مقالة منهجية
الجنينية الفرخ الثقافات خلايا شبكية تشكل أدوات قيمة لدراسة مبصرة علم الأحياء. قمنا بتطوير تقنية نقل الجينات الفعالة القائمة على البيضة السابقين البلازميد Electroporation للمن شبكية العين قبل الثقافة. هذا الأسلوب يزيد إلى حد كبير من الكفاءة ترنسفكأيشن عبر بروتوكولات المتوفرة حاليا، مما يجعل من الممكن التلاعب الجيني لهذا النظام.
أصبحت الثقافات التخصيب مبصرة مخروط المستمدة من شبكية العين الفرخ الجنينية أداة لا غنى عنها للباحثين في جميع أنحاء العالم دراسة بيولوجيا الخلايا العصبية للشبكية، وبخاصة خلايا مستقبلة للضوء. تطبيقات هذا النظام تتجاوز البحوث الأساسية، لأنها يمكن بسهولة أن تتكيف مع تقنيات إنتاجية عالية لتطوير الأدوية. ومع ذلك، فقد ثبت التلاعب الجيني للخلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين في هذه الثقافات أن تكون صعبة للغاية، مما يشكل قيدا هاما لفائدة النظام. لقد وضعت مؤخرا والتحقق من صحتها والبيضة السابقين تقنية البلازميد Electroporation للأن يزيد من معدل ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية في هذه الثقافات من خمسة أضعاف بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات المتوفرة حاليا 1. في هذه الطريقة يتم منزوعة النواة عيون الفرخ الجنينية في المرحلة 27، تتم إزالة RPE، ويتم وضع الكأس في شبكية العين في حل تحتوي على البلازميد و electroporated باستخدام اخملصصة شيدت بسهولةأقطاب بها. ثم يتم فصلها شبكية العين ومثقف باستخدام الإجراءات القياسية. ويمكن تطبيق هذه التقنية لدراسات overexpression وكذلك إلى downregulation التعبير الجيني، على سبيل المثال من خلال استخدام تكنولوجيا رني يحركها البلازميد، وتحقيق عادة التعبير التحوير في 25٪ من السكان مبصرة. فإن صيغة الفيديو من هذا المنشور جعل هذه التكنولوجيا في متناول الباحثين في هذا المجال، مما يتيح دراسة وظيفة الجين في الثقافات الشبكية الأولية. لقد قمنا بإدراج أيضا شرح مفصل لخطوات حاسمة من هذا الإجراء لتحقيق نتيجة ناجحة والتكاثر.
وقد استخدمت على نطاق واسع مزارع الخلايا فصلها من شبكية العين الفرخ الجنينية لدراسة مختلف جوانب بيولوجيا الخلايا المستقبلة للضوء، بما في ذلك بقائهم 2-9، والتمايز 10-12، ثمرة neurite 13، وأكثر من ذلك. مزايا هذا النظام، وضعت في 1980s من قبل روبن أدلر والمتعاونين والكمال من قبل له وغيرها من الجماعات 14-20، يقيمون في الخصائص الجوهرية للفرخ كنموذج للحيوانات 21. الحجم الكبير للعين الفرخ، حتى في المراحل الجنينية، يوفر كميات كبيرة من المواد للثقافات. وعلاوة على ذلك، عندما يتم تنفيذ الثقافات باستخدام اليوم الجنينية (ED) 5-6 شبكية العين، 55-80٪ من الخلايا الاصلية التي تفرق كما مبصرات ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا العمل وفقا للمبادئ التوجيهية الموصى بها من قبل رعاية الحيوان واستخدام اللجنة في جامعة جونز هوبكنز.
1. في وقت مبكر: إعداد الأدوات والكواشف وأطباق
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
هنا نقدم بروتوكول بسيط لالبلازميد ترنسفكأيشن إلى منزوعة النواة فرخ أكواب شبكية العين للثقافة الخلية فصلها اللاحقة. ويتحقق ترنسفكأيشن بواسطة الصعق الكهربائي باستخدام سهلة لجعل أقطاب مخصصة (الأرقام 1-2). وقد تم تحسين المعلمات الموصوفة في هذا البروتوكول للحصول على الكفاءات ترنسفكأيشن التي تتراوح بين 20 و 27٪ (بمتوسط 22٪) (الشكل 3D). لاحظ أنه، للأسباب المذكورة أعلاه، كميا هذه النتائج بعد 4 أيام في الثقافة. في هذا السياق، يشير كفاءة ترنسفكأيشن إلى ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الخطوة الأكثر أهمية لنجاح هذا البروتوكول هو اختيار المرحلة المناسبة من الأجنة. في المنشورات السابقة، وتعطى مجموعة من المراحل الجنينية لهذه الثقافات، الذي يعرف عادة قبل أيام من الحضانة أو الجنينية أيام (ED)؛ وبالتالي فإنه عادة ما يفترض أن استخدام ED 5 إلى 6 ED الأجنة سوف تسفر عن نتائج مماثلة. ومع ذلك فقد وجدنا أن على خشبة المسرح 27 (ED 5)، الكفاءة ترنسفكأيشن ستكون حوالي 22٪ من مجموع السكان الخلية، كما ورد أعلاه؛ بعد الكفاءة ستنخفض إلى 16٪ في حالة استخدام المرحلة 28 الأجنة (ED 5.5)،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.
نود أن نتوجه بالشكر إلى ديفيد أوبراين لدعمه في تحليل البيانات ، وجميع أعضاء مختبر Canto-Soler لمناقشاتهم النقدية. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة EY004859 و EY022631 (MVCS) ، و Core Grant EY1765 ، ومنحة إدارية غير مقيدة من Research to Prevention Blindness، Inc.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX / Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode ، على شكل حرف L ، 5 مم طرف ذهبي | BTX / Harvard Apparatus | 45-0115 نموذج 512 | قطب كهربائي ذهبي يستخدم كقطب كهربائي مائل بالذهب كقطب |
| فينيشن | طبي | حسب الطلب | القطر الداخلي: 0.5 مم / سمك الجدار: 0.15 - 0.2 مم. تستخدم لعزل القطب الكهربائي |
| ذو الرأس الذهبيخيوط صندوقية مربعة 2.5 مم ، بعرض 4.5 مم | شركة Sutter Instrument | Company FB245B | تستخدم لصنع قطب الكاثود |
| HBSS ، بدون كالسيوم ، لا مغنيسيوم ، لا فينول أحمر | Gibco - Life Technologies | 14175-095 | |
| ملقط مولوني | Roboz | RS-8254 | مسنن ؛ منحنى طفيف 4.5 "طول |
| ملاقط دومون 5/45 | Roboz | RS-5058 | نمط # 5 ، زاوية 45 درجة ؛ .10 × .06 مم حجم الطرف ؛ 109 مم طول |
| ملقط صغير ، 1x2 أسنان | Roboz | RS-5172 | منصة ربط ؛ أسنان 1x2 ، أسنان 0.12 مم ؛ طول 3.75 بوصة ؛ عرض الطرف 0.3 مم |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن