RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

Felipe M. Vieceli; C.Y. Irene Yan

doi:10.3791/51951

مقالة منهجية

RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

DOI:

10.3791/51951

⸱

نوفمبر 1, 2014

Felipe M. Vieceli¹ , C.Y. Irene Yan¹

¹Department of Cell and Developmental Biology, Universidade de São Paulo

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا الفيديو الخطوات الأساسية لإجراء تحليل النسخ الكامل على عينات الحبل الشوكي الجنيني للكتكوت المقطعة بعد التعدي باستخدام التثقيب الكهربائي في البيضا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في البيضا يعد التثقيب الكهربائي للأنبوب العصبي للكتكوت طريقة سريعة وغير مكلفة لتحديد وظيفة الجينات أثناء التطور العصبي. التحليل الواسع للجينوم للنصوص المعبر عنها تفاضليا بعد مثل هذا التلاعب التجريبي لديه القدرة على الكشف عن صورة شبه كاملة للتأثيرات النهائية التي يسببها البناء المنقول. يصف هذا العمل طريقة بسيطة لمقارنة النسخ من عينات الحبل الشوكي الجنيني المنقولة ، والتي تشمل جميع الخطوات بين التثقيب الكهربائي وتحديد النصوص المعبر عنها تفاضليا. تتكون المرحلة الأولى من إرشادات للتثقيب الكهربائي وتعليمات لتشريح أنصاف الحبل الشوكي المنقولة من أجنة HH23 في بيئة خالية من الريبونوكلياز واستخراج عينات الحمض النووي الريبي عالية الجودة المناسبة لتسلسل النسخ. المرحلة التالية هي تحليل المعلوماتية الحيوية مع إرشادات عامة لتصفية ومقارنة مجموعات بيانات RNA-Seq في خادم Galaxy العام ، مما يلغي الحاجة إلى هيكل حسابي محلي للتجارب الصغيرة والمتوسطة الحجم. تظهر النتائج التمثيلية أن طرق التشريح تولد عينات حمض الريبي عالية الجودة وأن النسخ التي تم الحصول عليها من عينتين تحكميتين هي نفسها بشكل أساسي ، وهو مطلب مهم للكشف عن جينات التعبير التفاضلي في العينات التجريبية. علاوة على ذلك ، يتم تقديم مثال واحد حيث يمكن التحقق بصريا من الإفراط في التعبير التجريبي عن بنية الحمض النووي بعد المقارنة مع عينات التحكم. قد يكون تطبيق هذه الطريقة أداة قوية لتسهيل الاكتشافات الجديدة حول وظيفة العوامل العصبية المشاركة في التطور المبكر للحبل الشوكي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدراسات الجينية على الكائنات الحية كثيرا ما تستخدم الجنين الدجاج كنموذج لأنه في Electroporation للالبيضة يمثل وسيلة سريعة وغير مكلفة لبالنقل جزئيا الهياكل الجنينية في الجسم الحي مع الحمض النووي يبني ^1-5. ناقلات التعبير Bicistronic التي تكود نسخة واحدة تحتوي مراسل فلوري مع الجينات في المصالح، مثل pCIG ⁶ أو ⁷ pMES، يسمح بالتحقق السريع للجودة ترنسفكأيشن في المنطقة المطلوب بموجب stereomicroscope قبل معالجة الأجنة لتحليل المصب.

مع التطورات الحديثة في تسلسل الحمض النووي، أصبح من الممكن الآن الحصول رقمية كا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Electroporate التركيبة الاهتمام في الأنابيب العصبية للأجنة الدجاج HH12-13 في البيضة

استخدام مراسل الفلورسنت، ويفضل في نسخة bicistronic أو تنصهر للبروتين في المصالح مع الإقحام الفيروسي 2A الببتيد ^11، لتمكين سرعة تحديد الأفراد ذوي مستويات مرضية من ترنسفكأيشن. ملاحظة: فترة حضانة نموذجية لهذه المرحلة حوالي 48 ساعة في 37.8 درجة مئوية.

فتح نافذة صغيرة في البيض بعد إزالة 3 مل من الألبومين مع حقنة إلى جانب 18 G × 1 1/2 إبرة. لتعزيز الجنين التصور، حقن كمية ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتحقق من صحة الطريقة الموصوفة، وقد تم توليد عينات سيطرة اثنين من الأجنة electroporated مع pMES ناقلات الفارغة ⁷ وعينة واحدة من أجنة transfected مع نفس ناقلات تحتوي على إدراج بناء SCRT2-ZNF، الذي يشفر المجالات الزنك وأصابع الدجاج SCRT2 ^18. وقد تم الحصول على عينات العائد 11-22 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع كل من برك من 8 إلى 12 الأجنة. جميع العينات الثلاثة سجلت قيمة رين المثلى من 10 في التحقق من جودة أداء مع الصك Bioanalyzer (الشكل 1)، م.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا توفير مبادئ توجيهية لتحليل الآثار بعد Electroporation للمن الحبل الشوكي الدجاج. على الرغم من Electroporation للناقلات الحمض النووي هو أكثر كثيرا ما تستخدم لبإفراط عن الجين من الفائدة، ويمكن للمرء أيضا استخدام التركيبات ترميز السلبيات المهيمنة، والبروتينات quimeric أو السلائف لالرناوات siRNAs لتوليد الظروف وظيفة الجين تدق إلى أسفل ^19-21. في الواقع، مقارنة Transcriptome على التشكيلات الناتجة من كلا gain- والخسارة من وظيفة التحليل قد يشيرون إلى الجينات وأعرب تفاضلي.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CYIY مدعوم من FAPESP (2012 / 14421-5) و FMV مدعوم بزمالة من FAPESP (2009 / 53695-0). نشكر DNA Technologies Core في جامعة كاليفورنيا ، ديفيس على إعداد وتسلسل مكتبات RNA-Seq المستخدمة في هذا العمل ، وفريق Galaxy لتوفير واجهة ممتازة ومجانية لأدوات تحليل بيانات التسلسل عالية الإنتاجية والدكتورة ماريان برونر للسماح لنا بالتصوير في مساحة مختبرها.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الحبر الهندي	أي مورد
18 جم × 1 1/2 إبرة	BD	305196
3 مل حقنة	BD	309657
تريس	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye المستخدمة لتصور محلول حقن الحمض
النووي Ringer (1 لتر)
& nbsp ؛ - 7.2 جم كلوريد الصوديوم	سيجما ألدريتش	S-9888
؛ - 0.37 جم KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
؛ - 0.225 جم CaCl _{2< / sub > &# 8226 ؛ 2H₂O}	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 جم Na₂HPO₄.7H₂O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 جم KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH₂O إلى 800 مل وضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4
؛ - ddH₂O إلى 1 L
- مرشح والأوتوكلاف
PBS (محلول الفوسفات المؤقت) (1 لتر)
& nbsp ؛ - 8 جم كلوريد الصوديوم	سيجما-ألدريتش	S-9888
؛ - 0.2 جرام KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
؛ - 1.15 جم Na₂HPO₄• 7H₂O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 جم KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH₂O إلى 800 مل وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2
- ddH₂O إلى 1 لتر ومرشح
- 1 مل DEPC (ثنائي إيثيل بيروكاربونات)	سيجما ألدريتش	D-5758
؛ - رج العبوة بقوة واتركها طوال الليل في درجة حرارة
؛ - ملعقة غربلة الأوتوكلاف
	أي مورد
معقم 60 × 15 مم أطباق بتري البوليستيرين	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase حل إزالة التلوث	Life Technologies	AM9780
مقص جراحي دقيق	أي مورد
ملاقط دقيقة مستقيمة	مورد
إبرة زجاجية مسحوبة مصنوعة من أنابيب شعرية زجاجية مقاس 1.1 × 75 مم	Kimble Chase	40A502
9 '' زجاج ماصة باستور	أي مورد
مضخة ماصة يدوية	أي مورد
شفاف 1.5 مل أنابيب بولي بروبيلين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة Corning	Sciences	MCT-150-C
الطرد المركزي الدقيقة	أي مورد
RNAحل لاحق لتثبيت الحمض النووي الريبي	Life Technologies	AM7020
RNAطقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي المائي	Technologies	AM1912
علم البيولوجيا الجزيئية الإيثانول	أي مورد
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 الرحلان الكهربائي أداة المحلل الحيوي	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001 / RS-122-2002

الغرفة أي Life أجهزة Life

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FASTQ Cufflinks

RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة