). ويمكن حساب تركيز الكالسيوم المطلقة من خلال تحديد الحد الأدنى والحد الأقصى مضان من الكالسيوم الصناعيةicator بإضافة الكالسيوم وخالب permeabilizing الخلايا، على التوالي، كما وصفها Grynkiewicz وآخرون 11.

وقد تم تطوير استخدام التدفق الخلوي لقياس اشارات الكالسيوم الأول في 1980s في الخلايا المناعية حيث الفرصة لقياس معلمات متعددة، مثل سلامة الغشاء والفصل بين سكان الخلية، وشرط من الخلايا في تعليق جنبا إلى جنب مع تطور الطول الموجي واحد مؤشرات الكالسيوم جعلت التدفق الخلوي وسيلة مثالية وconvenientdetection 13-15. في الخلايا الملتصقة، ويوفر تصوير الخلايا الحية على معظم المعلومات عن إشارات الكالسيوم، والأهم من حركية، ولكن يتطلب الإعداد معقدة تضم المجهر مضان، نظام نضح، والحفاظ على البيئة الخلوية، مثل درجة الحرارة، والبرمجيات المجهر المتخصص لاكتساب وتحليل البيانات. طرق بديلة مثل قارئ مضان صفيحة ميكروسكوبية أو pharmacolوسائل ogical من خلال استخدام chelators الكالسيوم هي لا تضاهى من حيث المعلومات المكتسبة. التدفق الخلوي أصبح أكثر استخداما لمراقبة الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الملتصقة مع ذلك، في معظم الدراسات، وتجرى القياسات فقط نقطة النهاية. باستخدام طريقة تم تطويرها في البداية من قبل جيرجيلي آخرون في الخلايا البائية المناعية 16، وقد تم قياس التغيرات في تركيز الكالسيوم عصاري خلوي مجانا عن طريق التدفق الخلوي مع حركية في الوقت الحقيقي ورصد كثافة مضان في الخلايا الفردية من سكان العينة بنجاح في سرطان الخلايا الظهارية والخلايا الجذعية السرطانية الهجينة 17. هذه الطريقة تم تكييفها للاستخدام في مزيد من الخلايا الظهارية ملتصقة، التي يصعب تحميل مع مؤشرات الكالسيوم 18.

هنا، وذلك باستخدام خط الخلايا الظهارية ملتصقة خلد المستمدة من قطاع S1 من النبيبات الدانية الكلى الفئران (WKPT-0293 Cl.2) 19، وصفنا لم مبسطة الأمثلethod لقياس التغيرات في تركيز الكالسيوم عصاري خلوي من خلال التدفق الخلوي. منذ العديد من الخلايا الظهارية تمتلك عددا من شركات النقل للمركبات الأيونية العضوية وتحميل خلايا مع مؤشر الكالسيوم يمكن ان يكون تحديا. لمنع هروب رأس المال من المؤشرات الكالسيوم، البروبينسيد، والمانع من تنميط النقل أنيون العضوية وضعت في الأصل لتقليل إفراز الكلى من البنسلين 20، يتم تطبيقها في وقت واحد في المتوسط ​​الحضانة. تتم المحافظة على الخلايا في الطبقات الوحيدة لتحميل مؤشر الكالسيوم، وجلبت الى تعليق والكالسيوم إشارات يمكن الكشف عنها على الفور بعد إضافة مركب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الكواشف وحلول

  1. تحضير محلول هانك لتعديل ومتوازن الملح (HBSS) (في ملي: 136.9 كلوريد الصوديوم، بوكل 5.37، 0.34 نا 2 هبو 4، 0.44 KH 2 PO 4، 4.17 NaHCO 3، ودرجة الحموضة 7.2، لا أحمر الفينول). تخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. جعل 1.5 M CaCl 2 و 2 M 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (الرقم الهيدروجيني 7.2) حلول الأسهم باستخدام الماء المقطر.
  3. إعداد محلول 250 ملم مخزون البروبينسيد. لشكل الحامض الحر (غالبا ما يشار إليها باسم المياه غير قابلة للذوبان)، ويحل مسحوق البروبينسيد في 1 N هيدروكسيد الصوديوم، وملء ثلاثة أرباع الحجم النهائي بالماء المقطر ويعاير إلى الرقم الهيدروجيني ببطء 7.4 مع 1 N حمض الهيدروكلوريك. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  4. حل نفاذية الغشاء الفلورسنت صبغة ملزمة الكالسيوم اللامائية في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى تركيز الأسهم من 1 ملم. تخزينها في -20 درجة مئوية في الظلام.
  5. قبل كل تجربة، وإعداد الطازجة التي تحتوي على H البروبينسيدBSS تدفق (هوكي) عازلة من خلال الجمع بين HBSS مع تعديل (في تركيزات النهائي) 1.5 ملي CaCl 2، 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.2 و 5٪ مصل بقري جنيني، 2 مم البروبينسيد، و 5.55 ملي الجلوكوز. الحارة إلى 37 درجة مئوية.

2. خلية ثقافة

  1. لوحة 2.5 × 10 5 خلايا الكلى القريبة أنبوب صغير (WKPT-0293 Cl.2) لكل بئر من صحن 6 لوحة جيدا أو 35 مم القياسية في مستنبت وتنمو لمدة 2 أيام التوصل إلى confluency من حوالي 70٪.

3. الكالسيوم صبغ تحميل

  1. لكل طبق بشكل جيد، أو مزيج 1 مل مستنبت تحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني، 4 ميكرومتر نفاذية الخلية الكالسيوم صبغة ملزمة و2 مم البروبينسيد.
  2. استبدال الثقافة المتوسطة مع 1 مل خليط الصبغة تحميل في كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2. تغطية لوحة بورق الألمنيوم لمنع تبييض مؤشر الفلورسنت.

4. إعداد سيLLS عن التدفق الخلوي

  1. دافئ 0.05٪-التربسين ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA) حل إلى 37 درجة مئوية.
  2. نضح الكالسيوم محلول الصبغة تحميل من كل بئر وإضافة 1 مل التربسين على طول جدار البئر.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل كل الخلايا.
  4. نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل وبيليه بواسطة الطرد المركزي في microcentrifuge في 10000 ز لمدة 1 دقيقة.
  5. نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
  6. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل عازلة PHF و resuspend pipetting صعودا وهبوطا.
  7. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 10000 ز لمدة 1 دقيقة.
  8. كرر الخطوات من 4.6. و 4.7. مزيد من مرتين.
  9. الخلايا resuspend في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر عازلة PHF واستخدام الخلايا للتجريب في حدود 1 ساعة.
  10. اختياري: خلايا العد لتحديد تركيز الخلية واستخدام 5 × 04-1 أكتوبر × 10 5 خلايا لكل قياس.

5. تدفق CYTإعداد ometer

  1. بدء تدفق عداد الكريات، فتح درج FLUIDICS والوجه تنفيس صمام التبديل تبديل لزيادة ضغط الهواء من خزان السائل غمد.
  2. "رئيس" أداة لإزالة فقاعات الهواء الإقامة المحتملة من داخل الأنابيب الداخلية وغرفة التدفق.
  3. في البرنامج التدفق الخلوي، وفتح نافذتين مؤامرة نقطة.
    1. يتطلب مؤامرة نقطة الأولى إلى الأمام الضوء المتناثرة (FSC) لX المعلمة والجانب الضوء المتناثرة (SSC) للمعلمة Y للسيطرة على نوعية الخلايا داخل العينة من خلال حجمها وتحبب، على التوالي.
    2. يقيس مؤامرة النقطة الثانية كثافة مضان من صبغ ملزمة الكالسيوم. حدد القناة كشف مضان المناسبة للمعلمة Y باستخدام مقياس لوغاريتمي والوقت بالثواني لX المعلمة على مقياس خطي.
  4. ضبط معدل تدفق إلى "مرتفع".

6. التدفق الخلوي Measurement

  1. إجراء القياسات في RT. في التدفق الخلوي أنبوب العينة (11.5 × 75 ملم)، وإضافة 480 ميكرولتر عازلة PHF.
  2. إضافة 20 ميكرولتر تعليق الخلية لفترة وجيزة دوامة لخلط.
  3. تحريك الذراع دعم أنبوب إلى الجانب ووضع أنبوب العينة على أنبوب حقن العينة حتى يتم تشكيل ختم مشددة. العودة الذراع دعم أنبوب إلى موقعها الأصلي محورها.
  4. تحسين القياس عن طريق ضبط قناة مضان مثل أن متوسط ​​كثافة مضان من العينة في حوالي 10 2 على المحور الصادي. حفظ واستخدامه في التجارب اللاحقة.
  5. لبدء التجربة، كرر الخطوات من 6،1-6،3.
  6. مضان خط الأساس القياسي لمدة 50 ثانية.
  7. وقفة القياس، إزالة أنبوب عينة، إضافة مجمع المصالح، ودوامة لفترة وجيزة والعودة إلى أنبوب حقن العينة. هذه الخطوة يجب أن لا يستغرق أكثر من 15 ثانية.
  8. استئناف القياس ويستمر لمدة ما مجموعه 204.8 ثانية.
  9. استخدام ط الكالسيومonophore، مثل ionomycin (10 ميكرومتر)، وخالب من الكالسيوم، مثل جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic (EGTA)، MnCl 2 أو 2 كوكلي (2 ملم)، عن الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي.

7. تحليل البيانات

  1. تحليل البيانات باستخدام برمجيات مخصصة التدفق الخلوي للتحليل غير متصل، مثل WinMDI (واجهة ويندوز متعددة وثيقة للالتدفق الخلوي)، مجموعة من البرامج المجانية التي وضعها جو تروتر في معهد سكريبس، مرفق التدفق الخلوي الأساسية.
  2. فتح مؤامرة نقطة مع SSC FSC والمعلمات.
  3. تحديد المنطقة الخلايا لتحليلها باستخدام "المناطق" أداة (انقر بالزر الايمن على الصورة) لاستبعاد الخلايا الميتة أو الحطام الخلية الموجودة في الزاوية السفلية اليسرى من تحليل البيانات (الشكل 1).
  4. تحليل رباعي (الشكل 2)
    1. فتح مؤامرة كثافة مع الوقت على محور س وكثافة مضان على المحور الصادي. استخدام كافة الأحداث.
    2. لناالبريد نفس المنطقة النابضة كما في 7.3.
    3. قياس البيانات باستخدام "كوادرانت" أداة.
    4. ضبط فواصل رباعي بحيث يوضع خط عمودي عند إضافة مركب ويتم وضع خط أفقي في وسط مضان خط الأساس في الضوابط. تأكد من أن المواقع من فواصل رباعي يساوي في جميع العينات.
    5. يتم عرض النسبة المئوية للخلايا في كل رباعي في كل ركن (الشكل 2). مقارنة الربع العلوي الأيمن (UR) بين العينات.
  5. تحليل الرسم البياني (الشكل 3)
    1. فتح بيانات التحكم في نافذة الرسم البياني مع كثافة مضان على محور س والأحداث على المحور الصادي. استخدام كافة الأحداث.
    2. لمحة تصويرية، إضافة بيانات الاختبار ليتم مقارنة مؤامرة السيطرة كما المؤامرات تراكب (اذهب إلى ملف فتح ملف → → → حدد ملف التراكب).
    3. للتحليل الكمي، رسم بياني واحد يفوزيجب استخدام دوز. بوابة السكان الخلية باستخدام المنطقة R1 من الخطوة 7.3.
    4. في السيطرة غير المعالجة، واستخدام وظيفة علامة ("العلامات") لتحديد المنطقة لتحليل بدءا من نقطة الوسط بين الحد الأدنى والحد الأقصى لمضان ذروة السيطرة وتنتهي في أقصى كثافة مضان. يتم حساب النسبة المئوية للخلايا في هذا المجال.
    5. استرداد البيانات من نافذة الإحصائيات. أكرر للبقاء ملفات البيانات باستخدام نفس المنطقة ملحوظة للتحليل.
  6. تحليل كثافة مضان (الشكل 4)
    1. فتح مؤامرة نقطة مع الوقت على محور س وكثافة مضان على المحور الصادي. استخدام كافة الأحداث.
    2. تمكين "وضع حركية" و "تراكب حركية الخط". سوف يظهر الخط الأزرق في مؤامرة نقطة الذي يمثل متوسط ​​كثافة مضان.
    3. قياس تدفق الكالسيوم النسبي من خلال خلق مناطق مستطيلة متعددة. ينبغي أن يكون لكل منطقة فصيل عبد الواحدidth حوالي "50"، وهو ما يعادل "10 ثانية". تحديد ما يصل إلى 15 مناطق مستطيلة.
    4. استرداد الكمي من نافذة الإحصاءات ونسخ في جدول بيانات.
    5. استخدام البيانات ذ يعني لتحليلها. حساب متوسط ​​R2 إلى R6، وهو ما يعادل 20 إلى 50 ثانية. هذه هي القيمة الأساسية.
    6. اختيار الفترة الزمنية المناسبة لتحليل تدفق الكالسيوم (يعتمد على بداية ومدة وشدة).
    7. حساب إشارات الكالسيوم من كل منطقة في غضون هذا الوقت الفاصل الزمني النسبي لقيمة أساسية المتوسط، أي إشارة مضان قبل إضافة مركب، والتي تم تعيينها إلى 100٪. تحديد المتوسط ​​والانحراف المعياري من المناطق إضافة إلى ذلك المركبة؛ هذا هو إشارة الكالسيوم يعني حركها المجمع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

زيادة الكالسيوم عصاري خلوي، طبقت اثنين من المركبات الدوائية إلى الخلايا الكلوية القريبة أنبوب صغير (WKPT-0293 Cl.2) محملة صبغة نفاذية الخلية الكالسيوم ملزمة، فلوو-3-AM. تم تحميل عينات السيطرة Nontreated مع الكالسيوم صبغة ملزمة بحضور البروبينسيد وكانت مختلطة ولكن من دون إضافة أي مركبات. Thapsigargin (TG) هو المانع الكلاسيكي للمضخة SERCA مما يؤدي إلى التسرب من ER وأدى إلى زيادة الكالسيوم عصاري خلوي. Tunicamycin (TUN) كتل N-بالغليكوزيل من البروتينات يؤدي إلى تنشيط استجابة البروتين تك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الكالسيوم هو الحدث الرئيسي في العمليات الخلوية متعددة بوصفها الثاني جزيء رسول الإشارات وأيضا كوسيلة للتواصل بين ER والميتوكوندريا. القدرة على قياس التغيرات في تركيزات الكالسيوم عصاري خلوي الحر هو تقنية مفيدة يمكن أن تنطبق على جميع مجالات بيولوجيا الخلية. هناك عدة طرق للكشف عن اشارات الكالسيوم عصاري خلوي. كلاسيكيا، وإشارات من مؤشر الكالسيوم ratiometric، مثل FURA-2، ويتم رصد في الخلايا الحية باستخدام الإعداد التصوير مضان وتركيزات الكالسيوم المطلقة يمكن استخلاصها من تحديد شدة الحد ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ويتم تمويل البحوث في المختبرات من قبل مؤسسة فريتز بندر، ميونيخ، ألمانيا (لTD) وجامعة ويتن / Herdecke منحة بحثية الداخلي (لجورج-KL). نود أن نشكر الأستاذ الدكتور الدكتور فرانك Thévenod (معهد علم وظائف الأعضاء، الفيزيولوجيا المرضية والسموم بجامعة ويتن / Herdecke) للحصول على اقتراحات مفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فلو -3 ، AMInvitrogenF-1241   ؛نفاذية الخلية
ProbenecidSigma-AldrichP-8761غير قابل للذوبان في الماء ، يذوب في 1 N هيدروكسيد الصوديوم
0.05٪ Trypsin-EDTA (1X)Invitrogen25300-062
IonomycinSigma-AldrichI9657
ThapsigarginTocris Bioscience1138
TunicamycinSigma-AldrichT7765
FACSCalibur مقياس التدفق الخلوي + برنامج CELLQuestلنظام التشغيل Becton Dickinson
Windows لقياس التدفق الخلوي (WinMDI)جو تروتر ، معهديرجى ملاحظة أن هذا تطبيق قديم 16 بت يقرأ الملفات المتوافقة مع FCS 2.0 ولكنه لا يتعرف على البيانات الرقمية FCS 3.0.
WKPT-0293 Cl.2 خط خلايا النبيبات القريبة للفئران الفيزياء الحيوية ، Case
جامعة ويسترن ريزيرف ، كليفلاند ، أوهايو)
واجهة المستندات المتعددة سكريبس متاح من قبل الدكتور أولريش هوبفر (قسم علم وظائف الأعضاء & amp;

المراجع

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
  2. Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
  3. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
  4. Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
  5. Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
  6. Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
  7. Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
  8. Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
  9. Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
  10. Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
  11. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  12. Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
  13. Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
  14. June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
  15. Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
  16. Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
  17. Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
  18. Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
  19. Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
  20. Beyer, K. H., et al. Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
  21. Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
  22. Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
  23. Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
  24. Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
  25. Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
  26. Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102(2010).
  27. Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
  28. Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

صبغة ربط الكالسيومبروبينيسيدثابسيكارجينتونيكامايسينأيونوميسينشدة الفلورةمعلق خلوي
قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.