يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

رابيد التنميط الجيني للحيوانات تلاه إنشاء الثقافات الأولية من الخلايا العصبية في الدماغ

16.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51879

⸱

يناير 29, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا إجراءات لوضع العلامات والتنميط الجيني الفئران حديثي الولادة وتوليد الثقافات العصبية الأولية منها. والتنميط الجيني هو سريع وفعال وموثوق بها، ويسمح لاستخراج-نوكليك حمض الآلي. وهذا مفيد خصوصا بالنسبة للفئران المميتة neonatally وثقافاتهم التي تتطلب استكمال مسبق من التنميط الجيني.

الملخص

وغالبا ما يتطلب تحليل عالية الدقة من التشكل وظيفة الخلايا العصبية الثدييات والتنميط الجيني للحيوانات الفردية تليها تحليل الثقافات الأولية من الخلايا العصبية. نحن تصف مجموعة من الإجراءات ل: وصفها الفئران حديثي الولادة ليتم مرمزة، التنميط الجيني السريع، وإنشاء الثقافات منخفض الكثافة من الخلايا العصبية في الدماغ من هذه الفئران. وصفت الفئران الفردية عن طريق الوشم، والذي يسمح لتحديد المدى الطويل الأمد في مرحلة البلوغ. التنميط الجيني بواسطة بروتوكول وصف سريع وفعال، ويسمح لاستخراج الآلي للحامض النووي مع موثوقية جيدة. وهذا مفيد في ظل الظروف التي تكون فيها الوقت الكافي للالتنميط الجيني التقليدي غير متوفر، على سبيل المثال، في الفئران التي تعاني من الفتك حديثي الولادة. يتم إنشاؤها الثقافات العصبية الأولية في منخفض الكثافة، والتي تمكن تجارب التصوير في قرار مكانية عالية. تتطلب هذه الطريقة ثقافة إعداد طبقات المغذية الدبقية قبل طلاء الخلايا العصبية. عيتم تطبيق rotocol في مجملها إلى نموذج الفأر من خلل التوتر اضطراب حركة DYT1 (ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران)، ويتم إعداد الثقافات العصبية من الحصين، القشرة الدماغية والجسم المخطط من هذه الفئران. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على الفئران مع طفرات وراثية أخرى، وكذلك للحيوانات من الأنواع الأخرى. وعلاوة على ذلك، والمكونات الفردية للبروتوكول يمكن استخدامها لعزل المشاريع الفرعية. وبالتالي هذا البروتوكول سيكون لها تطبيقات واسعة، ليس فقط في علم الأعصاب ولكن أيضا في مجالات أخرى من مجالات العلوم البيولوجية والطبية.

المقدمة

وقد أثبتت نماذج القوارض من الأمراض الوراثية مفيدة في إنشاء الوظائف الفسيولوجية للبروتينات طبيعية والأحماض النووية، وكذلك العواقب المرضية من العيوب في هذه. وتشمل الأمثلة الفئران ناقص لالبروتينات المشاركة في الوظائف الخلوية الرئيسية، وكذلك نماذج الماوس من الاضطرابات مثل مرض الزهايمر. ومع ذلك، يمكن بعض التلاعب الجيني يؤدي إلى الفتك حديثي الولادة بفترة وجيزة أو بعد بضعة أيام من الولادة. في هذه الحالات، والثقافات الخلية الأولية هي أداة مهمة لخلايا حية يمكن الحصول عليها من الجراء الجنينية أو حديثي الولادة قبل الموت، فإنها يمكن أن يستمر على الأقل لبضعة أسابيع في المختبر، وخلال هذا الوقت اللازم لتطوير الخلايا العصبية في وقت مبكر يمكن أن يتبعه الكيمياء الحيوية والوظيفية والمورفولوجية التجارب. لالثقافات الأولية، يمكن أن يكون مفيدا لوحة الخلايا العصبية في منخفض الكثافة. هذا يجعل من الممكن تصور somata الفردي، التشعبات، ومهاوي محور عصبي وtermi العصبيةالاشارات في قرار مكانية عالية. ومع ذلك، فإن البقاء على قيد الحياة والتفريق بين الخلايا العصبية في منخفض الكثافة عادة ما يتطلب أنهم مطلي على طبقة المغذية الدبقية، وشارك في تربيتها مع الخلايا الدبقية في غياب الاتصال الجسدي معهم، أو مثقف في المتوسط ​​مشروطة الدبقية 1.

يمكن إنشاء منخفض الكثافة الثقافات العصبية على طبقات المغذية الدبقية أن يعتمد على التنميط الجيني سريعة وموثوق بها مسبقا - في غضون بضع ساعة وعلى النقيض من بضعة أيام. السرعة هي أهمية خاصة عندما يحتاج النمط الجيني الخلايا العصبية لتكون مطابقة لتلك التي من طبقة المغذية الدبقية أعدت مسبقا. وكمثال عملي أكثر، قد يكون من الضروري أن تقرر أي الجراء منها الوراثي لاستخدامها في توليد الثقافات، لتحسين كفاءة تجربة.

نحن هنا لشرح بروتوكول العمل التي استخدمت لسرعة، مبسط وموثوق بها الماوس التنميط الجيني في المنشورات السابقة 2-6. ذيول الماوس ووتستخدم مجموعة المتاحة تجاريا. ويشمل هذا البروتوكول خطوة واحدة استخراج الأحماض النووية من الأنسجة، ويتطلب يست تنقية خطوة نوكليك حمض ولا استخدام منطقة عازلة إنهاء ('وقف الحل'). ويتضح موثوقية هذه الطريقة التنميط الجيني من خلال تقديم نتائج سلسلة من الاختبارات عندما يتم إدخال الخلافات مع الاحترام لكمية بدءا من العينات، وعمر الحيوانات وطول amplicons PCR. هذه المجموعة تقدم مزايا استخراج الآلي والموثوقية.

من أجل أن تكون شاملة، ويتجلى أيضا استخدام الوشم لتحديد المدى الطويل من الفئران مرمزة. ويتحقق من خلال تطبيق الوشم الحبر الوشم إلى الأدمة من الجلد (تحت البشرة) 7. ووصف إجراءات الوشم منصات مخلب من الفئران حديثي الولادة أو 1 يوم القديمة، على الرغم من أن الوشم يمكن تطبيقها على أجزاء أخرى من الجسم، مثل ذيول وأصابع القدمين، وأنيمالمرض من جميع الأعمار. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم عرض إجراءات الطلاء وزراعة الخلايا العصبية الماوس في مناطق ذات كثافة منخفضة، استنادا إلى إعداد الأمثل من أنواع مختلفة من طبقات المغذية الدبقية 2،8.

نحن نستخدم نموذج الجيني الماوس للالموروثة اضطراب عصبي DYT1 خلل التوتر - اضطراب حركة جسمية مهيمنة الناجمة عن طفرة في الجين TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG، p.Glu302del / p.Glu303del) 9. البروتين المشفرة، torsinA، ينتمي إلى "ATPases المرتبطة بأنشطة متنوعة الخلوية" (AAA +) عائلة من البروتينات، التي عموما على أداء مهام مثل كوصي، والمساعدة في الأعضاء: البروتين تتكشف، البروتين معقدة التفكيك، والاتجار الغشاء، والانصهار الحويصلة 10-13. نتائج طفرة في الحذف في إطار كودون لحمض الجلوتاميك، ويمكن أن يؤدي إلى مظهر من مظاهر "المبكر بداية المعمم خلل التوتر معزولة" 14،15. ومع ذلك، فإن مسارآليات ophysiological المسؤولة عن هذا الاضطراب لا تزال غير مفهومة تماما. في نموذج الفأر المغلوب في، أليل متحولة هو Tor1a tm2Wtd، المذكورة فيما بعد باسم Tor1a ΔE. متخالف ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران هي المرضى من البشر قابلة للحياة وتقليد وراثيا مع DYT1 خلل التوتر، في حين متماثلة اللواقح الضربة القاضية في الفئران تموت بعد الولادة 16،17، مع الكمون حتى الموت بعد الولادة تتأثر الخلفية الوراثية 18. الوفاة المبكرة لمتماثل الفئران الضربة القاضية في يقتضي أن كلا من التنميط الجيني للحيوانات وإنشاء الثقافات العصبية يتم الانتهاء بسرعة. وكمثال آخر على التنميط الجيني، Tfap2a (عامل النسخ AP-2α، وتفعيل محسن البروتين 2α ملزمة) وسوف تستخدم. البروتين المشفرة بواسطة هذا الجين مهم في تنظيم العمليات الخلوية متعددة، مثل انتشار، والتمايز والبقاء وموت الخلايا المبرمج 19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوان أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة ولاية ايوا.

1. تحديد المدى الطويل من الفئران عن طريق الوشم على وسادات باو

  1. شل مخلب مع لوحة مخلب (سطح أخمصي) التي تواجه المجرب. عقد مخلب مع الإبهام والسبابة. يجب الحرص على عدم قرصة مخلب.
    ملاحظة: تجميد مستقرة مهم لضمان أن يتم وضع وشم الصباغ في الأدمة لوحة مخلب، وبالتالي هو دائم 7.
  2. مسحة لوحة مخلب مع 70٪ من الإيثانول على اسفنجة الشاش أو مسحة.
  3. تطبيق زيت الجلد لقضيب من القطن ذات الرؤوس، ثم اضغط بلطف طرف ضد سطح لوحة مخلب عدة مرات. فقط استخدام كمية صغيرة من النفط الجلد، عندما تكون موجودة بكميات كبيرة، فإنه سيتم منع الصباغ الوشم من الوصول إلى الجلد.
  4. تراجع نصائح من إبر الوشم في حبر الوشم فقط قبلإلى الوشم. استخدام نظيفة ومعقمة والإبر الوشم حادة، لتقليل الألم وإمكانية العدوى، وكذلك لزيادة كفاءة الوشم.
  5. في حين يتم تغطية سطح لوحة مخلب مع النفط الجلد، واضغط على نصائح الوشم الإبرة عموديا وبخفة على الجلد في وسط لوحة مخلب، وحقن الحبر عدة مرات. انظر الجدول المواد / معدات للحصول على معلومات حول النظام الوشم الكهربائية.
  6. رذاذ الايثانول 70٪ على اسفنجة شاش، اضغط بلطف ضد مخلب لإزالة الوشم اضافية الصباغ على سطح الجلد، وتفقد نوعية الوشم. تأكد من منتصف لوحة مخلب له، بقعة مستديرة داكنة يختلف عن العادي تصبغ الجلد. إذا كان الوشم ليست مظلمة أو كبيرة بما يكفي لسهولة المشاهدة، كرر الخطوات الوشم السابقة.

2. الفئران انماط الوليد باستخدام PCR التنميط الجيني السريع كيت

  1. تطهير النهاية البعيدة من ذيل الفأر مع الايثانول 70٪، وقطع 5 ملم أو أقل من الذيلتلميح وتحويلها إلى أنبوب من الشريط 8 أنبوب من النوع المستخدم لPCR. استخدام شفرة حلاقة من الامم المتحدة والمستخدمة لكل الجرو لتجنب التلوث المتبادل بين العينات. بدلا من ذلك، استخدم مقصا، ولكن في هذه الحالة، بعناية وبدقة إزالة الأنسجة المتبقية على شفرات باستخدام الايثانول 70٪. التحقق من وجود نزيف. إذا كان النزيف يحدث، ممارسة الضغط على لقطع جزء من الذيل مع اسفنجة شاش حتى يتوقف النزيف.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي الحل لكل أنبوب PCR يحتوي على العينة. انظر الجدول المواد / المعدات اللازمة لتكوينها والمعلومات حول عدة.
  3. ضع الشريط أنبوب إلى cycler الحرارية PCR، والبدء في استخراج الحمض النووي باستخدام البرنامج التالي: 1 دورة في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وعقد في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: هذا هو نفس PCR cycler الحرارية التي يتم استخدامها لاحقا لPCR.
  4. بعد الانتهاء من استخراج الحمض النووي، وإزالة الشريط أنبوب من الحرارية cycler على لالثانية عكس 5 مرات.
  5. نقل 4 ميكرولتر من محلول (استخراج DNA) من كل عينة إلى الامم المتحدة وتستخدم أنبوب من الشريط 8 أنبوب، وتخلط مع: 10 ميكرولتر من 2X PCR للخرسانة الجاهزة II، 2 ميكرولتر من مختلطة إلى الأمام وعكس الاشعال (موصى به في 0.5 ميكرومتر؛ انظر جدول المواد / معدات لمتواليات)، و 4 ميكرولتر من nuclease خالية H 2 O، لكل عينة. تدور لفترة وجيزة (على سبيل المثال، 3 ثانية) باستخدام جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات إلا عندما المناولة.
  6. أداء الدراجات الحرارية. شاهد جدول المواد / معدات لبرنامج الحراري.
  7. كشف المنتجات تضخيم الحمض النووي. تحميل حلا شاملا رد فعل من (ميكرولتر 20) PCR مباشرة في بئر من agarose هلام. تحميل علامات الوزن الجزيئي في بئر منفصل. تطبيق حقل كهربائي.
  8. الحصول على صور مضان من العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

3. الثقافة الابتدائية من الفأر الدماغ العصبيةالصورة على الدبقية طبقة الطاعم

ملاحظة: إجراءات تشريح الدماغ والتفكك الخلية (3.1) هي مشتركة بين جميع الإجراءات اللاحقة. يتم وصف إجراءات الثقافات الماوس الدبقية (3.2)، والثقافات الدبقية الفئران (3.3)، والماوس الثقافات العصبية (3.4) بشكل منفصل بعد ذلك.

  1. الدماغ تشريح والخلوية Dissocaiation
    1. تضحية واحدة الماوس أو الفئران الجرو بقطع الرأس، بسرعة إزالة الدماغ، ووضعه في حل هانكس "(انظر الجدول رقم 1 لتكوين) + 20٪ مصل الجنين البقري (FBS) في صحن 35 ملم (أبقى على الجليد).
    2. قطع الدماغ من خلال خط الوسط إلى نصفين. إزالة المنطقة ذات الاهتمام (على سبيل المثال، قشرة المخ، والمخطط الحصين) من كل نصف الكرة الأرضية من الدماغ. إزالة السحايا والأوعية الدموية الرئيسية من على سطح الأرض. قطع منطقة في الدماغ إلى 4-10 شرائح رقيقة باستخدام شفرة جراحية.
    3. شطف شرائح الدماغ في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، مرة واحدة خفة دمح هانكس "حل + 20٪ FBS، ثم 3 مرات مع هانكس" الحل (أي بدون المصل) (كل في 4 درجات مئوية). لشطف، إضافة 5-10 حل مل، والسماح للدماغ شرائح تستقر في أسفل الأنبوب، نضح الحل من أعلى، وإضافة حل جديد. الانتهاء من إجراء الشطف بواسطة الشفط الحل.
    4. تصفية 2 مل من محلول الهضم التي تحتوي على التربسين (انظر الجدول رقم 1 لتكوين) باستخدام حقنة 3 مل ومرشح حقنة 0.2 ميكرون، وإضافة الترشيح مباشرة في الأنبوب الذي يحتوي على شرائح الدماغ. السماح للtrypsinization المضي قدما لمدة 13 دقيقة في RT.
    5. تحييد الحل التربسين أولا بواسطة الشفط أكثر من ذلك ومن ثم عن طريق إضافة 7-10 مل من هانكس "حل + 20٪ FBS (4 ° C).
    6. شطف شرائح الدماغ، مرتين مع هانكس "حل + 20٪ FBS، ثم ثلاث مرات مع هانكس" الحل (أي من دون المصل) (كل في 4 درجات مئوية). الانتهاء من إجراء الشطف بواسطة الشفط وsolutأيون.
    7. تصفية 2 مل من محلول التفكك (انظر الجدول رقم 1 لتكوين) باستخدام حقنة 3 مل ومرشح حقنة 0.2 ميكرون، وإضافة الترشيح مباشرة إلى أنبوب مع شرائح الدماغ.
    8. ميكانيكيا فصل الخلايا عن طريق الطحن بلطف 10-20 مرات، حتى قطعة نسيج مرئية تختفي. استخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير وتجنب الوقوع في فقاعات خلال سحن.
    9. انتظر 3 دقائق لقطع صغيرة ليستقر.
    10. نقل الغالبية من الحل (~ 1.5 مل، وترك بعض الحلول في أسفل) إلى أنبوب 15 مل الطرد المركزي التي تحتوي على 3 مل من محلول هانكس '+ 20٪ محلول FBS (4 ° C)، وذلك باستخدام-توصيله القطن، النارية مصقول ماصة باستير. لا نقل عن الحل لأن إدراج أي الرواسب في قاع النتائج عادة في تدهور الثقافة.
    11. أجهزة الطرد المركزي لمدة 13 دقيقة في ~ 185 غرام (~ 1،100 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية.
    12. نضح طاف بلطف،إضافة 1 مل من الطلاء المتوسطة (37 ° C) إلى بيليه، و resuspend من قبل pipetting بلطف عدة مرات باستخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير قبل تحسنت.
      ملاحظة: يتم استخدام ثلاثة أنواع مختلفة من الطلاء وسائل الإعلام لأغراض ثقافة مختلفة: تصفيح المتوسطة 1 للخلايا الدبقية الماوس، والطلاء متوسطة 2 لالخلايا العصبية الماوس، والطلاء متوسطة 3 لالخلايا العصبية الفئران والخلايا الدبقية (انظر الجدول 1 للتركيبات) .
    13. إخراج 10 ميكرولتر من تعليق خلية، ومزجها مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان حل الأزرق، وقياس كثافة الخلايا الحية، وذلك باستخدام إما عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي.
  2. الثقافات الماوس الدبقية
    1. غسل لل coverslips للمساعدة في إنشاء ثقافات صحية من خلايا فأر.
      1. تزج coverslips الزجاج (الجولة، 12 مم) في حامض النتريك 70٪ في طبق بتري الزجاج. يحفظ بعيدا عن الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم، ووضعه على المداري شاكر O / N.
      2. شطف الزجاج coversliملاحظة في طبق بتري ثلاث مرات على الأقل مع الماء المقطر. تزج في الماء المقطر. وضع طبق على شاكر يا المداري / N.
      3. تجفيف coverslips على 150 مم ورق الترشيح هتما في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
      4. الأوتوكلاف لل coverslips.
      5. ضع لل coverslips في صحن ثقافة 24-جيدا.
    2. التسمية وراثى الفئران حديثي الولادة وفقا لالخطوتين 1 و 2.
    3. الحصول على خلايا المخ من الجراء الماوس، وفقا لخطوة 3.1.
      ملاحظة: استخدام قشرة الدماغ هو نموذجي لإعداد طبقة الماوس الدبقية المغذية. ومع ذلك، مناطق أخرى من الدماغ، مثل الحصين والمخطط، ستعمل بعد التعديل السليم للكثافة الخلية نظرا لأعداد وعائدات من الخلايا من مختلف المناطق المختلفة.
    4. إضافة ~ 4 مل من قبل تحسنت تصفيح المتوسط ​​1 إلى تعليق خلية النهائي (~ 1 مل). لمرحلة ما قبل ارتفاع درجات الحرارة وسائل الإعلام والثقافة، ووضع الحل في الحاضنة الثقافة (5٪ CO 2 -95٪ O 2، 37 ° C) O / N، لالسماح للقيم درجة الحرارة ودرجة الحموضة لتحقيق الاستقرار.
    5. نقل تعليق خلية إلى غير المصقول ثقافة T25 قارورة، وذلك باستخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير. ضع قارورة في حاضنة الثقافة.
    6. في 1 يوم في المختبر (DIV)، وشطف الخلايا المستزرعة في قارورة T25 مرتين مع تصفيح متوسطة 1 (4 ° C). ضع قارورة مرة أخرى في الحاضنة. أداء الشطف بواسطة الشفط المتوسطة داخل قارورة تماما مع ماصة باستور، مضيفا ~ 5 مل من المتوسط ​​الطازجة وإمالة بلطف القارورة عدة مرات في حركة دوامات.
    7. في 6-9 DIV، (أي قبل يوم واحد trypsinization والطلاء coverslips على، في خطوات 3.2.8-3.2.13)، وضع 100 ميكرولتر من مواد الطلاء مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية (انظر جدول المواد / معدات تعليقات حول مادة الطلاء) على coverslips الزجاج في طبق ثقافة، ووضع الطبق الثقافة في حاضنة الثقافة.
    8. في 7-10 DIV، عندما كانت الخلايا 20-40٪ متموجة (مستمر مكانيا)، يعرض للتريبسين لهم.
      1. شطف القارورة مرة واحدة، عن طريق الشفط عن الحل داخل القارورة وإضافة ~ 13 مل من محلول هانكس "(4 ° C)، إمالة بلطف القارورة عدة مرات في حركة دوامات، ونضح الحل تماما.
      2. إضافة 40 ميكرولتر من الدناز الحل (تركيز النهائي، 750 وحدة / مل) إلى 4 مل التربسين-EDTA الحل، لتمرير حل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون، وإضافة الترشيح مباشرة إلى الخلايا في قارورة.
      3. السماح للtrypsinization المضي قدما لمدة 13 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
      4. تحييد الحل التربسين بإضافة 2 مل من 100٪ FBS (4 ° C) إلى القارورة.
      5. نقل الخلايا trypsinized إلى أنبوب 15 مل الطرد المركزي باستخدام 5- إلى 10 مل ماصة، إضافة ~ 4 مل من محلول هانكس '+ 20٪ FBS (4 ° C)، الطرد المركزي في ~ 185 غرام و 4 درجة مئوية لمدة 13 دقيقة ، ونضح طاف.
    9. resuspend الكرية في 1 مل من قبل WARMEد الطلاء المتوسطة-1.
    10. قياس كثافة الخلايا وفقا لخطوة 3.1.13.
    11. نضح في مواد الطلاء تماما من coverslips الزجاج، وصفيحة ~ 50 ميكرولتر من الخلايا الدبقية معلق coverslips على.
      ملاحظة: هذه الخلايا سوف تنشئ طبقة المغذية الدبقية.
    12. مكان الطبق الثقافة مع coverslips في الحاضنة.
    13. في وقت لاحق 20-60 دقيقة، إضافة 1 مل من قبل تحسنت تصفيح المتوسط ​​1 إلى كل بئر، ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة. ملاحظة: في حين يتم إضافة المتوسطة تصفيح، وسوف يكون من المفيد استخدام ماصة أخرى إلى الضغط باستمرار على المحيط الخارجي للساترة (حيث هناك خلايا مطلي)، بحيث ساترة لا تطفو على المدى المتوسط.
    14. في 1 DIV طبقة المغذية الدبقية (أي على ساترة الزجاج)، استبدل المتوسطة مع 1 مل من الطلاء قبل تحسنت المتوسطة-1، بواسطة الشفط كل من الحل في بئر ثم ملئه مع المتوسط ​​الطازجة.
    15. في 2-3 DIV طبقة المغذية الدبقية عندما سلليرة سورية هي 80-100٪ متموجة، إضافة مثبط الإنقسامية (10 ميكرولتر من خليط من 5 الفلورية 2'-deoxyuridine + يوريدين، تركيزات النهائية من 81.2 و204.8 ميكرومتر، على التوالي) إلى كل بئر، لمنع تكاثر الحمض النووي، وبالتالي ل قمع انتشار الخلايا الدبقية.
    16. في 7-9 DIV، عندما كانت الخلايا 90-100٪ متموجة (1-2 ساعة قبل الطلاء الخلايا العصبية في طبقة المغذية الدبقية)، استبدال مستنبت مع الطلاء قبل تحسنت المتوسطة 2 (37 ° C).
      سيتم مطلي الخلايا العصبية في نفس اليوم، وذلك باستخدام الخطوة 3.4: ملاحظة.
  3. الثقافات الفئران الدبقية
    1. معطف ثقافة قارورة T25 مع نفس مواد الطلاء.
      ملاحظة: هذا أمر ضروري لإزالة لاحقة من الخلايا غير ملتصقة في الخطوة 3.3.5.
      1. إضافة 2.0 مل من مواد الطلاء إلى القارورة، ووضع القارورة في الحاضنة الثقافة.
      2. بعد 2-3 ساعة، نضح مواد الطلاء تماما، مثل أن الكلمة القارورة يصبح الجاف.
    2. الحصول على خلايامن الفئران الوليدة، وفقا إلى الخطوة 3.1.
      وتستخدم المنطقة CA3-CA1 من الحصين لإعداد طبقة الفئران الدبقية المغذية: ملاحظة. ومع ذلك، مناطق أخرى من الدماغ، مثل قشرة الدماغ والجسم المخطط، ستعمل بعد تعديله طبقا للاختلافات في كثافة الخلية نظرا لأعداد وعائدات من الخلايا من مختلف المناطق المختلفة.
    3. إضافة ~ 4 مل من قبل تحسنت تصفيح المتوسط ​​3 إلى تعليق خلية النهائي (~ 1 مل).
    4. نقل تعليق خلية في قارورة المغلفة ثقافة T25، وذلك باستخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير. ضع قارورة في حاضنة الثقافة (5٪ CO 2 -95٪ O 2، 37 ° C).
    5. في 2-3 DIV، عندما الخلايا هي 20-40٪ متموجة، وإزالة غير ملتصقة أو ضعيفة الخلايا الملتصقة، عن طريق إغلاق الغطاء بإحكام، والهز القارورة بقوة ~ 10 مرات، الشفط الحل، وإضافة 4-5 مل من الطلاء متوسطة 3 (في 4 درجات مئوية). كرر هذا الإجراء مرة واحدة. فحص الخلايا المستزرعة عبر الكلمة قارورة كامل (على سبيل المثال،باستخدام المجهر المرحلة على النقيض) للتأكد من أن تلك التي تظهر العصبية (أي تلك التي الحافة الخارجية من جسم الخلية يظهر على مرحلة مشرقة) يتم إزالتها تماما. كرر الإجراء كلما كان ذلك ضروريا لإزالة هذه الخلايا، ومن ثم العودة القارورة إلى حاضنة.
      ملاحظة: القوة والعدد الإجمالي لل"يهز" المطلوبة قد تختلف بين المجربون الفردية. الشيء المهم هو ليس للحفاظ على العدد الكلي للهزات لعدد محدد، ولكن لتأكيد أن الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا والقضاء عليها.
    6. في 6-8 DIV، عندما الخلايا هي 90-100٪ متموجة، مرور الخلايا الدبقية التي كتبها trypsinizing لهم كما في الخطوة 3.2.8.
    7. بعد الطرد المركزي، resuspend الكرية في 1 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C)، إضافة 10 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C)، ونقل الخلايا trypsinized إلى الامم المتحدة والمغلفة T75 قارورة، والثقافة لها في الحاضنة.
      ملاحظة: سيتم passaged الخلايا الدبقية الفئران مرتين. في المقابل الخلايا الدبقية الماوس عالبريد passaged مرة واحدة فقط لأنها تصبح غير صحية بعد ممرات متعددة. سيتم passaged الخلايا الدبقية الفئران في قوارير T75 التي لم يتم المغلفة مع أي مواد الطلاء. طلاء يسمح الخلايا الدبقية الفئران أن ينمو بسرعة كبيرة جدا وتنتج العديد من الخلايا المهدبة (خلايا البطانة العصبية المفترضة)، والتي سوف تتدهور حالة ثقافة العصبية في وقت لاحق.
    8. في 17-19 DIV الثقافة الدبقية في قارورة (أي 11 يوما بعد الركض وقبل trypsinization يوم واحد والطلاء على coverslips خطوات 3.3.9-3.3.14)، وضع 100 ميكرولتر من مواد الطلاء على coverslips الزجاج غير مغسولة ( الجولة، 12 مم) في طبق ثقافة، ووضع الطبق الثقافة في حاضنة الثقافة.
      ملاحظة: للحصول على الثقافات الدبقية الفئران، لم يلاحظ فرق في النتائج الثقافة مع أو بدون غسل لل coverslips.
    9. في 18-20 DIV الثقافة الدبقية في قارورة (أي بعد 12 يوما من الركض)، وإعداد طبقة المغذية الدبقية التي كتبها trypsinizing في الخلايا المستزرعة، وفقا لشارعالجيش الشعبي 3.2.8.
    10. أثناء الطرد المركزي، ونضح مواد الطلاء تماما من coverslips الزجاج.
    11. بعد الطرد المركزي، resuspend الكرية في 1 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C)، وقياس كثافة الخلايا، وفقا لخطوة 3.1.13.
    12. ضبط كثافة الدبقية إلى 10 4 الخلايا الحية / مل، ولوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية الدبقية على coverslips الزجاج المطلي.
      ملاحظة: هذه الخلايا سوف تنشئ طبقة المغذية الدبقية.
    13. مكان الطبق الثقافة مع coverslips في الحاضنة لمدة 20-60 دقيقة.
    14. إضافة 1 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C) إلى كل بئر، ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة.
    15. في 3-4 DIV طبقة المغذية الدبقية، عندما الخلايا على ساترة هي 40-80٪ متموجة، إضافة 1 مل من وسط النمو قبل تحسنت (انظر الجدول رقم 1 لتكوين) الذي يحتوي على السيتوزين β-D-arabinofuranoside ( أراك، تركيز النهائي من 4 ميكرومتر) لوقف انتشار الخلايا الدبقية. لوحة الخلايا العصبيةالصورة في 7-9 DIV طبقة المغذية الدبقية عندما الخلايا هي 60-80٪ متموجة، وذلك باستخدام الخطوة 3.4.
  4. الثقافات الماوس العصبية
    1. التسمية وراثى الفئران حديثي الولادة وفقا لالخطوتين 1 و 2.
    2. استخدام الماوس الجراء للخطوة 3.1.
    3. ضبط كثافة تعليق الخلية الحية إلى ~ 2.0 × 10 5 خلية / مل باستخدام الطلاء متوسطة 2 لتصفيح على الخلايا الدبقية الماوس، أو استخدام قبل تحسنت الطلاء متوسطة 3 لتصفيح على الخلايا الدبقية الفئران.
    4. لوحة الخلايا على طبقة المغذية الدبقية، وذلك بإضافة بلطف تعليق الخلية إلى مستنبت من كل بئر. ملاحظة: سيتم تحديد حجم تعليق الخلية التي يمكن ان تضاف من قبل العدد المستهدف من الخلايا في الثقافة أيضا. على سبيل المثال، لوحة ~ 60 ميكرولتر من تعليق خلية لتحقيق 12،000 خلية / جيدا.
    5. لاحظ أن أي تغييرات حل ضرورية بعد أن يتم مطلي الخلايا العصبية. كن حذرا لتجنب التبخر من الحل من الآبار على مدى الثقافة، من خلال ترطيب داخل سو حاضنة الثقافة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كمثال لتطبيق هذا البروتوكول، وتظهر نتائج ممثلة لوصفها الفئران عن طريق الوشم، والتنميط الجيني يمكن الاعتماد عليها تحت ظروف تجريبية مختلفة، وإنشاء الثقافات العصبية الأولية على طبقات المغذية الدبقية.

الوشم

وصفت الجراء حديثي الولادة على منصات مخلب باستخدام نظام الوشم ('الوليد' في الشكل 1). ظلت التسميات واضحة للعيان ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول المعروضة هنا يشمل إجراءات الوشم لتسمية / تحديد الفئران، لالتنميط الجيني الفئران من نصائح الذيل، وزراعة الخلايا العصبية مخ الفأر في منخفض الكثافة. في جولة واحدة من التجارب باستخدام 6-8 الجراء، وعادة ما تتطلب هذه الإجراءات ~ 0.5 ساعة، ~ 4 ساعة و ~ 2 ساعة، على التوالي، في ما مجموعه 6-7 ساعة. هذا يجعل من عملية لالمجرب واحد لاستكمال جميع الإجراءات اللازمة من وقت ولادة الجراء "إلى الطلاء من الثقافات العصبية - في أقل من يوم عمل واحد (باستثناء إعداد مسبق من طبقات المغذية الد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلف (Zhengmin Huang) هو رئيس شركة EZ BioResearch LLC التي تنتج الكواشف الموضحة في هذه المقالة.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الباحثين في جامعة أيوا ، والد. لويس تيسيدور ، وإينيس مارتينز ، وبيفرلي ديفيدسون على التعليمات والتعليقات المفيدة فيما يتعلق بالثقافات المخططة ، والد. كارا جوردون ونيكول بود وبيدرو غونزاليس أليغري للمساعدة في التنميط الجيني والمناقشات. نشكر أيضا الدكتور إريك وياند (أنظمة تحديد ووسمها) على التعليقات المفيدة فيما يتعلق بالوشم ، والدكتور شوتارو كاتسوراباياشي (جامعة فوكوكا) على التعليقات المفيدة فيما يتعلق بثقافة الفئران. تم دعم هذا العمل من خلال منح من جمعية القلب الأمريكية ، ووزارة الدفاع (جائزة برنامج البحوث الطبية التي تمت مراجعتها من قبل الأقران W81XWH-14-1-0301) ، ومؤسسة خلل التوتر العضلي للأبحاث الطبية ، ومؤسسة إدوارد مالينكرودت جونيور ، والمؤسسة الوطنية للعلوم ، ومؤسسة وايتهول (NCH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكواشف - آلة الوشم
منظفأنظمة تحديد هوية ووضع العلامات ، Inc.NMCR3يستخدم هذا لتنظيف الإبر والحامل بعد الوشم.
تجفيف عاملتحديد ووضع العلامات على، Inc.NDAR4يستخدم هذا لتجفيف الإبر والحامل بعد التنظيف.
الصباغ الأسود حديثي الولادة، Inc.NBP01
Skin Prep قضيبأنظمة تحديد ووضع العلامات عليها، Inc.NSPA1Q-tip.
حل إعداد الجلدأنظمة تحديد هوية ووضع العلامات عليها ، Inc.NSP01يوفر هذا الكاشف طبقة رقيقة من الزيت تعزز كفاءة الوشم وتمنع تلاشي الوشم ، من خلال (معلومات من البائع): 1) منع تلطيخ الجلد غير الموشوم مؤقتا ، مما يسمح بتقييم جودة وشم وسادة المخلب بسهولة قبل إعادة الجرو إلى قفص منزله & يمكن الخلط بين سطح الجلد الملطخ والجلد الموشوم ، 2) تقليل تلف الجلد أثناء الوشم & ndash ؛ سيساعد تليين البشرة وتزييت الإبرة الإبرة على اختراق الجلد دون التسبب في تلف الجلد ، و 3) منع الأكسجين الجزيئي من دخول الجلد ، وبالتالي تقليل الاستجابات الالتهابية لأنواع الأكسجين التفاعلية التي يمكن توليدها.
الكواشف - التنميط
EZ Fast Tissue / Tail PCR Genoting Kit (تنسيق أنبوب الشريط) EZBioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100يتم تضمين صبغة حمراء تحميل للرحلان الكهربائي في محلول 2X PCR Ready Mix.
محلول تحلل الأنسجة AEZ BioResearch LLCG2001-100تحضير محلول استخراج الحمض النووي عن طريق خلط 20 وميكرو ؛ ل من محلول تحلل الأنسجة A و 180 & micro ؛ ل من محلول تحلل الأنسجة ب لكل عينة.
محلول تحلل الأنسجة BEZ BioResearch LLCG2001-100تحضير محلول استخراج الحمض النووي عن طريق خلط 20 وميكرو ؛ ل من محلول تحلل الأنسجة A و 180 & micro ؛ ل من محلول تحلل الأنسجة ب لكل عينة.
حمض الخليك ،VWRBDH 3092
درجة الأغاروز الأمثل ، درجة البيولوجيا الجزيئيةrpiA20090-500 & nbsp ؛نستخدم 2٪ من المواد الهلامية الاغاروز في المخزن المؤقت TAE الذي يحتوي على صبغة هلام الحمض النووي الآمنة SYBR (مخففة 10,000 ضعف) أو بروميد الإيثيديوم (0.5 & micro; جم / مل حجم الجل).
بروميد الإيثيديومسيجما-ألدريتشE7637-1G
حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين ديامين ، ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم (EDTA) فيشرBP120-500
أطراف ماصة مصفاة ، خالية من الهباء الجوي ، 0.1-10 & micro ؛ لDot Scientific IncUG104-96RS   ؛استخدم أطراف الماصة المعقمة والخالية من الحمض النووي وRNase وDNase. بالنسبة لجميع الخطوات التي تتضمن الحمض النووي، استخدم أطراف الماصة المفلترة لتجنب التلوث المتبادل.
أطراف ماصة مفلترة ، أطراف مرشح Premium Fit ، 0.5-20 & micro ؛ لDot Scientific IncUG2020-RSاستخدم أطراف الماصة المعقمة والخالية من الحمض النووي وRNase وDNase. بالنسبة لجميع الخطوات التي تتضمن الحمض النووي، استخدم أطراف الماصة المفلترة لتجنب التلوث المتبادل.
أطراف ماصة مفلترة ، أطراف مرشح Premium Fit ، 1-200 & micro ؛ لDot Scientific IncUG2812-RSاستخدم أطراف الماصة المعقمة والخالية من الحمض النووي وRNase وDNase. بالنسبة لجميع الخطوات التي تتضمن الحمض النووي، استخدم أطراف الماصة المفلترة لتجنب التلوث المتبادل.
علامة الوزن الجزيئي ، EZ DNA حتى السلالم 100 نقطة أساسEZ BioResearch LLCL1001نستخدم أيا من علامات الوزن الجزيئي الثلاثة هذه.
علامة الوزن الجزيئي ، سلالم EZ DNA حتى 1000 نقطة أساسEZ BioResearch LLCL1010
علامة الوزن الجزيئي ، TrackIt ، سلم DNA 100 نقطة أساسGIBCO-Invitrogen10488-058
أنابيب PCR ، شرائط ذات 8 أنابيب مع أغطية علوية قبة متصلة بشكل فردي ، طبيعي ، 0.2 مل & nbsp ؛USA Scientific1402-2900استخدم أنابيب معقمة وخالية من الحمض النووي و RNase و DNase. من السهل التعامل مع الشريط المكون من 8 أنابيب وتجميعها أكثر من الأنابيب الفردية.
أنابيب PCR ، Ultraflux Individual   ؛RPI145660استخدم أنابيب معقمة وخالية من الحمض النووي و RNase و DNase.
أنبوب الطرد المركزي الدقيق Seal-Rite 0.5 مل ، طبيعيالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1605-0000استخدم أنابيب معقمة وخالية من الحمض النووي و RNase و DNase.
جل الحمض النووي الآمنة SYBR * تركيز 10,000x في DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers لتضخيم جين Tor1a في & دلتا ؛ E-torsinA فئرانضربة قاعية 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (إلى الأمام) و 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (عكسي) (المرجع 18). تم استخدام هذه الاشعال بتركيز نهائي قدره 1.0 نانوغرام /& ميكرو ؛ ل (~ 0.16 & micro; M) (المرجع 2).
بادئات لتضخيم جين Tfap2a في الفئران5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GG-3 '(إلى الأمام) ، 5'-CGT GTG GCT GGT GGG GTT GCT GAG GTA-3 '(عكسي) لمضخم 498 نقطة أساس ، 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3 '(إلى الأمام) ، 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3 '(عكسي) لمضخم 983-bp ، و 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3 '(إلى الأمام) ، 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3 '(عكس) لمضخم صوت 1990-BP. تستخدم هذه الاشعال عند 0.5 ميكرومتر.
الكواشف - زراعة
5-Fluoro-2 & prime ;-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MGانظر قسم التعليقات من uridine لمزيد من المعلومات.
مكمل B-27GIBCO-Invitrogen17504-044
أطباق زراعة الخلايا 35 × 10 مم أطباق ،صقر BDالأنسجة 353001
قوارير زراعة الخلايا ، T25 ، معالج بزراعة الأنسجة ، رقبة معلقة ، غطاء مانع للتسرب ، 25 سم 2< / sup> منطقة النمو ، 70 ملFalcon353082
قوارير زراعة الخلايا ، T75 ، معالجة بزراعة الأنسجة ، رقبة معلقة ، غطاء مهواة ، 75 سم 2< / sup> منطقة النمو ، 250 ملالصقر353136
أنبوب مخروطي الشكل ، بولي بروبيلين ، 15 ملBDfalcon 352095
شرائح غرفة الكونتيسة (عداد رقم الخلية) GIBCO-InvitrogenC10312
السيتوزين & بيتا ؛ -D-أرابينوفيوروزيد هيدروكلوريد (Ara-C هيدروكلوريد)سيجما ألدريتشC6645-100 مجم
D- (+) - جلوكوز (سكر العنب) اللامائي ، SigmaUltra ، 99.5٪ (GC)سيجما ألدريتشG7528-250G
، زجاج بتري 100 × 15 ممبيركس3160-101
ماء مقطرجيبكو - إنفيتروجين15230-147
DNase النوع الثانيسيجما ألدريتشD4527-200KUيتم تحضير محلول المخزون بسعر 1,500 وحدة / 20 مو ؛ ل = 75,000 وحدة / مل في الماء المقطر.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ، نسبة عالية من الجلوكوز ، GlutaMAX ، البيروفاتGIBCO-Invitrogen10569-010 ، 500 مل
وحدة فلتر PES سريعة ، 250 مل ، غشاء قطره 50 مم ، 0.2 & micro ؛ m حجم المسامNalgene568-0020
وحدة تصفية PES سريعة ، 500 مل ، غشاء قطره 90 مم ، 0.2 وميكرو ؛ م حجم المسامNalgene569-0020
مصل الأبقار الجنيني (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
غطاء زجاجي ، 12 مم دائري ، سمك 0.09 & 0.12 مم ، رقم 0كارولينا633017
GlutaMAX-IGIBCO-INVITROGEN35050-061
أملاح هانكس المتوازنةسيجما ألدريتشH2387-10X
HEPES ، & ge ؛ 99.5٪ (معايرة بالتحليل الحجمي)سيجما ألدريتشH3375-250G
حمض الهيدروكلوريك ، 37٪ ، كاشف ACSسيجما ألدريتش258148-100 مل
الأنسولينسيجما ألدريتشI5500-250 مجم
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات ، MgSO4< / sub>&( 7H 2 < / sub > ) ، BioUltra ، & ge ؛ 99.5٪ (فلوكا)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel محلول مصفوفة الغشاء القاعدي ، الفينول الخاليالأحمر BD Biosciences356237هذه هي مادة الطلاء للأغطية والقوارير. 1) لتحضيره ، قم بإذابة محلول Matrigel Basement Membrane Matrix على الجليد ، والذي يستغرق عادة ~ 1 يوم. باستخدام ماصة مبردة مسبقا ، قم بتقسيم المحلول المذاب في قوارير T25 مبردة مسبقا على الثلج ، وقم بتخزين القوارير عند -20 درجة مئوية. لتحضير محلول Matrigel العامل ، قم بإذابة Matrigel في قارورة على الثلج ، وقم بتخفيف 50 ضعفا عن طريق إضافة محلول MEM المبرد مسبقا واحتفظ بالمحلول المخفف عند 4 درجات مئوية. من المهم تبريد جميع الأدوات والوسائط التي تتلامس مع Matrigel مسبقا ، باستثناء أثناء وبعد طلاء الأغطية ، لمنعها من تكوين مادة هلامية قبل الأوان. 2) لطلاء الأغطية الزجاجية أو قوارير الثقافة باستخدام Matrigel ، ضع محلول Matrigel على السطح. قبل طلاء الخلايا ، من المهم تجفيف السطح تماما. لهذا الغرض ، قد يكون من المفيد شفط Matrigel أثناء الطرد المركزي الخلوي مباشرة قبل طلاء الخلايا وإتاحة الوقت الكافي للتجفيف.
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO + موسع المصل ، 5 ملBD Biosciences355006
ألواح متعددة الآبار ، صقر BD معالج بزراعة الأنسجة 24 بئرا353047
ألواح متعددة الآبار ، صقر BD معالج بزراعة الأنسجة 353046
Neurobasal-A متوسط (1X) ، سائلGIBCO-Invitrogen10888-022
حمض النيتريكVWRbdh 3044
NS (مكمل عصبي) 21   ؛أعدت في المختبرالمصدر: المرجع 69
Pasteur pipets, 5 & frac34; ”  فيشر13-678-6Aاستخدم هذا القطن المتوصيل 5 ¾ ؛ ” ماصة باستور للخلية الخلوية. قم بتلميع الطرف مسبقا لتنعيم السطح المقطوع وتقليل القطر الداخلي إلى 50-80٪ من الأصل. سيؤدي الطرف الصغير جدا إلى تعطيل الخلايا وتقليل قابلية الخلية للحياة ، لكن الطرف الكبير جدا سيقلل من كفاءة التخلي.
ماصات باستور ، 9 "  فيشر13-678-6B
كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، SigmaUltra ، & ge ؛ 99.0٪Sigma-AldrichP9333-500G
ماصة مصلية ، 2 ملBD صقر357507
ماصة مصلية ، 5 مل & nbsp ؛ماصة الصقر357543
BD المصلية ، 10 ملBD فالكون357551
ماصة مصلية ، 25 ملBDصقر 357525
ماصة مصلية ، 50 مل & nbsp ؛BD falcon357550
بيكربونات الصوديوم (NaHCO3 ، كربونات هيدروجين الصوديوم) ، SigmaUltra ، & ge ؛ 99.5٪سيجما ألدريتشS6297-250G
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، سيجما ألترا ، > 99.5٪سيجما ألدريتشS7653-250G
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) ، الكريات ، 99.998٪ أساس المعادن النزرةسيجما ألدريتش480878-250 جم
سباعي هيدرات ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (Na 2< / sub>HPO4< / sub>•( 7H2O)), & ge; 99.99٪ ، AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sucrose ، SigmaUltra ، & ge ؛ 99.5٪ (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
مرشح حقنة ، معقم ، 0.2 وميكرو ؛ م431219كورنينج
، 3 ملصقر BD309585
ترانسفيرين ، هولو ، بلازما البقركالبيوكيم616420
صبغة تريبان بلو ، 0.4٪جيبكو إنفيتروجينT10282يستخدم هذا لعد الخلايا الحية / الميتة. قم بتجديد محلول تريبان الأزرق القديم إذا أعيد استخدامه عدة مرات ( على سبيل المثال < / em> عدة مرات في الأسبوع لعدة أسابيع) ، لأنه سيشكل رواسب ويؤدي إلى قراءات خاطئة للكثافة الخلوية.
التربسين ، النوع XISigma-AldrichT1005-5G
محلول التربسين-EDTA ، 0.25٪   ؛يتم تحضير محلول مخزون GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5Gفي 50 مجم 5-fluoro-2'-deoxyuridine و 125 مجم من اليوريدين في 25 مل DMEM (8.12 و 20.48 ملي مولار على التوالي).
الكواشف - الكيمياء
الجسم المضاد ، الأرانب متعدد النسيلة المضاد ل MAP2Merck MilliporeAB5622
الأجسام المضادة ، كوكتيل الفأر أحادي النسيلة المضاد ل GFAPMerck MilliporeNE1015
- الوشم
AIMSأنظمة تحديد هوية ووضع العلامات ، Inc.نيو &# 8211; 9نظام وشم القوارض حديثي الولادة هو نظام كهربائي يعمل عن طريق تحريك إبر الوشم المكونة من 1 أو 3 نقاط بسرعة عموديا في الجلد. قم بتنشيط آلة الوشم مرة واحدة لمدة 0.5 ثانية تقريبا ، بينما يتم الاحتفاظ بأطراف إبرة الوشم بشكل عمودي على سطح الجلد. نحن نفضل الوشم بثلاث إبر لتعظيم المنطقة الموشومة ، لكن الوشم بإبرة واحدة فعال في المناطق الضيقة ، < > على سبيل المثال < / م > أصابع القدم ، أو إذا كان التحكم الميكانيكي الدقيق ضروريا ، < > على سبيل المثال < / م > عندما تكون الأرقام. عادة ما تكون جولتان من الوشم بأبطأ سرعة (تحديد "1" من أصل 3 خطوات) كافية لإنتاج وشم مرئي وطويل الأمد لوسادات المخلب.
المعدات - التنميط
نظام الرحلان الكهربائي ، أفقي ، واسع ميني &# 8211 ؛ الخلية الفرعية GTBIO &# 8211 ؛ RAD170– 4405معلمات الرحلان الكهربائي النموذجية هي شدة المجال الكهربائي عند 6 فولت / سم ومدة 25 دقيقة لجل 10 سم.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR ، MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل لجين Tor1a في &# 916 ؛ E-torsinA فئران knock-in هي كما يلي: 1 دورة من التمسخ في 94 &# 176; C لمدة 3 دقائق ، 35 دورة من التمسخ عند 94 &# 176 ؛ C لمدة 30 ثانية ، التلدين عند 58 &# 176 ؛ C لمدة 30 ثانية ، تمديد عند 72 &# 176 ؛ ج لمدة 2 دقيقة. يتبع ذلك التمديد النهائي عند 72 &# 176 ؛ C لمدة 10 دقائق ، وعقد عند 4 &# 176 ؛ C.
مزود الطاقة ، معدات PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
- زراعة
عداد الخلايا الآلي ، الكونتيسةGIBCO-InvitrogenC10310يقيس عداد الخلايا الآلي هذا بشكل منفصل كثافة الخلايا الحية والميتة (غير ملطخة وملطخة باللون الأزرق ، على التوالي). من المهم معرفة النطاق الأمثل لقياسات الكثافة: العداد الذي نستخدمه لديه أعلى دقة في النطاق من 1 × 105< / sup> إلى 4 × 106< / sup> خلايا / مل. إذا كانت قيم كثافة الخلية المقاسة خارج النطاق الموصى به، فاضبط حجم إعادة التعليق بشكل مناسب.
خزانة السلامة البيولوجية ، الفئة الثانية ، النوع A2NUAIRENU-425-400هذا الغطاء لجميع إجراءات زراعة الخلايا ، باستثناء تشريح الدماغ.
CO2< / sub> حاضنة ، تدفق تلقائي ، سترة مائية للتحكم في الرطوبةNUAIRENU-4850
مقعد نظيف أفقيNUAIRENU-201-330هذا المقعد النظيف لتشريح الدماغ (الخطوتان 3.1.1 و 3.1.2 من "تشريح الدماغ والتفكك الخلوي)".
أوربت LS منخفض السرعةLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus فائق السرعةفيشر46910 (جهاز طرد مركزي) / 46922 (دوار)
آلة أنظمة تحديد وسم الجينيصبغة البرية الخلايا المعالج بزراعة BD BD طبق من حقنة المناعية معدات الجينيالخلايا يستخدم يستخدم جهاز طرد مركزي

المراجع

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793(2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034(2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245(2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626(2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844(2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895(2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389(2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634(2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965(2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703(2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257(2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111(2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633(2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مزارع عصبونية أوليةطبقة مغذية غرويةاستخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA)تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)الرحلان الكهربائي للهلامتشريح الدماغهضم الأنسجةتفكيك الخلايااستزراع الخلايا العصبونية
رابيد التنميط الجيني للحيوانات تلاه إنشاء الثقافات الأولية من الخلايا العصبية في الدماغ
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.