مقالة منهجية

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

DOI:

10.3791/51994

⸱

أكتوبر 9, 2014

 ,  ,  , 
1NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation, Instituto Italiano di Tecnologia, 3Laboratory for Fluorescence Dynamics, Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التوزيع المكاني والديناميكيات الزمنية لبروتينات غشاء البلازما والدهون موضوعا ساخنا في علم الأحياء. هنا تتم معالجة هذه المشكلة من خلال تحليل تذبذب الصورة المكانية والزمانية الذي يوفر من الناحية المفاهيمية نفس الكميات الفيزيائية لتتبع الجسيمات المفردة ، ولكنه يستخدم ملصقات جزيئية صغيرة وإعدادات مجهرية قياسية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التوزيع المكاني وحركة مكونات غشاء مثل الدهون والبروتينات هي عوامل أساسية في تنظيم العديد من الوظائف الخلوية. ولكن نظرا لديناميكية سريعة وهياكل صغيرة المعنية، مطلوب قرار المكانية والزمانية عالية جدا للقبض على السلوك الحقيقي من الجزيئات. هنا نقدم بروتوكول تجريبي لدراسة ديناميات البروتينات والدهون البلازما غشاء fluorescently المسمى في الخلايا الحية لقرار الزمانية المكانية عالية. والجدير بالذكر، لا يحتاج هذا النهج لتتبع كل جزيء، لكنه يحسب سلوك السكان الذين يستخدمون جميع الجزيئات في منطقة معينة من الغشاء. نقطة البداية هي التصوير السريع في منطقة ما على غشاء. بعد ذلك، يتم احتساب المكانية والزمانية وظيفة كاملة الارتباط الذاتي ربط الصور المكتسبة في زيادة تأخير الوقت، على سبيل المثال كل 2، 3، ن التكرار. فمن الممكن إثبات أن العرضمن ذروة المكانية زيادات ظيفة الارتباط الذاتي في زيادة تأخير الوقت بوصفها وظيفة من حركة الجسيمات بسبب نشر. لذا، من المناسب من سلسلة من الوظائف تمكن الارتباط الذاتي لاستخراج البروتين الفعلي يعني تشريد مربع من التصوير (iMSD)، قدم هنا في شكل واضح انتشارية مقابل متوسط ​​النزوح. هذه تعطي الرأي الكمي من متوسط ​​ديناميكية الجزيئات واحدة مع دقة نانومتر. باستخدام متغير GFP الموسومة من مستقبلات ترانسفيرين (TFR) وATTO488 المسمى 1-بالميتويل-2-هيدروكسي SN -glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) فمن الممكن لمراقبة تنظيم الزماني المكاني للبروتين والدهون نشر على المناطق غشاء ميكرون الحجم في نطاق الوقت الجزئي لملي ثانية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدءا من النموذج الأصلي "فسيفساء السائل" حسب المغني ونيكلسون، وصورة من الغشاء البلازمي الخلوي قد تم تحديثه بشكل مستمر خلال العقود الماضية من أجل إدراج دور الناشئة في الهيكل الخلوي والدهون المجالات 1،2.

تم الحصول على الملاحظات الأولى الانتعاش بعد photobleaching من الفلورسنت (FRAP) إزاحة الستار أن جزءا كبيرا من البروتينات الغشاء هو متحرك 3-5. هذه الدراسات الرائدة، على الرغم مفيدة للغاية، عانى من قرار فقيرة نسبيا في الفضاء (ميكرون) والزمن (ثانية) من الاجهزة FRAP. أيضا، ويجري قياس المتوسط ​​الفرقة، FRAP يفتقر في إعطاء معلومات عن سلوك جزيء واحد.

في هذا السياق، وإمكانية لتسمية تحديدا جزيء واحد مع علامات مشرقة جدا (السماح دراسة عملية الانتشار جزيء في وقت واحد) كان ناجحا جدا. بشكل خاص، عن طريق دفعقرار وقت نهج احدة تتبع الجسيمات (SPT) إلى الجدول الزمني ميكروثانية، Kusumi، وآخرون. تمكنت من الوصول إلى ميزات لم تكن معروفة من الدهون والبروتين الديناميات التي أسهمت إلى حد كبير في التعرف على دور القائم على الأكتين هيكل عظمي في غشاء غشاء علم وظائف الأعضاء 6 7. ولدت هذه النتائج ما يسمى في "اعتصام والسور 'النموذج، الذي ينظم الدهون والبروتين نشر بواسطة هيكل عظمي القائم الأكتين. ومع ذلك، من أجل الحصول على كمية هائلة من المعلومات التي قدمتها SPT العديد من القضايا التجريبية لا بد من معالجتها. خاصة، وعادة ما تتألف الإجراء وضع العلامات خطوات كثيرة مثل إنتاج وتنقية وإدخال الأنواع المسمى في النظام. وعلاوة على ذلك، والعلامات الكبيرة، مثل نقاط الكم أو الجسيمات النانوية المعدنية، وغالبا ما يطلب للوصول إلى الجدول الزمني ميلي ثانية واحدة فرعية ويشابك من الجزيئات المستهدفة من قبل التسمية لا يمكن تجنبها في كثير من الحالات. أخيرا، العديد من مساراتوقد ليتم تسجيلها لتناسب المعايير الإحصائية وبصورة متزامنة مطلوب كثافة منخفضة التسمية للسماح تتبع.

مقارنة SPT، مضان الطيفي الارتباط (FCS)، والتغلب على كثير من هذه السلبيات، يمثل نهجا واعدا جدا لدراسة ديناميات الجزيئية. في الواقع، يعمل FCS جيدا أيضا مع تسميات قاتمة وكثيفة، مما يتيح لدراسة ديناميكية الجزيئات الموسومة بروتين فلوري في خلايا عابر. أيضا، فإنه يتيح الوصول إلى إحصاءات عالية في كمية محدودة من الزمن. وأخيرا، على الرغم من "عالية" كثافة العلامات يوفر معلومات FCS الجزيئات واحدة. بفضل كل هذه الخصائص، FCS يمثل نهجا واضحة جدا وطبقت على نطاق واسع لدراسة الدهون والبروتين ديناميكية في كل من الأغشية ونموذج في الخلايا الحية 8-10. لقد تم اقتراح العديد من الطرق المختلفة لزيادة قدرة FCS للكشف عن تفاصيل الانتشار الجزيئي. على سبيل المثال، كان SHالخاصة التي عن طريق أداء FCS على مختلف المناطق الملاحظة الحجم يمكن لأحد أن تعريف "القانون نشر FCS" ملامح المنير الخفية للحركة الجزيئات 11،12. إضافة إلى كونه تختلف في الحجم، وقد تتكرر مجال التركيز أيضا 13، وانتقل في الفضاء على طول خطوط 14-20 أو مترافق مع الكاميرات سريعة 21،22. باستخدام هذه العلاقة "المكانية والزمانية" النهج، وقد وصفت المعلمات البيولوجية ذات الصلة من عدة مكونات غشاء كميا على كل الأغشية البيولوجية نموذج ومنها الفعلية، وبالتالي البصيرة ذات العوائد إلى غشاء التنظيم المكاني.

ومع ذلك، في كل FRAP والتطبيقات FCS وصفها حتى الآن حجم المنطقة المحورية يمثل الحد في القرار المكانية التي لا يمكن التغلب عليها. وقد وضعت عدة طرق التصوير فائقة الدقة مؤخرا لتجاوز هذا الحد. وتقوم بعض على دقة الترجمة، مثل إعادة الإعمار العشوائية المجهر الضوئي (STORM) <سوب> 23،24، تنشيط ضوئي توطين المجهري (النخيل) 25، PALM مضان (FPALM) 26، واحد الجسيمات تتبع PALM (sptPALM) 27: على كمية كبيرة نسبيا من الفوتونات المطلوبة في كل لقطة، ومع ذلك، يحد القرار وقت هذه الأساليب لعدة ميلي ثانية على الأقل، مما يعيق إمكانية تطبيقها في الجسم الحي.

في المقابل، تم فتح بديلا واعدا للقرار التصوير الفاخر وتحوير مكانيا انبعاث مضان مع طرق استنزاف الانبعاث المستحث (STED أو عكسها تشبع التحولات مضان البصرية (RESOLFT)) 28،29. الجمع بين هذه النهج في تشكيل حجم الملاحظة أقل بكثير من الحد حيود مع إمكانية استخدام المجاهر المسح السريع وأنظمة الكشف. في تركيبة مع تحليل مضان التذبذب، STED المجهري يسمح للتحقيق مباشرة ديناميات الزمانية المكانية النانو من الدهون وصroteins في أغشية الخلايا الحية 30،31.

ويمكن الحصول على نفس الكميات الفيزيائية المجهر مقرها STED من قبل معدلة المكانية والزمانية صورة ارتباط التحليل الطيفي (عصي 32،33) الطريقة التي هي مناسبة لدراسة ديناميات بروتينات fluorescently الموسومة الغشاء و / أو الدهون في الخلايا الحية وبواسطة المجهر التجاري. ويتكون البروتوكول التجريبي المقدمة هنا خطوات قليلة. أول واحد يتطلب التصوير السريع من منطقة الفائدة على الغشاء. ثم، يتم استخدام كومة الناتجة من الصور لحساب متوسط ​​ظائف علاقة المكانية والزمانية. عن طريق تركيب سلسلة من المهام ارتباط والجزيئي "القانون نشر" يمكن الحصول عليها مباشرة من التصوير في شكل واضح انتشارية (D التطبيق) - مقابل متوسط ​​درجات مؤامرة التهجير. هذه المؤامرة يعتمد بشكل حاسم على البيئة استكشافها من قبل الجزيئات ويسمح تدرك مباشرة وسائط نشر الفعليةمن الدهون / البروتين من الفائدة.

في مزيد من التفاصيل، كما هو موضح سابقا 34 وظيفة لصناعة السيارات في العلاقة المكانية والزمانية من سلسلة صورة المكتسبة يعتمد بشكل حاسم على ديناميكية الجزيئات تتحرك في صورة سلسلة جمعها (يرجى ملاحظة أن نفس المنطق يمكن تطبيقه في اقتناء خط حيث يعتبر البعد واحد فقط في الفضاء). على وجه الخصوص، نحدد وظيفة العلاقة على النحو التالي:

figure-introduction-1 (1)

أين figure-introduction-2 يمثل قياس كثافة مضان في موقف X، Y و في الزمن t، figure-introduction-3 و figure-introduction-4 يمثل المسافة في x والاتجاهات ذ التوالي، figure-introduction-5 يمثل تأخر الوقت، و figure-introduction-6 يمثل المعدل. هذه الوظيفة يمكن التعبير عنها على النحو التالي:

figure-introduction-7 (2)

حيث يمثل 'N' متوسط ​​عدد الجزيئات في مجال المراقبة، figure-introduction-8 تمثل عملية الالتواء في الفضاء، و figure-introduction-9 يمثل الارتباط الذاتي من الخصر فعال. هذا الأخير يمكن أن تفسر على أنها مقياس لمدى تنتشر الفوتونات من باعث واحد في الفضاء بسبب البصرية / تسجيل الإعداد (ما يسمى انتشار نقطة وظيفة، قوات الأمن الفلسطينية، الجينيحشد يقترب بشكل جيد من قبل وظيفة جاوس). أخيرا، figure-introduction-10 يمثل احتمال لإيجاد الجسيمات على مسافة figure-introduction-11 و figure-introduction-12 بعد فترة زمنية figure-introduction-13 . إذا اعتبرنا ديناميكية ناشر، والتي تتحرك الجزيئات بشكل عشوائي في جميع الاتجاهات وصافي التدفقات ليست موجودة، وهذه الوظيفة أيضا يقترب بشكل جيد من قبل وظيفة جاوس حيث يمكن تحديد التباين مثل متوسط ​​ميدان الإزاحة (MSD) للجسيمات تتحرك . وهكذا، فإن الخصر وظيفة ارتباط (ويشار أيضا figure-introduction-14 )، يمكن تعريفها بأنها مجموع الجسيمات المشاكل العضلية الهيكلية والخصر فعال ويمكن قياس نوبة جاوستينغ وظيفة ارتباط لكل تأخير الوقت. ويقاس ط MSD يمكن استخدامها لحساب انتشارية واضح من الجزيئات تتحرك figure-introduction-15 والتشريد متوسط figure-introduction-16 على النحو التالي:

figure-introduction-17 (3)

figure-introduction-18 (4)

بعض الاعتبارات على الإعداد التجريبية المستخدمة يمكن أن توجه القارئ طوال الأقسام التالية. من أجل إثارة انتقائي fluorophores على الغشاء القاعدي الخلايا سوف نستخدم مجموع التأمل الداخلي (TIR) ​​إضاءة الحية، باستخدام TIR التجاري مضان (TIRF) المجهر (التفاصيل يمكن العثور عليها في قسم المواد). وعلاوة على ذلك، من أجل جمع عشرالبريد مضان سوف نستخدم هدف تضخم عالية (100X NA 1.47، مطلوب الفتحة العددية العالية للإضاءة TIRF) وكاميرا EMCCD (الحجم الفعلي للبكسل على ميكرون رقاقة 16). ليصل إلى حجم بكسل من 100 نانومتر نطبق عدسة التكبير إضافية من 1.6X. كما هو مبين أدناه، ستكون هناك حاجة إلى حل وقت أقل من 1 مللي ثانية لوصف صحيح ديناميات نسبة الدهون في غشاء بسرعة أقل من 100 نانومتر. من أجل الوصول إلى هذا القرار الزماني نحن بحاجة إلى تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) أصغر من شريحة كاملة من الكاميرا (512 x 512). في هذه الطريقة، فإن الكاميرا قراءة انخفاض عدد خطوط زيادة القرار الوقت. ومع ذلك، في هذا النظام قراءات الإطار الزمني سيكون محدودا من الوقت اللازم لتحويل الرسوم من التعرض لرقاقة قراءات على الكاميرا وعادة ما تكون في حدود 512 ميلي ثانية لX 512 بكسل EMCCD. للتغلب على هذا الحد، تكنولوجيا ناشئة تتيح تحويل خطوط العائد على الاستثمار فقط بدلا من الإطار كله، ثإيث انخفاض فعالية العملي لحجم رقاقة يتعرض (اقتصاص دعا الاستشعار الوضع في EMCCD لدينا). لهذا التكوين لتكون فعالة، يجب أن تغطي الشريحة خارج العائد على الاستثمار من قبل اثنين من الشقوق التي تقام في مسار بصري. ويمكن تحقيق ذلك بفضل هذا الإعداد قرار الوقت وصولا الى 10 -4 ثواني. يرجى ملاحظة، مع ذلك، أن هذا النهج يمكن أن يقترن مع العديد من الاجهزة التجريبية المختلفة، كما هو موضح في قسم 'نقاش' و.

