يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في الوقت الحقيقي السمسة فحوصات في الدم الكامل بالبشر

12K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51941

⸱

نوفمبر 7, 2014

 ,  ,  , 
1Research and Development, Adheren, Inc, 2Research and Development, Eureka Therapeutics

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

كامل فحص السمية الخلوية الدم (التعداد الزراعي العالمي) هو فحص السمية الخلوية المتقدمة من خلال دمج الإنتاجية العالية تكنولوجيا تحديد المواقع المحمولة مع المجهري مضان ومعالجة الصور الآلي. هنا، نحن تصف كيفية التعامل مع خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الأجسام المضادة مكافحة CD20 يمكن تحليلها في الوقت الحقيقي في الدم البشري كله لتوفير التحليل الكمي السمسة الخلوية.

الملخص

ووضعت على أساس الخلايا الحية فحص الدم الكامل السمية الخلوية (التعداد الزراعي العالمي) التي تتيح الوصول إلى المعلومات الزمنية من السمية لخلايا الكلية مع الإنتاجية العالية تكنولوجيا تحديد المواقع الخلية. ومبرمجة السكان الخلايا السرطانية المستهدفة أول من الشلل في شكل مجموعة، وصفت مع الأخضر الأصباغ الفلورية عصاري خلوي. بعد تشكيل مجموعة خلايا، يتم إضافة أدوية الأجسام المضادة في تركيبة مع الدم البشري كله. ثم يضاف يوديد propidium (PI) لتقييم موت الخلايا. ويتم تحليل مجموعة الخلايا مع نظام التصوير التلقائي. بينما الصبغة عصاري خلوي تسميات السكان الخلايا السرطانية المستهدفة، PI تصف السكان الخلايا السرطانية الميتة. وبالتالي، فإن النسبة المئوية للقتل الخلايا السرطانية المستهدفة يمكن كميا عن طريق حساب عدد الخلايا المستهدفة على قيد الحياة إلى عدد من الخلايا الميتة المستهدفة. مع هذا الأسلوب، والباحثين قادرون على الوصول تعتمد على الوقت والمعلومات السمية لخلايا تعتمد على الجرعة. بشكل ملحوظ، لا راديو الخطرةوتستخدم المواد الكيميائية. في التعداد الزراعي العالمي المعروضة هنا تم اختبارها مع سرطان الغدد الليمفاوية وسرطان الدم، وخطوط الخلايا السرطانية الصلبة. لذا، WCA يسمح للباحثين لتقييم نجاعة الأدوية في حالة شديدة الصلة خارج الحي.

المقدمة

وقد أدت التطورات الحديثة في الصناعة الدوائية لزيادة الاهتمام في تحقيق هويات معينة من الأجسام المضادة الخلايا السرطانية وعلاج السرطان شخصية. ومع ذلك، واجه عدة عقبات في هذه العملية. مرخصة 5٪ فقط من العوامل التي لها نشاط مضاد للسرطان في التنمية قبل السريرية بعد تبين فعالية كافية في المرحلة II-III 1،2 الاختبار. الاستراتيجيات قبل السريرية (سواء في التجارب المختبرية والحية) غير كافية كما أظهرت العديد من الأمثلة التي المخدرات انتيتومور تتصرف بشكل مختلف في البشر والحيوانات في المختبر يرجع ذلك أساسا إلى مكوناتها الدم المختلفة 3-5.

لمعالجة ضرورة منصة فحص المخدرات انتيتومور وتوفير نقطة تفتيش قبل التجارب على الحيوانات مكلفة والتجارب السريرية، يقترح كله فحص السمية الخلوية الدم البشري (التعداد الزراعي العالمي) لتقييم فعالية الدواء المضاد للورم في بيئة أكثر البيولوجية ذات الصلة. الفحص الدم كله سمية الخلايا يمكن استخدامها لتقييم مدى استجابة الخلايا الفردية إلى الأجسام المضادة ومرشحين آخرين في المخدرات الدم البشري كله.

يتم تطوير التعداد الزراعي العالمي من خلال دمج التكنولوجيا العالية الإنتاجية تحديد المواقع المحمولة مع الإنتاجية العالية وارتفاع محتوى التصوير 6. من خلال الاستفادة من نظام التصوير الآلي، ويمكن تحديد عدد الخلايا الحية والميتة على حد سواء مع وجود درجة عالية من الدقة. يرجع ذلك إلى حقيقة أن الخلايا المستهدفة وثبتوا على نفس المستوى البؤري، التعداد الزراعي العالمي قادر على تقديم تحليل السمية الخلوية الكمي في الوقت الحقيقي دون ازالة خلايا الدم الحمراء. وعلاوة على ذلك، فإن نظام التصوير التلقائي يوفر العديد من المزايا مثل أن الخلايا المستهدفة الوحيدة التي وصلت إلى معايير محددة (على سبيل المثال، خلايا fluorescently المسمى، ومورفولوجيا الخلية) هي بوابات ومعالجتها. أيضا، فإنه يتيح إنتاج 144 لوحات في اليوم الواحد. وبالتالي، هذه القدرة الإنتاجية التصوير وتتيح تشغيل عالية ج-ontent والتجارب الإنتاجية العالية في وقت واحد. من خلال الجمع بين التعداد الزراعي العالمي ونظام التصوير الآلي، ويمكن تحقيق إنتاجية عالية السمية لخلايا التحليل الكمي في بيئة أكثر البيولوجية ذات الصلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الهدف خلية التحضير

  1. المحافظة (خلايا سرطان الغدد الليمفاوية على سبيل المثال. راجي) الخلايا المستهدفة في وسائط النمو (1640 RPMI مستنبت، مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 4nM L-الجلوتامين، و 500 وحدة دولية / مل البنسلين / الستربتومايسين) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
  2. الطرد المركزي العينة لتكوير الخلايا المستهدفة في أنبوب 15 مل. الوقت الطرد المركزي يختلف مع أنواع مختلفة من الخلايا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 468 x ج لخلايا راجي.
  3. أولا نضح أي فقاعات تشكلت على السطح من طاف، وإزالة طاف بأكمله.
  4. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب. إعادة تعليق الخلايا بواسطة pipetting الحل صعودا وهبوطا عدة مرات لتفريق أجمة الخلية.
  5. الطرد المركزي العينة لمدة 3 دقائق في 468 × ز.
  6. نضح أي فقاعات تشكلت على السطح من طاف، وإزالة طاف بأكمله.

2. إعداد ميكروأرس خلية

  1. يامرفق الخلية btain 96 مجموعات لوحة جيدا أو مجموعة وحيدة الخلية 8 شرائح غرفة البئر (انظر الجدول المواد / الكواشف).
  2. تطبيق 1.2 ميكرولتر من المنشط إلى كاشف الحمض النووي من عدة. تتويج القارورة، عكس ذلك، ويهز بلطف لمزج الحل.
  3. السماح للحل للرد لمدة 20 دقيقة في RT.
  4. تطبيق حل مختلطة لبيليه الخلايا المستهدفة (في أنبوب 15 مل).
  5. إضافة الأصباغ الخضراء مضان عصاري خلوي في تركيز النهائي من 500 نانومتر.
  6. احتضان الخلايا المستهدفة مع الحل المختلط والصبغة لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر المداري.
  7. غسل الخلايا مرتين مع PBS 5 مل، و resuspend الخلايا في وسائل الإعلام 10 مل النمو.
  8. تطبيق 100 ميكرولتر من الحل من الخطوة 2.7 إلى كل بئر. حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. جعل متأكد من أعداد الخلايا تتراوح بين 5 × 04-01 أكتوبر × 10 6 خلايا لكل بئر.
  9. بعد 10-15 دقيقة من الحضانة على RT، وغسل بلطف مرتين مع عينات 200-300 وسائط النمو ميكرولتر لإزالة أي خلايا غير منضم.
    ملاحظة: حول 5-10 يبقى سائط النمو في كل ميكرولتر جيدا بعد الغسيل.

3. الجامع الدم فحوصات السمسة

  1. إضافة 180 ميكرولتر من الدم البشري كله إلى كل عينة بشكل جيد.
  2. الحصول مكافحة CD20 حل الأجسام المضادة في 5 ملغ / مل، وإجراء تخفيف التسلسلي لجعل 50، 20، 10، 5، 2، 1، و 0.5 ميكروغرام / مل من مكافحة CD20 حل الأجسام المضادة في 1.5 مل أنابيب. إضافة 20 ميكرولتر من كل تركيز مكافحة CD20 الأجسام المضادة لكل عينة بشكل جيد مما يجعل يثلث.
  3. إضافة يوديد propidium في تركيز النهائي من 500 نانومتر إلى كل بئر.
  4. احتضان لوحة الناتجة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 16 ساعة.
  5. صورة الخلايا على الشرائح أو 96 لوحات جيدة مع نظام التصوير التلقائي مع 8X التكبير.
  6. استخدام برنامج العد خلية من نظام التصوير التلقائي لقياس النتائج.
    ملاحظة: البرنامج من نظام التصوير التلقائي يوفر بسيطخطوة بخطوة عمليات العد الخلية. بروتوكول لاستخدام هذا البرنامج ويمكن الاطلاع على الموقع الالكتروني الموفر.
  7. حدد [النتائج مراجعة] من الصفحة الرئيسية للبرنامج.
  8. اختر [الملف المحفوظ لعينات].
  9. البوابة الأولى يعني FITC كثافة> 50، ثم بوابة TxRed يعني كثافة> 20.
  10. حدد [نبذة عن اللوحة].
  11. [تحديد جداول التصدير].
    ويظهر صيغة قتل الخلايا نسبة البرنامج أدناه: ملاحظة:
    قتل الخلية المستهدفة٪ = (# الخلايا الملون كلا الأخضر والأحمر / عدد الخلايا الملون الأخضر) * 100٪

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد تم اختيار الأجسام المضادة وخلايا سرطان الغدد الليمفاوية (خلايا راجي وMC / CAR) مكافحة CD20 كنظام نموذج للتدليل على كامل فحص السمية الخلوية الدم (التعداد الزراعي العالمي) 7،8. وكان عدد خلايا راجي نسخة عالية من CD20 على سطح الخلية، في حين أن خلايا MC / CAR انخفاض عدد نسخة من CD20 على غشاء بهم. تم صبغ الخلايا المستهدفة أولا الخضراء مع الأخضر الأصباغ مضان عصاري خلوي والمحتشدة على لوحة 96-جيدا. وقد ثبتوا 50،000 خلايا سرطان الغدد الليمفاوية هدف في كل بئر - 10،000. تمت إضا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التعداد الزراعي العالمي هو حاسم في المختبر المضادة للسرطان أداة فحص مع قرار خلية واحدة 12-16، الاستفادة بشكل مثالي بعد الهدف العروض التقليدية مثل CDC والمقايسات ADCC 9-11، وقبل الاختبارات قبل السريرية الحيوانية. حاليا، الهدف الأساسي فحوصات مثل فحص CDC أو المقايسات ADCC يتم تنفيذ كل ذلك في وسائل الإعلام مبسطة أو نظام المخزن. ومع ذلك، والمرشحين المخدرات التي تظهر في هذه الفعالية نظام المخزن مبسط ليست دائما فعالة في نظام الدم كله أكثر تعقيدا. وبالتالي، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

نشكر برنامج IMAT المعهد الوطني للسرطان من المعاهد الوطنية للصحة تمويل هذا العمل [R33 CA174616-01A1].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرفق الخلية 96 مجموعة لوحة البئر  AdherenAP9601
تعليق مجموعة خلية واحدة 8 شريحة غرفة جيدةAdherenSS0801
مجموعة خلية واحدة ملتصقة 8 شريحة غرفة بئرAdherenSS0802
خط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية CD20 +ATCCCCL-86خلايا راجي
خط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية CD20-ATCCCRL-8083MC / CAR
RPMI 1640 مع L-glutamineLife Technologies11875-119
مصل الأبقار الجنينيالحراريSH30070.01HI
Peni / StrepLife Technologies15070063
صبغة العصارة الخلويةLife TechnologiesC7025Cell Tracker Green
Rituxan (Biosimilar)  Eureka Therapeutics
البشريAllcellsWB001
بروبيديوم يوديدسيجماP4170-10MG
نظام التصوير الأوتوماتيكيالأجهزة الجزيئيةالاتصال بالبائعمراسل الخلية
برنامج عد الخلاياالأجهزة الجزيئيةاتصل بالبائعمراسل الخلية
الدم

المراجع

  1. Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
  2. Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
  3. Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
  4. Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
  5. Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
  6. Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
  7. Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
  8. Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
  9. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  10. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
  11. Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
  12. Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
  13. Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
  14. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580(2009).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
  16. Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
  17. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).
  18. Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

سمية الدم الكامل الخلويةالخلايا السرطانية المستهدفةيوديد البروبيديومنظام التصوير الآليتكوين مصفوفة خلويةالجسم المضاد Anti-CD20صبغات السيتوبلازم الفلوريةفعالية سمية الدواء الخلوية
في الوقت الحقيقي السمسة فحوصات في الدم الكامل بالبشر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.