نقدم في المختبر الماوس الجنين نظام الثقافة أرومة الحمراء الكبد أن يشرح المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. هذا النظام يسهل التحليل الوظيفي للجينات محددة في مراحل النمو المختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الماوس الجنين الكبد نظام الثقافة لتشريح الهدف جين وظائف في المراحل المبكرة والمتأخرة من محطة الكريات الحمر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ينطوي الكريات الحمر عملية ديناميكية التي تبدأ مع وحدات ملتزمة محمر انفجار تشكيل (الاتحاد البلغاري في Es-)، يليه تقسيم بسرعة محمر مستعمرة (كفو-الخانات). بعد كفو-ES، الخلايا هي معترف بها شكليا ويسمى عموما الأرومة الحمراء الطرفية. واحدة من التحديات لدراسة الكريات الحمر المحطة هو عدم وجود مناهج تجريبية لتشريح وظائف الجينات بطريقة متسلسلة زمنيا. في هذا البروتوكول، ونحن تصف استراتيجية فريدة من نوعها لتحديد وظائف الجينات في المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. في هذا النظام، وتنقيته الماوس TER119 كبد الجنين (محمر ناضجة خلية علامة) الأرومة الحمراء السلبية وtransduced مع التعبير خارجي من cDNAs أو الرنا دبوس صغير (shRNAs) للجينات الفائدة. ومثقف الخلايا بعد ذلك في عوامل النمو الأخرى من المتوسط تحتوي الإريثروبويتين (EPO) للحفاظ على مرحلة السلف لمدة 12 ساعة بينما يسمح للcDNAs الخارجية أو shRNAsللتعبير. تم تغيير الخلايا لإبو المتوسطة بعد 12 ساعة للحث على تمايز الخلايا وانتشارها في حين أعرب عن المواد الوراثية خارجية بالفعل. هذا البروتوكول يسهل تحليل وظائف الجينات في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة. لدراسة المرحلة المتأخرة محطة الكريات الحمر، تم زرعها في خلايا فورا إبو المتوسطة بعد ترنسدوكأيشن. وبهذه الطريقة، كانت خلايا متباينة بالفعل إلى مرحلة متأخرة من الكريات الحمر عند محطة وأعرب عن المواد الوراثية transduced. نوصي التطبيق العام لهذه الاستراتيجية التي من شأنها أن تساعد على فهم وظائف الجينات مفصلة في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة.
المقدمة
الكريات الحمر هي عملية تمايز الخلايا الجذعية المكونة للدم متعددة القدرات لتنضج كرات الدم الحمراء. وتشمل هذه العملية تدريجية تشكيل وحدات تشكيل ملتزمة محمر انفجار (الاتحاد البلغاري-ES) وعلى سرعة تقسيم الوحدات محمر تشكيل مستعمرة (كفو-ES) وشكليا والأرومة الحمراء التعرف 1،2. الكريات الحمر محطة من الخلايا الاولية كفو-E-إرثروبويتين ينطوي متتابعة تعتمد ومراحل مستقلة 2،3. في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة، هرمون الإيريثروبويتين تربط لمستقبلات على سطح الخلية ويدفع سلسلة من مسارات إشارات المصب التي تمنع موت الخلايا المبرمج الخلية وتعزيز الانقسامات الخلوية السريعة والتعبير الجيني 1،4. في مرحلة متأخرة م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة نورث وسترن المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
1. إعداد متوسط الثقافة
- إعداد الحل فبرونيكتين. إضافة 1 مل من الماء إلى قارورة واحدة من فبرونيكتين الإنسان (1 ملغ). ترك حل في غطاء الثقافة الأنسجة لمدة 30 دقيقة دون الانفعالات. نقل السائل الإجمالي إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني لجعل تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل وتخلط جيدا بلطف. جعل الحل فبرونيكتين جديدة قبل طلاء لوحة (انظر أد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1 الاستراتيجيات التجريبية. يتكون البروتوكول من شرطين مستقلة لاستهداف وظائف الجزيئات يشير في المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. تم تنقيته TER119 السلبية الأرومة الحمراء الكبد الجنين من الماوس E13.5 الجنين. أظهر تحليل تدفق cytometric من خلايا الكبد محمر الجنين قبل وبعد التنقية أن تنقية كانت فعالة (أرقام 2A و 2B). للمرحلة الأولى من محطة الكريات الحمر (الشكل 1، الخطوط المتقطعة)، بعد تنبيغ ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نقدم نظام فريد لتحليل زمنيا الماوس الجنين تكون الكريات الحمر محطة الكبد. من خلال تطبيق الشروط ثقافة مختلفة، ونحن تشريح بنجاح الكريات الحمر محطة في المراحل المبكرة والمتأخرة. هذا مهم بشكل خاص لتحديد آليات الجينات مع وظائف متعددة. على سبيل المثال، GTPases RAC تلعب أدوارا مهمة في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة. تثبيط راك GTPases في المرحلة الأولى من تمايز الخلايا الكريات الحمر التأثيرات الطرفية والانتشار. من ناحية أخرى، وتثبيط نشاط راك GTPases في مرحلة متأخرة من محطة كتل ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة R00HL102154، والجمعية الأمريكية لأمراض الدم جائزة الباحث إلى P جي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Modul Dulbecco MediumIMDM (IMDM) من Iscove Medium IMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | الجوزاء Bio-product | 700-102P | |
| محلول البنسلين والستربتومايسين | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences ؛ | 14-8001-80 | |
| ماوس المؤتلف Interleukin-6 (IL-6) | الجوزاء الحيوية المنتج | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | مخزون 10٪ في IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U / ml |
| مخزون جزيئات الستربتافيدين بالإضافة إلى | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| أنبوب دائري القاع من البولي بروبيلين ، 5 مل | فالكون | 352063 |
المراجع
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