وسوف تقدم دليلا على الأسلوب في الخلايا الحية، وذلك باستخدام كلا من ATTO488 المسمى 1-بالميتويل-2-هيدروكسي SN -glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-PPE) ومتغير المسمى GFP من مستقبلات ترانسفيرين (GFP- معدل الخصوبة الإجمالي). في حالة ATTO488-PPE هذا النهج يمكن استرداد بنجاح D التطبيق المستمر تقريبا بوصفها وظيفة من النزوح متوسط ​​يدل على نشر معظمها مجانا، كما ذكرت سابقا 30،35. على النقيض من ذلك، يظهر معدل الخصوبة الإجمالي GFP-D لخفض جزئيا-6. وعلاوة على ذلك، في الحالة الأخيرة فمن الممكن لتحديد ثابت الانتشار المحلي ومتوسط ​​مساحة الحبس على العديد من ميكرون على متن الطائرة الغشاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معايرة نظام 1.

  1. نقطة انتشار وظيفة (PSF) المعايرة
    1. تمييع 10 ميكرولتر من 30 نانومتر حل حبة الفلورية (حوالي 5 ميكرومتر) في 90 ميكرولتر من الماء المقطر ثم يصوتن الحل لمدة 20 دقيقة. قطع مربع (1 سم × 1 سم) قطعة من هلام الاغاروز (3٪) والودائع 10 ميكرولتر من الحل في الجزء العلوي من هلام. إسقاط قطعة من هلام على الزجاج السفلي من 2 سم طبق بتري والضغط الانخفاض على الزجاج.
    2. بدوره على الإعداد الاستحواذ، ووضع العينة في حامل، تعيين التعرض الكاميرا وEMgain (100 ميللي ثانية و 1،000 المعلمات هي جيدة ولكن الأمثل وفقا للنظام) وانتظر الكاميرا ليبرد.
    3. ضبط التعرض الكاميرا إلى 100 ميللي ثانية، وكاميرا EMgain إلى 1،000، ووضع إطار لاكتساب نقل، و 100 التكرار والسيارات حفظ الإعداد.
    4. باستخدام العدسة والتركيز الضوء المرسل على الحدود من هلام ومن ثم نقل إلى مركز الهدف من هلام، وضبط التركيز وستاغ الإجراء محاذاة الليزر (LAS في AF، اختر 'الإعداد TIRF "واتبع الإجراء محاذاة السيارات).
    5. العثور على مجال الرؤية مع وجود بقع معزولة واحدة، بدقة التركيز على الفور أكثر إشراقا (التي عادة ما يمثل الخرز مجموع المباراتين) كمرجع، والحصول على 100 لقطة وكرر الخطوة 5-6 مرات من أجل الحصول على العديد من المواقع احدة.
    6. استيراد سلسلة المكتسبة لبرنامج معالجة البيانات والمتوسط ​​مكدس في الوقت المناسب (الشكل 1A) وحدد حبة واحدة معزولة. رعاية لتحديد أصغر منها لتجنب المجاميع الجسيمات.
    7. تناسب كثافة التوزيع المحددة (مثال واحد من الخرز الشخصي ويرد في الشكل 1B) مع وظيفة جاوس باستخدام الأمر "gaussfit" (في أدوات ICS-ماتلاب في المواد في Matlab). تحقق الخير من يصلح عن طريق فحص بقايا الحصول عليها (ويرد مثال الشخصي جاوس المجهزة مع مخلفات المقابلة طن الشكل 1B).
  2. الكاميرا المعايرة
    1. تشغيل الكاميرا وانتظر الكاميرا ليبرد. تعيين إعداد اقتناء كاميرا، (أي للكاميرا المستخدمة وضعناها التعرض إلى 0.5 ميللي ثانية، وكاميرا EMgain إلى 1،000، وطريقة اكتساب لاقتصاص الوضع، وحجم العائد على الاستثمار إلى 32 × 128، 10،000 التكرار) والبدء في الاستحواذ على الكاميرا الخلفية إشارة.
    2. استحوذت الواردات سلسلة الإطار إلى برنامج معالجة البيانات. وتفقد حساب متوسط ​​كثافة في كل بكسل من أجل التحقق من أن الكاميرا الخلفية مسطحة تقريبا في المنطقة المحددة للرقاقة. في الوضع المحصولية، وإزالة أولا ومشاركة عدد قليل من خطوط أفقية (3 إلى 10 تبعا لحجم ROI) لكل إطار لعادة منحازة الكاميرا الخلفية في خطوط الحدود.
    3. إنشاء رسم بياني للقيم (أيضا يعرف المستوى الرقمي، DL) في الصور المكتسبة المكدس (باستخدام الأمر 'اصمت "في Matlab) ورسم لوغاريتممن الناتج التردد (باستخدام القيادة semilogy في Matlab). ويرد مثال على توزيع DL للكاميرا الخلفية في الشكل 2.
      ملاحظة: إذا كان يعمل الكاميرا بشكل جيد، سوف المؤامرة تظهر ذروة حوالي جاوس (لمحة مكافئ في نطاق سجل) يمثل توزيع القيم المرتبطة إلى الصفر الفوتون يعقبه الاضمحلال الأسي (خط مع ميل سلبي في نطاق سجل- ) الذي يمثل توزيع القيم المرتبطة إلى 1 الفوتون (الشكل 2). على وجه الخصوص، المركز والتباين وظيفة جاوس تمثل الكاميرا تعويض والخطأ، على التوالي، في حين ثابت الانحلال للجزء الأسي يمثل تقدير DL تعيين بواسطة الكاميرا إلى كل فوتون واحد. في Matlab استخدام قسم "CalibrateCamera" من سيناريو في المواد الداعمة.
    4. كرر هذه العملية لجميع الكاميرا المحددة EMGain والربح.

2. إعتبرإعداد خلية

  1. لإعداد الليبوزومات اللازمة لدمج 36 الدهون، ويحل بشكل منفصل 1 ملغ من مخدر (1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine)، 1 ملغ من DOTAP (1،2-dioleoyl-3-trimethylammonium-البروبان)، و 1 ملغ من PPE-ATTO488 في 1 مل من الكلوروفورم. مزيج معا 0.5 مل من محلول مخدر، و 0.5 مل من محلول DOTAP، و 25 ميكرولتر من الحل PPE-ATTO488 والجافة في ظل فراغ لمدة 24 ساعة. إضافة 0.5 مل من HEPES عازلة 20 ملي، دوامة لمدة 15 دقيقة ويصوتن لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  2. لإعداد الخلية، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني طبق P100 من متكدسة CHO-K1 (الصينية الهامستر المبيض)، إضافة 1 مل من التربسين وتخزينها في الحاضنة لمدة 5 دقائق. تعليق خلايا منفصلة مضيفا 9 مل من DMEM / F12 المتوسطة تستكمل مع 10٪ من FBS والبذور 150 ميكرولتر من الحل خلية في طبق بتري تحتوي على 800 ميكرولتر من نفس المتوسطة.
  3. متجر في الحاضنة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. لإدراجها الدهون، تحل محل الخلايا المتوسطة مع 500ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة. بعد 30 دقيقة، إضافة 2 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية حلا؛ بعد 15 دقيقة يغسل مع الحزب الاشتراكى البرازيلى وإضافة جديدة المتوسطة DMEM / F12 للتصوير.
  4. لترنسفكأيشن، وخلايا بالنقل وفقا لبروتوكول Lipofectamine (تعليمات الشركة المصنعة) باستخدام معدل الخصوبة الاجمالي-GFP البلازميد ومخزن 24 ساعة في حاضنة قبل التصوير.

3. الحصول على البيانات

  1. إعداد الإعداد
    1. من أجل ترموستات المجهر، 24 ساعة قبل التجربة بدوره على الحاضنة.
    2. من أجل تطبيق اكتساب الوقت الأسرع للتحقيق، والعمل في اقتصاص الاستشعار وضع (انظر المقدمة) واستخدام كاميرا الأولى للتصوير (كاميرا 1) والكاميرا الثانية لتحديد الخلية (كاميرا 2). ويرد مخطط التكوين في الإعداد التكميلية الشكل S1. ثم، لتحقيق المواءمة بين اثنين من الكاميرات بدوره على المجهر وانتظر الكاميرات ليبرد.
    3. تعيين على كل من الكاميرات المعلمات للتصوير الضوء المرسل (أي 20 ميللي ثانية للوقت التعرض، 1 لEM أرباح) ووضع المجهر في وضع مشرق الميدان.
    4. وضع العينات في حامل والتركيز باستخدام العدسة، وإرسال ضوء إلى الكاميرا 1 وبلطف دفع الشقوق السماح الضوء فقط على العائد على الاستثمار المستخدمة في التصوير الخلية (هنا 32 × 32 بكسل ROI).
    5. نقل الخلايا في المنطقة المحددة وإرسال ضوء إلى الكاميرا 2، ثم رسم العائد على الاستثمار في البرمجيات التي تتحكم الكاميرا 2 من أجل أن يكون مرجعا.
  2. التصوير (الشكل 3A)
    1. أولا وقبل كل شيء، محاذاة الليزر TIRF وفقا لإجراءات الإعداد. في الإعداد لدينا، وحدد "الإعداد TIRF" والبدء في إجراء محاذاة السيارات. عندما يتم محاذاة الليزر ضبط 70 نانومتر من عمق الاختراق (حوالي 70 درجة).
    2. ضبط الوقت التعرض ل70 ميللي ثانية وEMGain إلى 100 على كل كاميرا وكاميرا 2 1. ثم، حدد خلية باستخدام كاميرا 1، ثم ترسل الضوء على كاميرا بدقة 2 والتركيز على غشاء الخلية. تحديد الحد الأدنى للتعرض على كاليفورنياميرا 2، 1،000 EMGain، اقتصاص الاستشعار الوضع، 10 5 التكرار ووضع الحفظ التلقائي كما يناسب الملفات (صورة مرنة نظام النقل، وهو الشكل الذي يمكن بسهولة إدارتها).
    3. بدء عملية الاستحواذ لتسجيل سلسلة الصورة. الافراج عن الربح والوضع اقتصاص للسماح تثبيت درجة الحرارة قبل الحصول خلية جديدة، ثم كرر الخطوات الماضيين من أجل الحصول على 8-10 الخلايا.

4. احتساب متوسط ​​ميدان المهجرين من التصوير (ط MSD)

ملاحظة: بروتوكول التالية يمكن تطبيقها مباشرة على البيانات الخام. في نفس الوقت، وبروتوكول كله صالحا لعمليات استحواذ بيانات محاكاة سواء في ماتلاب وSimFCS. الارتباط إلى الدروس المقابلة يمكن العثور عليها في قسم "المواد".

  1. الحساب بواسطة ماتلاب
    1. استيراد سلسلة المكتسبة إلى ماتلاب باستخدام ImportImageSeries النصي. حساب متوسط ​​كثافة كل صورة في الوقت المناسب باستخدام المشاركmmand يعني على الأبعاد الأولى 2 واستخدام مؤامرة لرؤية ناقلات الناتجة عن ذلك.
    2. إذا كان أكثر من 10٪ من photobleaching من هو الحاضر، تجاهل سلسلة أو إزالة الجزء الأول منها. إذا كان أقل، في محاولة لتصحيح تأثير على وظيفة ارتباط بطرح كل صورة إلى متوسط ​​شدته، كما هو مبين قبل 37.
    3. حساب متوسط ​​كثافة كل بيكسل باستخدام الوسط على البعد الثالث، وانظر الصورة الناتجة.
      مطلوب اهتمام خاص من أجل تجنب الارتباطات مصطنعة: ملاحظة. في الواقع، كما هو موضح سابقا لتقنيات مشابهة 38، حدود الخلية وكذلك من الحويصلات التركيز يمكن أن يعرض ارتباط قوي. إذا كان التفتيش من الصورة متوسط ​​يكشف حدود الخلية أو من الحويصلات التركيز، في محاولة لاستبعاد المنطقة المعنية خلاف ذلك تجاهل عملية الاستحواذ. لتصحيح تأثير هذه الهياكل متحركة طرح متوسط ​​كثافة الزمنية من كل بكسل 39.
    4. حساب ركان الارتباط الزماني المكاني (G (ξ، χ، τ)) باستخدام الدالة CalculateSTICScorrfunc. إزالة G (ξ، χ، 0) لأن ارتباط بسبب الضوضاء بالرصاص في نظام الإضاءة المنخفضة يهيمن G (0،0،0). العلاقة بسبب كاشف يهيمن على G (± 1،0،0)، وحركة الجسيمات خلال فترة التعرض يمكن أن تشوه G (ξ، χ، τ) لτ = 0 عن طريق زيادة قياس الخصر (هذا التأثير يختفي لτ > 0) 34.
    5. متوسط ​​G (ξ، χ، τ> 0) استخدام لمرة وبن لوغاريتمي للحد من الضوضاء باستخدام وظيفة "LogBinStack" في دعم المواد ومن ثم تناسب الناتجة G (ξ، χ، τ) باستخدام وظيفة "gaussfit" ل أدوات ICS-ماتلاب في المواد لاسترداد ط MSD (العمود الثاني من المصفوفة الناتجة).
    6. رسم σ الحصول الخصر (τ) 2 (ط MSD) بوصفها وظيفة من الزمن. إذا كانت البيانات صاخبة جدا، في محاولة لزيادة عدد acquإطارات IRED، وزيادة قوة الليزر، متوسط ​​أكثر G (ξ، χ، τ) معا.
  2. الحساب بواسطة SimFCS
    1. فتح ملفات المكتسبة مع يماغيج باستخدام BioFormat المستورد البرنامج المساعد وحفظ سلسلة المكتسبة وتسلسل المشاجرة.
    2. فتح أداة SimFCS وحدد RICS وحدد ملف> استيراد صور متعددة (التكميلي الشكل S2).
    3. اختر صالح، أدخل المعلمات اقتناء الصحيحة وإغلاق النافذة مناسبا (التكميلي الشكل S3).
    4. اختر عرض> متوسط ​​الكثافة> CH1 والتحقق من وجود photobleaching من (التكميلي الشكل S4).
    5. إذا كان أكثر من 10٪ من photobleaching من هو تجاهل الحاضر سلسلة أو إذا كان من الممكن الحمل مرة أخرى في تسلسل الصور إزالة الجزء الأول من هذه السلسلة.
    6. إذا تبيض هو أقل من 10٪ اختر الأدوات> ط MSD> تعيين المعلمات، والتحقق من "استخدام المتوسط ​​المتحرك"، تعيين في لوحة دوروا على اليسار وبني مصفر من إطار للمتوسط ​​المتحرك الاهتمام أن الوقت مراسل أعلى من وقت الانتشار المميز (لالجسيمات تتحرك في 1 ميكرون 2 ثانية -1 زمن 10 ثانية هو المتوسط ​​المتحرك جيدا)
    7. اختر الأدوات> iMSD> احسب ط MSD (الشكل التكميلي S5) ومناسبا وتصدير ط MSD من مذكرة منصة (الشكل التكميلي S6).

5. حساب القانون الانتشار من ط MSD

  1. تناسب النقاط القليلة الأولى لاستقراء اعتراض (σ 0 2) (5 نقاط وعادة ما تكون كافية ولكن المزيد من النقاط يمكن تركيبها إذا كانت تظهر سلوكا الخطي) ومقارنة هذه القيمة مع قوات الأمن الفلسطينية تقاس سابقا 2. إذا كانت قابلة للمقارنة، وتجري متابعة ديناميات fluorophores معزولة. على النقيض من ذلك، إذا σ 0 2 2 >> PSF محاولة لاكتساب أسرع لضمان أنديناميات لا مخبأة موجودة 34.
  2. حساب انتشارية واضح (D التطبيق) وتشريد متوسط ​​(R) باستخدام المعادلات 3 و 4 (انظر المقدمة).
  3. مؤامرة D التطبيق بوصفها وظيفة من R للحصول على نشر القانون مقارنة مع ما يقاس مع اختلاف بقعة استنادا FCS 12 (الشكل 3D).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل معايرة الخصر فعال، يمكن للصورة واحدة الفلورسنت النانو حبة يكون الإجراء كما هو موضح في البروتوكول خطوة 1.1. تقدم صورة الفلورسنت نموذجية من هذه الخرز في الشكل 1، وتركيب توزيع كثافة بواسطة دالة جاوس 2D يعطي ظهره مخلفات جيدة ويسمح قياس الخصر دور فعال في 270 نانومتر. هذه القيمة هي في اتفاق جيد مع الحد حيود المتوقع حسب تقدير معادلة رايلي. هذه المعايرة ليست ضرورية لقياس ديناميكية الجسيمات ولكن هو مطلوب منها لقياس حجم الجسيمات واضح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة تتبع الجسيمات (SPT) يمثل واحدة من الاستراتيجيات الأكثر شيوعا لدراسة ديناميات الجزيئية ولها ميزة كبيرة لقياس مسارات الجسيمات. هذا بدوره يسمح يحقق في سلوك الجسيمات قليلة حتى وصفت في نظام معقد. ومع ذلك، للوصول إلى هذه الميزة SPT يحتاج عادة كثافة منخفضة من التحقيق وملصقات مشرقة جدا. بشكل خاص، للحصول على دقة عالية الزمني (المدى μsec) وعادة ما يطلب التحقيق غير العضوية (مثل نقاط الكم أو الجسيمات النانوية المعدنية): في هذه الحالة إجراء معقد الإنتاج، ووضع العلامات والإدراج ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل مدعوم جزئيا من قبل NIH-P41 P41-RRO3155 و NIH P50-GM076516 (منحة إلى EG) ، و Fondazione Monte dei Paschi di Siena (منحة إلى FB).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
iXon Ultra 897AndorDU-897U-CS0
SolisAndor
CHO-K1ATCCCCL-61
ATTO 488 المسمى PPEATTO-TEC GmbHAD 488-151
DOPEAvanti Polar Lipids، Inc.850725
DOTAPAvanti Polar Lipids، Inc.890890
100x البنسلين والستربتومايسين والجلوتامينجيبكو10378-016
DMEM / F-12Gibco21331
FBSGibco10082147
HEPESGibco15630-106   ؛
برنامج PBSGibco10010-023
SimFCS 3.0Globalsيمكن تنزيل البرنامج من هنا: http://www.lfd.uci.edu/globals/
DMI6000 باستخدام معامل TIRFLeica
LAS AFLeica
Lipofectamine 2000Lipofectamine11668019
MatlabMathWork
ImageJNIH
[header]
C-terminal GFP الموسومة مستقبلات TranferrinOriGeneRG200980
AgarSigma AldrichA5306
ChloroformSigma Aldrich528730
حبات اللاتكس ، أصفر وأخضر الفلورسنت ، 30 نانومترSigma AldrichL5155
منظفات سونيكا بالموجات فوق الصوتيةSOLTECETH S3
أطباق بتري WillcoGWSt-3522
مستورد بتنسيق حيوي لأدوات
Matlab http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/ ICS-MatLabhttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip< / a>
محاكاة بواسطة Matlab البرنامج التعليميhttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html
محاكاة بواسطة SimFCS البرنامج التعليميhttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  2. Vereb, G., et al. yet structured: The cell membrane three decades after the Singer-Nicolson model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (14), 8053-8058 (1073).
  3. Ishihara, A., Hou, Y., Jacobson, K. The Thy-1 antigen exhibits rapid lateral diffusion in the plasma membrane of rodent lymphoid cells and fibroblasts. 84 (5), 1290-1293 (1987).
  4. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73 (12), 4594-4598 (1976).
  5. Jacobson, K., Derzko, Z., Wu, E. S., Hou, Y., Poste, G. Measurement of the lateral mobility of cell surface components in single, living cells by fluorescence recovery after photobleaching. J. Supramol. Struct. 5 (4), 10-1002 (1976).
  6. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34, 351-378 (2005).
  7. Kusumi, A., Ike, H., Nakada, C., Murase, K., Fujiwara, T. Single-molecule tracking of membrane molecules: plasma membrane compartmentalization and dynamic assembly of raft-philic signaling molecules. Semin. Immunol. 17 (1), 3-21 (2005).
  8. Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36, 176-182 (1999).
  9. Gielen, E., et al. Diffusion of sphingomyelin and myelin oligodendrocyte glycoprotein in the membrane of OLN-93 oligodendroglial cells studied by fluorescence correlation spectroscopy. C. R. Biol. 328 (12), 1057-1064 (2005).
  10. Weiss, M., Hashimoto, H., Nilsson, T. Anomalous protein diffusion in living cells as seen by fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 84, 4043-4052 (2003).
  11. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophys. J. 89 (6), 4029-4042 (2005).
  12. Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO J. 25 (14), 3245-3256 (2006).
  13. Ries, J., Schwille, P. Studying slow membrane dynamics with continuous wave scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  14. Ruan, Q., Cheng, M. A., Levi, M., Gratton, E., Mantulin, W. W. Spatial-temporal studies of membrane dynamics: scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS). Biophys. J. 87 (2), 1260-1267 (2004).
  15. Berland, K. M., So, P. T., Chen, Y., Mantulin, W. W., Gratton, E. Scanning two-photon fluctuation correlation spectroscopy: particle counting measurements for detection of molecular aggregation. Biophys. J. 71, 410-420 (1996).
  16. Heinemann, F., Betaneli, V., Thomas, F. A., Schwille, P. Quantifying lipid diffusion by fluorescence correlation spectroscopy: a critical treatise. Langmuir. 28 (37), 13395-13404 (2012).
  17. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (25), 9863-9868 (2012).
  18. Sanchez, S. A., Tricerri, M. A., Gratton, E. Laurdan generalized polarization fluctuations measures membrane packing micro-heterogeneity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (19), 7314-7319 (2012).
  19. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy of intact nuclear pore complexes. Biophys. J. 101 (4), 27-29 (2012).
  20. Di Rienzo, C., et al. Unveiling LOX-1 receptor interplay with nanotopography: mechanotransduction and atherosclerosis onset. Sci. Rep. 3, 10-1038 (2013).
  21. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophys. J. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  22. Kannan, B., et al. Electron multiplying charge-coupled device camera based fluorescence correlation spectroscopy. Anal. Chem. 78 (10), 3444-3451 (2006).
  23. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-508 (2011).
  24. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3 (10), 793-795 (2006).
  25. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  26. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  27. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  28. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  29. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  30. Eggeling, C., et al. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457 (7233), 1159-1162 (2009).
  31. Hedde, P. N., et al. Stimulated emission depletion-based raster image correlation spectroscopy reveals biomolecular dynamics in live cells. Nat. Commun. 4, Forthcoming.
  32. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  33. Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. J. Cell Sci. 119, 5204-5214 (2006).
  34. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (30), 12307-12312 (2013).
  35. Mueller, V., et al. STED nanoscopy reveals molecular details of cholesterol- and cytoskeleton-modulated lipid interactions in living cells. Biophys. J. 101 (7), 1651-1660 (2011).
  36. Kleusch, C., Hersch, N., Hoffmann, B., Merkel, R., Csiszar, A. Fluorescent lipids: functional parts of fusogenic liposomes and tools for cell membrane labeling and visualization. Molecules. 17 (1), 1055-1073 (2012).
  37. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophys. J. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  38. Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49 (3), 141-164 (2007).
  39. Digman, M. A., et al. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89 (2), 1317-1327 (2005).
  40. Ritchie, K., et al. Detection of non-Brownian diffusion in the cell membrane in single molecule tracking. Biophys. J. 88 (3), 2266-2277 (2005).
  41. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170, 229-236 (1993).
  42. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  43. Wohland, T., Shi, X., Sankaran, J., Stelzer, E. H. Single plane illumination fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) probes inhomogeneous three-dimensional environments. Opt. Express. 18 (10), 10627-10641 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة