مقالة منهجية

استخدام الميكروسكيل السيليكون الكابولي لتقييم مقلص الخلوية وظيفة في المختبر

DOI:

10.3791/51866

⸱

أكتوبر 3, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1NanoScience Technology Center, University of Central Florida

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استخدام الكابولي السيليكون الميكروسكيل والأسطح الثقافة طيعة لقياس انقباض خلايا العضلات في المختبر. انكماش الخلوي يسبب الانحناء ناتئ، والتي يمكن قياسها، وسجلت، وتحويلها إلى قراءات للقوة، وتوفير نظام غير الغازية وقابلة للقياس وظيفة مقلص في المختبر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتمد تطوير في المختبر فحوصات أكثر التنبؤية ذات الصلة وبيولوجيا على النهوض أنظمة زراعة الخلايا تنوعا التي تسهل عملية التقييم الوظيفي للخلايا المصنفة. تحقيقا لهذه الغاية، والتكنولوجيا ناتئ الميكروسكيل تقدم منصة التي لقياس وظيفة مقلص من مجموعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الهيكل العظمي والقلب، وخلايا العضلات الملساء، من خلال تقييم الانكماش الناجم الركيزة الانحناء. تطبيق صفائف ناتئ المضاعفة يوفر وسيلة لتطوير بروتوكولات معتدلة إلى عالية الإنتاجية لتقييم نجاعة الأدوية وسمية، النمط الظاهري المرض والتقدم، وكذلك العصبية والعضلية وغيرها من خلية خلية التفاعلات. توفر هذه المخطوطة التفاصيل لافتعال صفائف ناتئ موثوقة لهذا الغرض، والأساليب المطلوبة لخلايا بنجاح الثقافة على هذه السطوح. ويرد وصف إضافي بشأن الخطوات اللازمة لأداء وظيفي الشرجysis من أنواع الخلايا مقلص الحفاظ على مثل هذه المصفوفات باستخدام الليزر الرواية ونظام الصور كاشف. البيانات المقدمة تمثيلية يسلط الضوء على الدقة وطبيعة استنساخه من تحليل وظيفة مقلص ممكنة باستخدام هذا النظام، فضلا عن مجموعة واسعة من الدراسات التي يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا. اعتماد واسع النطاق الناجح لهذا النظام يمكن أن توفر المحققين مع وسائل لأداء والدراسات الوظيفية السريعة منخفضة التكلفة في المختبر، مما يؤدي إلى توقعات أكثر دقة لأداء الأنسجة، تطور المرض والاستجابة للعلاج علاجية جديدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت الزراعة في المختبر لخلايا العضلات من كل من المصادر البشرية والقوارض ممكنة منذ عقود1،2. ومع ذلك ، في حين أن مستحضرات الغطاء القياسية مفيدة للتقييم الكيميائي الحيوي ، إلا أنها لا تسهل تحليل الناتج الوظيفي الأساسي للخلية (الانقباض) ، وبالتالي فهي ذات قيمة محدودة إلى حد ما كوسيلة لتقييم النضج الخلوي وأدائه. من أجل تعظيم كمية البيانات التي يمكن الحصول عليها من هذه الثقافات المختبرية ، من الضروري المضي قدما في تطوير أنظمة قادرة على إيواء مثل هذه الخلايا في تكوينات تسمح بالتقييم في الوقت الفعلي لأدائها الوظيفي. أدى إنشاء العديد من نماذج العضلات ثلاثية الأبعاد إلى إحراز بعض التقدم نحو تلبية هذه الحاجة ، وقد تم استخدام هذه الأنظمة في عدد من المنشورات كوسيلة لتقييم القدرة الانقباضية لخلايا العضلات المستنبتة في المختبر3-5. في حين أن هذه الأنظمة لا تقدر بثمن لدراسات نمذجة الأنسجة وإعادة البناء ، إلا أنها محدودة في قابليتها للتطبيق على دراسات استجابات الخلية الواحدة. في مثل هذه الحالات التي تكون فيها دراسات الألياف المفردة ضرورية ، تظل منهجيات خارج الجسم الحي المعقدة وكثيفة العمالة هي الخيار الوحيد6-10. علاوة على ذلك ، فإن التحرك الحالي نحو تطوير منصات معقدة ومتعددة الأعضاء لتطوير الأدوية وبروتوكولات الفحص تتطلب إنشاء أنظمة غير جراحية وقابلة للتطوير بسهولة وتتكامل بسهولة مع الخلايا الداعمة ونماذجالأنسجة 11.

تقدم الكابولات الدقيقة < p class = 'jove_content'> طريقة بسيطة لتقييم القدرة الانقباضية الوظيفية للخلايا المفردة / مجموعات صغيرة من الخلايا12،13. تعتمد هذه التقنية على تقنية الفحص المجهري للقوة الذرية المعدلة (AFM)14 ، وتستخدم نظام الليزر والكشف عن الصور لقياس انحراف الكابولي على نطاق دقيق استجابة لنشاط انقباض الأنبوب العضلي المستنبت. ثم يتم استخدام معادلات ستوني المعدلة لحساب الإجهاد في الأنبوب العضلي ، والقوة التي يمارسها الأنبوب العضلي من أجل توليد انحراف الركيزة المرصود15. تمت كتابة برنامج مسح يمكن من التقييم المتزامن للمصفوفات الكابولية متعددة الإرسال ، مما يوفر تطبيقات متوسطة إلى عالية محتملة لدراسات سمية / فعالية الأدوية15 ، 16. قد تكون هذه التكنولوجيا لا تقدر بثمن في تطوير فحوصات وظيفية قبل سريرية للتنبؤ بفعالية الدواء في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فإن تصنيع رقائق الكابولي في السيليكون لا يعيق معالجة ما بعد التحليل للخلايا للمقايسات الجزيئية الحيوية القياسية مثل التلوين المناعي والنشاف الغربي و PCR.

توفر هذه المخطوطة تعليمات مفصلة حول تصنيع وإعداد ناتئ السيليكون المجهري ، وإعداد الأجهزة والبرامج ، وإرشادات التشغيل لتقييم وظائف الخلايا الانقباضية المزروعة على هذه الرقائق. يمكن تنفيذ تقنيات زراعة الخلايا القياسية لطلاء الخلايا وصيانتها على هذه الأسطح ، وبالتالي فإن أي نوع من الخلايا المقلصة التي توجد لها معلمات ثقافة موثوقة يجب أن يكون قادرا على الاندماج مع هذا الجهاز بسهولة. تجعل معلمات الثقافة ثنائية الأبعاد البسيطة نسبيا المستخدمة في هذا النظام تكامل نماذج الخلايا الأخرى أو إضافة أنواع الخلايا التي يمكن أن تتفاعل مع العضلات (مثل الخلايا العصبية المعصبة) بشكل مباشر ، مما يزيد بشكل كبير من قابلية تطبيق هذا النموذج في تطوير فحوصات وظيفية أكثر تعقيدا في المختبر ونماذج متعددة الأعضاء لأنظمة الثدييات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الكابولي تصنيع رقاقة

وقدمت تفاصيل مصورة من الخطوات تلفيق مبين في الشكل 1.

  1. وضع السيليكون على العازل (SOI) الرقائق في الفرن وتخبز على 125 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إلى يذوى منهم.
  2. إيداع 1.5 ميكرون طبقة سميكة من أكسيد السليكون على طبقة مقبض رقاقة SOI المجففة باستخدام البلازما تعزيز ترسيب الأبخرة الكيميائية (PECVD) الأداة.
  3. وضع رقاقة على تشوك تدور المغطي مع طبقة جهاز مواجهة. ضمان يتركز رقاقة، الاستغناء 2 مل من P20 التمهيدي في وسط الرقاقة، وتدور بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية. P20 التمهيدي يعزز التصاق مقاوم الضوء على طبقة الجهاز.
  4. بينما الرقاقة لا يزال على تدور المغطي تشاك، الاستغناء 2 مل من S1818 مقاوم الضوء في وسط الرقاقة، وتدور بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية إلى سbtain 1.5 ميكرون طبقة سميكة من مقاوم الضوء.
  5. وضع رقاقة على طبق ساخن وإجراء خبز لينة في 115 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  6. إجراء الصعب التعرض للأشعة فوق البنفسجية الاتصال باستخدام ضوئيه اتصال قناع اليجنر من أجل نقل نمط من قناع ناتئ إلى مقاوم الضوء على طبقة الجهاز. حساب زمن التعرض على أساس قيمة الطاقة تعرض 125 ميغا جول / سم 2 لS1818 مقاومة للضوء.
  7. تطوير مقاومة للضوء عن طريق غمر الرقاقة في 726 MIF مقاومة للضوء المطور لمدة 1 دقيقة في حين تهز بلطف الرقاقة ذهابا وإيابا.
  8. شطف الرقاقة مع دي المتأينة (DI) المياه وجففه، ويفضل استخدام أداة مجفف تدور شطف (SRD).
  9. إزالة مقاوم الضوء من حافة الرقاقة (حتى 5 مم من الحافة) باستخدام قطعة من القطن مغموسة في الأسيتون.
  10. تحميل الرقاقة في أعماق رد الفعل ايون إحفر (DRIE) أداة، مع الجانب مقاوم الضوء مواجها لها، وتشغيل وصفة لحفر طبقة السيليكون نمط من خلال ديفيطبقة م. وظائف طبقة أكسيد دفن كما توقف حفر، بحيث تؤدي إلى حفر مع 50٪ إلى 100٪ أكثر من دورات ومن المتوقع أن تكون ضرورية لضمان حفر كاملة.
  11. وضع رقاقة في حل حمام مقاوم الضوء الساخن لمدة 20 دقيقة لتجريد مقاومة للضوء. نقل الرقاقة إلى السريع تفريغ الشطاف (QDR) لشطف الرقاقة بالماء DI. بعد الشريط ضوء، تحميل الرقاقة في أداة SRD لشطف وتجفيف رقاقة. تفقد الرقاقة تحت المجهر لضمان ظهور نمط ناتئ كما هو متوقع.
  12. إيداع 1 ميكرون طبقة سميكة من أكسيد السيليكون مخدر الامم المتحدة على طبقة من جهاز الرقاقة باستخدام أداة PECVD. وظائف هذه الطبقة أكسيد كطبقة واقية للالكابولي خلال مزيد من خطوات المعالجة.
  13. وضع رقاقة على تشوك تدور المغطي مع طبقة مقبض مواجهة لبدء معالجة الجانب الخلفي من الرقاقة. ويتركز ضمان يفر، الاستغناء 2 مل من P20 التمهيدي في وسط الرقاقة، وتدور بسرعة 3،000 دورة في الدقيقةلمدة 60 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية.
  14. بينما الرقاقة لا يزال على تدور المغطي تشاك، الاستغناء 2 مل من SPR220-4.5 مقاوم الضوء على مركز الرقاقة، وتدور بسرعة 2000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية في تسارع من 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية للحصول على 6.5 ميكرون طبقة سميكة من مقاومة للضوء.
  15. وضع رقاقة على لوحة القرب الساخنة لإجراء خبز لينة في 115 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  16. باستخدام اتصال اليجنر ضوئيه قادرة على الجبهة / محاذاة إلى الوراء، محاذاة قناع نافذة المؤخر إلى الجانب الأمامي نمط ناتئ وإجراء اتصال الصعب التعرض للأشعة فوق البنفسجية من أجل نقل نمط من قناع نافذة المؤخر لمقاوم الضوء على طبقة المقبض. استخدام وقت التعرض محسوبة على أساس قيمة الطاقة تعرض 480 ميغا جول / سم 2 لSPR220-4.5 مقاومة للضوء.
  17. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، دعونا لا تزال رقائق في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة قبل الخطوة تجهيز المقبلة.
  18. تطوير مقاومة للضوء عن طريق غمر الرقاقة فيمطور 726 MIF مقاومة للضوء لمدة 2 دقيقة في حين تهز بلطف الرقاقة ذهابا وإيابا.
  19. شطف الرقاقة مع دي المتأينة (DI) المياه وجففه، ويفضل استخدام أداة مجفف تدور شطف (SRD).
  20. وضع الرقائق في الفرن على 90 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
  21. حفر طبقة أكسيد السيليكون على مساعدات من الرقاقة باستخدام نظام ري مع الغازات المفلورة وصفة لأكسيد الحفر. أكسيد نقوش على مساعدات من الرقاقة بمثابة قناع حفر لمزيد من المعالجة. تفقد رقائق تحت المجهر للتأكد من أن أكسيد السيليكون في الإطار يتعرض هو محفورا تماما.
  22. إزالة مقاوم الضوء على حافة الرقاقة (حتى 5 مم من الحافة) باستخدام مسحة غرفة نظيفة مغموسة في الأسيتون.
  23. تحميل الرقاقة في أداة DRIE مع وتشغيل وصفة لحفر طبقة نمط مقبض على عمق 500 ميكرون مع دفن عمل طبقة أكسيد كما توقف حفر. تقسيم هذا حفر في أشواط متعددة لمنع التدفئة المفرطة للويفر، الذي يسبب النقش يتعارض من السيليكون. هذه الخطوة حفر يزيل تماما السيليكون تحت الكابولي.
  24. إجراء خطوة الحفر الرطب باستخدام 25٪ مخفف HF منمش، لتجريد طبقة أكسيد دفن تحت الكابولي وطبقة واقية أكسيد على أعلى من الكابولي.
    ملاحظة: هذه الخطوة النشرات السطح السفلي من الكابولي السيليكون ويفتح نافذة تحت لتوفير الوصول إلى سبر ناتئ مع الليزر أيضا.
  25. شطف الرقاقة باستخدام سلسلة من حمامات المياه DI والجافة بعناية مع النيتروجين. منذ يتم دعم الكابولي فقط في قواعدهم، لا تستخدم البخاخات قوية من المياه DI أو غاز خامل مباشرة على الكابولي.
  26. يلتصق رقائق الفردية من الرقاقة على غرار يلتصق تنتج أثناء الخطوة مقبض طبقة حفر.

الثقافة 2. خلية

  1. إعداد 13F coverslips وفقا للأساليب المنشورة سابقا 17.
    ملاحظة: إذا 13F كوفrslips غير متوفرة، أي سطح مسعور مع زاوية الاتصال فوق 95 درجة يمكن استخدامها.
  2. تعقيم رقائق ناتئ و13F coverslips في محلول الإيثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف في غطاء تدفق.
  3. وضع رقائق ناتئ الفردية على رأس 13F coverslips داخل القياسية 12 لوحة جيدا.
  4. معطف الكابولي مع البوليمر الحيوي أو تعديل سطح الأمثل لنوع من الخلايا المستخدمة وفقا لبروتوكولات الثقافة الخلية القياسية.
  5. إعادة تعليق الخلايا في المتوسط ​​من نمو محددة إلى التركيز المطلوب.
    ملاحظة: هذا البروتوكول ينتج عنه عدد كبير من الخلايا التي تقع من خلال النافذة ناتئ وعدم التزامها سطح ناتئ المطلوب. ولذلك ينبغي الاستعدادات خلية 3-4x أكثر تركيزا من الاستعدادات لساترة القياسية. على سبيل المثال، عادة ما يتم تنفيذ البذر الخلايا الأقمار الصناعية الفئران العضلات والهيكل العظمي من استخدام كثافة البذر من 500-700 خلية / ملم مربع 15،16، وتستخدم مع ركائز ناتئ في 2،000 خلية / ملم مربع. ينبغي إجراء تجارب الأمثل للخروج مع مصادر خلية جديدة للتأكد من كثافة البذر المناسبة.
  6. ماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية على سطح رقاقة ناتئ، وضمان فقاعة متوسطة تغطي النوافذ ناتئ تماما. إذا كان الفتائل المتوسطة من خلال النافذة ولا تشكل فقاعة ثابتة على رأس الكابولي استبدال ساترة 13F وreattempt الطلاء.
  7. نقل لوحة تحتوي على رقائق إلى حاضنة والسماح للخلايا الالتزام لمدة 1 ساعة على الأقل (يفضل 2-3 ساعة).
  8. بعد هذه الفترة والطلاء، واستخدام ملقط معقم لنقل الشريحة إلى بئر نظيفة، دون ساترة 13F، وأعلى حتى الثقافة مع 1 مل من وسط النمو.
  9. العودة إلى لوحة الحاضنة.
  10. الحفاظ على خلايا وفقا لبروتوكول بهم القياسية للصيانة في المختبر coverslips على. لخلايا عضلات الهيكل العظمي،تبديل التركيب المتوسط ​​للحث على تشكيل myotube مرة واحدة سوف تصبح خلايا متكدسة يكون ضروريا.

3. الإعداد من الأجهزة والبرامج لتحليل الكابولي الإمالة

  1. وضع صحن الثقافة ساخنة في مرحلة مجهر تستقيم الكهربية.
  2. إضافة 3 مل من المتوسط ​​التغذية وعلقت الخلايا حاليا في (+ 10 ملي HEPES) إلى مرحلة المجهر ساخنة.
  3. جبل الأقطاب الفولاذ المقاوم للصدأ من الداخل من صحن الثقافة ساخنة على مسافة فصل 15 ملم وربطها مولد النبض، قادرة على إنتاج البقول التحفيز مجال متفاوتة الشدة، والتردد، والموجي، للسماح للنظام التحفيز لإنتاج الحقل الخلايا عند الاقتضاء.
  4. الترباس ليزر الهليوم النيون، التي شنت على مراحل XY متعدية، على الجانب السفلي من الجدول المجهر وتعديله بحيث يتم توجيه شعاع الليزر من خلال قاعدة الطبق الثقافة ساخنة في اقاربهم 30 ° زاويةالبريد إلى الطائرة من ناتئ.
  5. ينشق وحدة نمطية الصور كاشف رباعي، التي شنت على مراحل XY متعدية، على الجانب السفلي للمرحلة المجهر وضبط الموقف بحيث ينعكس شعاع الليزر الأراضي في وسط ال 4 أجزاء. الشكل 2 لمحة عامة عن الأجهزة التي أنشئت اللازمة لتنفيذ بروتوكول صفها.
  6. كتابة برنامج برنامج للتحكم في المحركات الخطية التي تفحص عبر الكابولي. كتابة برنامج حاسوبي مع الإشارة إلى الرسم البياني الوارد في الشكل 3. يتم توفير واجهة رسومية برمجتها للاستخدام مع هذا النظام في الشكل 4.

4. تسجيل الكابولي انحراف البيانات

  1. تشغيل أجهزة تحليل ناتئ والبرمجيات المرتبطة بها.
  2. إدراج المرحلة الثرمستور ساخنة في الوسط وانتظر لقراءة 37 درجة مئوية.
  3. تضاف شرائح ناتئ إلى مرحلة مع cantileveRS موجهة نحو الجانب الأيمن من المسرح.
  4. بدوره على مصدر ضوء المجهر.
  5. التركيز المجهر لجعل حواف الكابولي في طريقة العرض واستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف لوضع شعاع الليزر على طرف ناتئ 1. ملاحظة: إذا افترضنا أن الكابولي موجهة إلى يمين المسرح، ناتئ 1 هو واحد المتمركزة في أعلى يسار مجموعة وأرقام الجري إلى 16 في الجزء السفلي الأيسر. 17 ناتئ هو في المكان المناسب العلوي ويمتد إلى 32 في أسفل اليمين (الشكل 5A).
  6. اضغط على "اللعب" على برنامج تسجيل.
  7. ضع الصور كاشف بحيث يقرأ إشارة "0" في كل من س و ص إطارات من خلال تعديل المحركات السائر التحكم في الصور كاشف.
  8. تحديد موقف ناتئ 1 في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف (الشكل 4).
  9. نقل الليزر لطرف ناتئ 16، كرر الخطوة 4.7، ووضع cantilevإيه 16 وظيفة في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
  10. نقل الليزر لطرف ناتئ 32، كرر الخطوة 4.7، ووضع ناتئ 32 موقف في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
  11. نقل الليزر لطرف ناتئ 17، كرر الخطوة 4.7، ووضع ناتئ 17 موقف في برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
  12. إيقاف مصدر ضوء المجهر وضوء النفقات العامة في المختبر.
  13. اضغط على "سجل" على برنامج تسجيل.
  14. تعيين الأجهزة مولد النبض إلى 40 ميللي ثانية، 5 V البقول على تردد 1 هرتز، وتحويل الجهاز على.
    ملاحظة: اختياريا، وتوظيف بروتوكولات التحفيز الأمثل لمصادر معينة من الخلايا في هذه المرحلة، إعدادات المعلنة المبادئ التوجيهية استنادا إلى البيانات التي تم جمعها باستخدام مصادر بشرية وخلية القوارض 12،13،15،16.
  15. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف، تعيين الأجهزة لمسح عبر مجموعة 32 ناتئ، ووقف لمدة 5 ثانية في كل يومه.
  16. عند الفحص من 32 الكابولي كاملة، إيقاف المنبه، ثم وقف برنامج تسجيل وطرح ملف البيانات.
  17. دراسة أثر المسجلة من كل ناتئ عن أدلة على النشاط مقلص. تقديم مذكرة من كل ناتئ بردود فعل إيجابية. يتم تعريف الانكماش بمثابة الذروة إذا كان الانحراف هو 0.1 V على الأقل فوق خط الأساس.
  18. إزالة أي الكابولي عدم استجابة من بروتوكول المسح على برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر / الصور كاشف.
  19. ويمكن بعد ذلك إعادة فحص والكابولي النشطة دون التحفيز من أجل الحصول على قراءة من النشاط العفوي مقلص الخلية.
  20. تشغيل المسح الضوئي مع أو بدون التحفيز الكهربائي مجال واسع، بعد إضافة مركب العلاجي إلى المتوسطة من أجل مراقبة تأثيره على الناتج الوظيفي للخلايا المستزرعة.
  21. إجراء تقييمات التعب من خلال تحفيز الخلايا كهربائيا لفترات طويلة ومستويات المسح الضوئي للمقاولات actility لقياس الزمن الذي يستغرقه لاستخدام القوة لإسقاط الذروة دون عتبة معينة.
  22. في التجارب حيث تتم المحافظة على الخلايا العصبية الحركية في ثقافة مشتركة مع العضلات، وقياس تشكيل تقاطع العصبي العضلي من خلال علاج العصبون الحركي-myotube ناتئ المشترك الثقافات مع المنشطات العصبية (مثل الصوديوم) أو مثبط متشابك (على سبيل المثال، D-توبوكورارين) والمسح الضوئي لل الزيادة والنقصان في النشاط العفوي على التوالي 16.
  23. القيام بمسح محددة وفقا لما تمليه احتياجات التجارب المخطط لها.

5. تحليل البيانات الكابولي الإمالة

  1. استخدام تعديل المعادلات ستوني في 15 (مفصلة أدناه) لتحويل البيانات ناتئ الخام انحراف (في فولت) في قراءات الضغط في طبقة الخلايا أو myotube (قراءة الضغط بمقياس الباسكال)، والقياس المباشر للقوة مقلص الخلوية (في نانو نيوتن):
    إعلان / 51866 / 51866eq1.jpg "/> المعادلة 1
    figure-protocol-1 المعادلة 2
  2. حيث δ = طرف ناتئ انحراف والإجهاد التي تنتجها myotube، σ ج = الإجهاد التي تنتجها myotube، على افتراض فيلم سميكة موحد العرض الكامل للناتئ، C = كاشف معامل الخاصة بالنظام المتعلقة الجهد لوضع الليزر على الصورة -detector، θ = زاوية الليزر وكاشف نسبة إلى الطائرة من ناتئ، E سي = معامل مرونة من السيليكون، تي سي = سمك من ناتئ، ر و = سمك myotube، ضد سي = نسبة السم لل السيليكون، L = طول الكابولي، P = طول طريق الليزر من ناتئ تلميح إلى كاشف، وث الشكل 6.
  3. على افتراض myotube هو فيلم موحدة، قوة في myotube تساوي القوة في الفيلم، مما يؤدي إلى المعادلة 3، عن طريق المساواة بين حساب القوة من الإجهاد ومنطقة يفترض عبر خلية المقطع الذي تم استخدامه لتطبيق في ستوني المعادلة.
    figure-protocol-2 المعادلة 3
  4. وبعد جمع البيانات وظيفية، إصلاح رقائق ناتئ لتحليل immunocytochemical أو استخدام الخلايا للبروتين أو تحليل DNA باستخدام التقنيات القياسية.
  5. اختياريا، والعودة إلى الخلايا الحاضنة بدلا من الاستعداد للتحليل الجزيئي من أجل إعادة تقييم الأداء الوظيفي في وقت لاحق نقطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثقافة ناجحة من خلايا مقلص على الكابولي هو إجراء بسيط نسبيا، وذلك باستخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية (الشكل 5). نسبة الكابولي دعم خلايا التعاقد سوف تختلف تبعا لنوع من الخلايا يجري بحثها وتقنية ثقافة معينة يعمل. استخدام الخلايا الجنينية الأولية المستمدة من الفئران أطرافه الخلفية، تم الكشف عن النشاط مقلص على 12٪ من الكابولي فحص (ن = 4). تحليل وظيفة مقلص باستخدام نظام الليزر والصور للكشف عن وصفها يوفر دقة البيانات في الوقت الحقيقي المتعلقة النضج الوظيفي للخلايا ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة في تحليل الكابولي الميكروسكيل عن أدلة على انكماش الخلوية هي وضع رقاقة ناتئ داخل المسرح المجهر، والمحاذاة لاحقة من الليزر والصور كاشف مع غيض من الكابولي الزاوية في الصفيف. إذا لم يتم ذلك بدقة، ثم لن تكون قادرة على استقراء مواقف الكابولي المتبقية في مجموعة، مما قد يؤدي إلى تراكم السلبيات كاذبة خلال جمع البيانات البرنامج. يجب على المشغلين أن تحرص على التأكد من أن شريحة ناتئ هو الكذب مطاردة مع الجزء السفلي من الطبق الثقافة قبل معايرة مواقف الليزر. إذا يجلس في زاوية رقا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا البحث من قبل المعهد الوطني للصحة الأرقام منحة R01NS050452 وR01EB009429. تم إجراء تصنيع رقائق ناتئ خارجيا من قبل المتعاونين في مرفق NanoFabrication يقع في جامعة كورنيل. وتقع جميع المعدات المستخدمة في عملية تصنيع ناتئ في هذا المرفق. شكر خاص لماندي إيش وجان ماتيو بروت لمساعدتهم مع ناتئ الصغيرة تلفيق. تم إنشاء الرسوم المتحركة الفيديو وظائف ناتئ من قبل تشارلز هيوز، أليكس Zelenin واريك إمبريل من مختبر الواقع الاصطناعية في UCF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

متوسط نمو علوم تقنيات أمراض

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
عضلات الفئران
الأولية تقنيات الحياة المتوسطة العصبيةالقاعدية 21103-049
B27 (50x)Life Technologies175040441x
Glutamax (100x)Life Technologies350500611x
G5 supplementLife Technologies17503-0121x
Glial-Derived علوم خلايا العامل العصبيCRG400B20 نانوغرام / مل
علوم الخلايا ذات العامل العصبي المشتق من الدماغCRB600B 20 نانوغرام / مل
الخلاياذات العامل العصبي الهدبيCRC400A40 نانوغرام / مل
علوم الخلايا Neurotrophin-3CRN500B 20 نانوغرام / مل
علوم الخلايا Neurotrophin-4CRN501B20 نانوغرام / مل
عامل نمو الخلايا الليفية الحمضية13241-013  25 نانوغرام / مل
الخلاياالقلبية -1CRC700B20 نانوغرام / مل
كبريتات الهيبارينسيجماD9809   ؛100 نانوغرام / مل
عامل مثبط لسرطان الدمSigmaL5158   ؛20 نانوغرام / مل
VitronectinSigmaV0132100 نانوغرام / مل
تمايز عضلات الفئران الأولية المتوسطة
NB Activ 4Brain Bits LLCNB4-500
Equipment
Class 2 ليزر الصمام الثنائي الأحمرنيوبورت
كاشف الصورNoah Industries
Model 2100 Pulse محفزأنظمة
AM Multiclamp 700B محول الأرقامAxon Instruments
التصحيح المشبك المجهر والمرحلةأوليمبوس
دلتا T4 وحدة تحكم طبق ثقافةBioptechs
برنامج Axoscopeالأجهزة الجزيئية
LabVIEWالبرمجيات الأدواتالوطنية
37 o< / sup>C ، 5٪ CO2< / sub> حاضنةNAPCO
فئة 2 غطاء التدفق الميكروبيولوجيLabconco
Pipettes ونصائحEppendorf

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
  2. Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
  3. Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
  4. Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
  5. Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
  6. Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
  7. Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
  8. Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
  9. Edman, K. A. Contractile performance of striated muscle. Advances in experimental medicine and biology. 682, 7-40 (2010).
  10. Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
  11. Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
  12. Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
  13. Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
  14. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
  15. Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108(2013).
  16. Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
  17. Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
  18. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
  19. Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
  20. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
  21. Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
  22. Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
  23. Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
  24. Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
  25. Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
  26. Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
  27. Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
  28. Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643(2010).
  29. Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
  30. Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
  31. Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة