Method Article

كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون

DOI:

10.3791/52009

⸱

October 28th, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Division of Hematology, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology, The Children's Hospital of Philadelphia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان من الدم المحيطي باستخدام استراتيجية إعادة برمجة يصبوغ مقرها ومثبطات deacetylase هيستون.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتوضح هذه المخطوطة بروتوكول لخلق بكفاءة من صنع الإنسان خلايا خالية من التكامل الجذعية المحفزة (iPSCs) من الدم المحيطي باستخدام البلازميدات episomal وdeacetylase هيستون (HDAC) مثبطات. مزايا هذا النهج ما يلي: (1) استخدام كمية ضئيلة من الدم المحيطي كمادة المصدر؛ (2) nonintegrating ناقلات إعادة برمجة. (3) وسيلة فعالة من حيث التكلفة لتوليد iPSCs خالية النواقل؛ (4) وترنسفكأيشن واحد؛ و (5) استخدام جزيئات صغيرة لتسهيل إعادة برمجة جينية. باختصار، يتم عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من عينات الفصد الروتينية ومن ثم تربيتها في عوامل نمو محددة لانتاج الكريات الحمر السكان الخلية السلف التكاثري للغاية وقابلة للبرمجة بشكل ملحوظ. Nonintegrating، البلازميدات episomal nontransmissible معربا عن OCT4، SOX2، KLF4، MYCL، LIN28A، والبروتين p53 دبوس الشعر القصير (SH) RNA هي introduدائرة الهندسة المدنية في الأرومة الحمراء المستمدة عبر nucleofection واحد. Cotransfection من يصبوغ التي تعبر عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) يسمح لسهولة تحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. يضاف البلازميد-تكرار نقص منفصل معربا عن ابشتاين بار مستضد النووي (1 EBNA1) أيضا إلى خليط التفاعل لزيادة التعبير عن البروتينات episomal. ثم يتم مطلي الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على طبقة من الخلايا الليفية الفأر الجنينية المشع (iMEFs) لاستمرار إعادة برمجة. حالما تظهر المستعمرات IPSC تشبه في حوالي اثني عشر يوما بعد nucleofection، يتم إضافة مثبطات HDAC إلى المتوسطة لتسهيل إعادة جينية. وقد وجدنا أن إدراج مثبطات HDAC يزيد بشكل روتيني الجيل المستعمرات IPSC برمجتها بالكامل بنسبة 2 أضعاف. مرة واحدة المستعمرات IPSC المعرض نموذجي الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) التشكل، يتم نقلها برفق لiMEF الفردية المغلفة لوحات زراعة الأنسجة لاستمرار النمو والتوسع.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستمد iPSCs من الأنسجة الجسمية عن طريق التعبير خارج الرحم من مجموعة صغيرة من جينات تعدد القدرات. وقد تجلى هذا الأسلوب في البداية من قبل تنبيغ فيروسات من الخلايا الليفية الإنسان مع OCT4، SOX2، KLF4، وcMYC، التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في الدولة المحفزة 1. أعرب عابر هذه "عوامل إعادة برمجة" يغير المشهد جينية والجينات الشخصية التعبير الخلية المستهدفة مماثلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية 2. مرة واحدة تم إنشاؤها، iPSCs يحتمل أن تكون متباينة في أي نوع الأنسجة لمزيد من التحقيق. وبالتالي، فإنها تبشر لاستخدامها في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، وتطبيقات العلاج الجيني. ومع ذلك، وتعطيل الجينات مع فيروسات دمج لديه القدرة على تغيير الجينات الذاتية، تأثير النمط الظاهري الخلوية، والتحيز في نهاية المطاف النتائج العلمية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن التكامل الفيروسية عشوائية تؤدي إلى البريد الخلوية ضارأثر بعض، بما في ذلك إمكانية التحول الخبيث 3 أو إعادة التعبير عن الجينات المحورة أنكجنيك 4. سوف التطبيقات السريرية في المستقبل يتطلب دمج الجيل غير IPSC.

Episomes، والتي هي خارج الكروموسومات دائري جزيئات الحمض النووي، وتقدم استراتيجية لتوليد فعالة من حيث التكلفة، وخالية من التكامل iPSCs 5. مزيج من ناقلات episomal هو مبين في الجدول 1 التعبير عن عوامل إعادة برمجة OCT4، SOX2، KLF4، MYCL، وLIN28A. يحتوي pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F البلازميد أيضا البروتين p53 shRNA لقمع مؤقت من TP53 لتعزيز إعادة برمجة الخلايا 6. تكرار نقص pCXWB-EBNA1 ناقلات يعزز التضخيم من عوامل إعادة برمجة وإعادة برمجة زيادة الكفاءة من خلال توفير زيادة عابرة في EBNA1 التعبير 7. ويمكن أن يضاف البلازميد pCXLE_EGFP إلى خليط nucleofection لغرض DETErmining كفاءة ترنسفكأيشن أو لتطبيقات الخلايا الفرز. باستثناء ص CXWB-EBNA1، البلازميدات episomal المستخدمة في هذا البروتوكول تتضمن أصل فيروس ابشتاين بار من تكاثر الفيروس وEBNA1 الجين، الذي توسط التكرار وتقسيم يصبوغ أثناء انقسام الخلية المضيفة 8. يتم فقدان episomes تلقائيا مع التوسع التوالي IPSC 7. استنساخ فرعي وتوصيف iPSCs مع episomal فقدان ناقلات، والتي يمكن استنتاجها من فقدان EGFP التعبير، يمكن أن يؤدي إلى التكامل iPSCs خالية تماما للتطبيقات السريرية في المستقبل.

ملازمة لعملية توليد IPSC هو قمع للجينات محددة النسب وتنشيط الجينات المرتبطة تعدد القدرات. تنظيم التعبير الجيني يحدث على مستويات متعددة داخل النواة، بما في ذلك إدخال تعديلات على الحمض النووي والكروماتين للسماح عوامل النسخ، والعناصر التنظيمية DNA، RNA وصول البلمرة لاستهدافالجينات. إعادة تشكيل المشهد جينية عبر تعديلات الكروماتين العالمية عنصرا رئيسيا لإعادة التعبير عن البرنامج الوراثي تعدد القدرات. وهناك تعديل لونين محدد مهم في تنظيم التعبير الجيني هو أستلة من الهستونات خاصة في بقايا يسين، الذي يسمح بالوصول إلى استهداف الجينات من خلال التوتر انخفض لفائف الدنا هيستون. مثبطات HDAC هي عبارة عن جزيئات صغيرة التي ثبت لتعزيز IPSC إعادة برمجة وHESC التجديد الذاتي 9،10، من المحتمل بسبب دعم الدولة الأسيتيل 11. البروتوكول هو موضح أدناه، مقتبسة من منشور مسبق باستخدام lentiviruses دمج 12، يوفر طريقة خطوة بخطوة لتحسين الجيل IPSC من الدم المحيطي باستخدام episomes ومثبطات HDAC. تركيزات مثبط HDAC المستخدمة هنا هي نصف تلك التي وصفها وير، وآخرون. 9، وأدت بشكل روتيني لزيادة بنسبة 2 أضعاف في المستعمرات IPSC إعادة برمجة بالكامل خلال معيارepisomal البروتوكولات دون إعادة برمجة مثبطات HDAC. هذا المستوى من إعادة البرمجة على قدم المساواة مع كفاءة نلاحظ مع أساليب lentiviral. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قد ولدت بكفاءة IPSC من الأفراد قديم 87 سنة من العمر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مكتوبة المستنيرة، كما وافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية لمركز أبحاث السرطان فريد هاتشينسون والأطفال "في مستشفى فيلادلفيا، تم الحصول عليها من المرضى قبل جمع عينات الدم الطرفية. وحظت جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية. جميع التجارب على الحيوانات بما في ذلك توليد MEF و وتمت الموافقة على تشكيل مسخي من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. Ficoll فصل PBMCS وتوسيع الأرومة الحمراء - اليوم 0

  1. تمييع الدم المحيطي 1: 1 مع Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS). في 15 مل جولة القاع أنبوب البوليسترين، طبقة بعناية 7 مل من الدم المخفف على 3 مل من درجة حرارة الغرفة Ficoll-Hypaque.
  2. الطرد المركزي العينة في 400 x ج لمدة 30 دقيقة.
  3. وPBMCs سيكون قد استقر على واجهة بين البلازما وFicoll-Hypaque، ينظر إليها على أنها طبقة بيضاء غائم. باستخدام ماصة نقل معقمة، وجمع PBالمعلقون في واحدة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تبرزي حجم 10 مل باستخدام DPBS.
  4. باستخدام عدادة الكريات، عد PBMCs.
  5. ماصة 2 × 10 6 PBMCs إلى 15 مل أنبوب مخروطي منفصل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تدور أسفل الخلايا المتبقية وتجميد بتركيز 2 × 10 6 PBMCs / مل في 90٪ مصل بقري جنيني (FBS) سلفوكسيد / 10٪ ميثيل (DMSO).
  6. يعد التوسع المتوسطة: QBSF-60 مصل المتوسطة مجانا (حماية من الضوء) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪) + حمض الاسكوربيك (50 نانوغرام / مل) + خلية الجذعية عامل (SCF، 50 نانوغرام / مل) + 3 انترلوكين (ايل 3، 10 نانوغرام / مل) + الإريثروبويتين (EPO، 2 U / مل) + الأنسولين مثل عامل النمو 1 (IGF-1، 40 نانوغرام / مل) + ديكساميثازون (1 ميكرومتر، وحماية من الضوء، ذوبان الجليد قسامة جديدة كل وسائل الاعلام تغيير).
  7. في resuspend 2 × 10 6 PBMCs في 2 مل من تقدم طازجة متوسطة التوسع ومكان في بئر واحدة من 12 لوحة الثقافة الأنسجة جيد واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع جو من 5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2.
  8. في يوم 3 ويوم 6، يحل محل وسائل الإعلام.
    1. جمع الخلايا ويغسل جيدا مع 2 مل من QBSF-60 لجمع أي الخلايا المتبقية.
    2. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف.
    3. resuspend الخلايا في 2 مل من جديد التوسع المتوسطة وإعادتها إلى نفس 12 لوحة جيدا.

2. إعادة برمجة الخلايا من خلال Nucleofection - اليوم 9

  1. ماصة البلازميدات إلى إعادة برمجة العقيمة 1.5 مل أنبوب إيبندورف (الجدول 1).
  2. مزيج الحل nucleofection مع الملحق (المزودة من قبل الشركة المصنعة) وماصة في معقم 1.5 مل إيبندورف أنبوب.
  3. ماصة 2 مل من متوسطة التوسع في بئر واحدة من 12 لوحة جيدا ومكان في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2) للموازنة قبل إضافة الخلايا.
  4. جمعالخلايا المستزرعة ويغسل جيدا مع 2 مل من QBSF-60 لجمع الخلايا المتبقية.
  5. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف.
  6. غسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 5 مل من DPBS والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. نضح طاف.
  8. resuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر من حل nucleofection + الملحق، مع الحرص على تجنب الفقاعات تولد.
  9. ماصة تعليق الخلية في أنبوب يحتوي على البلازميدات إعادة برمجة، ماصة صعودا وهبوطا مرة واحدة، وماصة العينة إلى أسفل كفيت nucleofection.
  10. وضع كفيت في الجهاز nucleofection وتشغيل برنامج T-019.
  11. نقل 100 ميكرولتر من التوسع prewarmed المتوسطة (من لوحة تحقيق التوازن في الخطوة 2.3) في كفيت nucleofection.
  12. على الفور جمع العينة كلها وديعة في البئر من قبل تحسنت التوسع المتوسطة. تجنب جمع البيض، وتطفو حطام الخلايا الميتة.
  13. وضع لوحة في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2) للنمو.

3. طلاء الخلايا المغذية - يوم 10 أو 11

  1. في يوم 10، وخلايا لوحة المغذية.
    1. طبقة واحدة 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة مع الجيلاتين.
      1. ماصة 1 م من 0.1٪ الجيلاتين في مخزنة المالحة الحل هانك (HBSS) في كل بئر من لوحة.
      2. وضع لوحة في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
      3. مباشرة قبل الاستخدام، نضح الحل الجيلاتين من لوحة.
    2. ذوبان الجليد قارورة واحدة من 2 × 10 6 الخلايا الليفية الماوس الجنينية المشع في 3000 CGY إلى 10 مل من prewarmed MEF الإعلام (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) + FBS (10٪) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪)).
    3. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. resuspend الخلايا في 12 مل من MEF الإعلام وماصة 2 مل طn لكل بئر من الجيلاتين المغلفة 6 لوحة جيدا. وضع لوحة في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2) حتى يوم 12.

4. طلاء الخلايا في الخلايا المغذية وتغيير المتوسطة - اليوم 12

  1. جمع الخلايا nucleofected في واحدة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وجمع أي الخلايا المتبقية قبل غسل جيدا مع 2 مل من QBSF-60. الطرد المركزي العينة في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  2. إعداد إعادة برمجة المتوسطة: Iscove في التعديل متوسطة Dulbecco و(IMDM) + FBS (10٪) + غير الحيوانية L-الجلوتامين (1 ملم) + غير الاساسيين من الأحماض الأمينية (NEAA، 1٪) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪) + β -mercaptoethanol (0.1 مم) + عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF وأضاف العذبة في التغذية، و 10 نانوغرام / مل) + حمض الأسكوربيك (أضاف طازجة في التغذية، 50 ميكروغرام / مل).
  3. نضح وطاف resuspend الخلايا في 12 مل من إعادة برمجة متوسطة. ماصة 2 مل لكل بئر من تعليق خلية فيلوحة 6 جيدا من الخلايا المغذية (كما أعدت في القسم 3). أجهزة الطرد المركزي لوحة في 50 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. وضع لوحة في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2) للنمو. تغيير متوسطة إعادة برمجة كل يوم حتى تبدأ المستعمرات IPSC الظهور (1-2 أسابيع).
  5. إعداد HESC المتوسطة: DMEM / F12 1: 1 + خروج المغلوب استبدال المصل (20٪) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪) + NEAA (1٪) + غير الحيوانية L-الجلوتامين (1 ملم) + البيروفات الصوديوم (1٪) + بيكربونات الصوديوم (0.12٪) + β المركابتويثانول (0.1 مم) + bFGF (أضيف جديدا في التغذية، و 10 نانوغرام / مل)
  6. تعد مثبطات HDAC: الزبدات الصوديوم (مضافة جديدة في التغذية، و 100 ميكرومتر)، حمض suberanilohydroxamic (SAHA وأضاف العذبة في تغذية، و 200 نيوتن متر). مرة تظهر المستعمرات IPSC، تبدأ تغذية الخلايا مع مثبطات HESC المتوسطة + HDAC، وتغيير المتوسطة كل يوم.
    ملاحظة: الزبدات الصوديوم هو جزيء صغير يتم كثف لأنابيب بلاستيكية، رherefore تخزينه في أنبوب زجاجي البورسليكات في 4 درجات مئوية.

5. النسخ عزل IPSC

  1. مرة واحدة المستعمرات IPSC هي كبيرة بما يكفي لتكون معزولة (20-25 الخلايا)، اعتقالهما مع ماصة P20.
  2. تعد مثبطات HDAC: الزبدات الصوديوم (مضافة جديدة في التغذية، و 100 ميكرومتر)، SAHA (مضافة جديدة في التغذية، و 200 نانومتر)
  3. وضع المستعمرات المعزولة على iMEFs الفردية في 35 ملم الأطباق التي تحتوي على مثبطات HESC المتوسطة + + HDAC الاستنساخ والانتعاش الملحق.
  4. اليوم بعد حصوله على المستعمرات، وتغيير وسيلة لمثبطات HESC المتوسطة + HDAC.
  5. تغيير متوسطة كل يوم حتى المستعمرات IPSC جاهزة للالركض.
  6. إزالة مثبطات HDAC من المتوسط ​​مرة واحدة تستقر في المستعمرات مرور 2-3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد ثلاثة أيام nucleofection وقبل طلاء الخلايا nucleofected على iMEFs، ينبغي تقدير كفاءة nucleofection ناجحة بواسطة المجهر مضان لEGFP الشكل 1 يبين تجربة نموذجية nucleofection مع ما يقرب من 5-10٪ من مجموع السكان خلية معربا عن EGFP.

وسوف تبدأ المستعمرات IPSC برمجتها لتظهر بعد أسبوعين تقريبا nucleofection. مستعمرات دائرية بشكل عام مع حدود محددة جيدا ويمكن تحديدها من قبل مميز مورفولوجيا HESC بما في ذ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوليد IPSC الناجح عند استخدام هذا البروتوكول، وهناك العديد من المحاذير المهمة التي ينبغي النظر فيها. خلال مرحلة التوسع أرومة الحمراء، ينبغي اتباع الجدول الزمني للتغيير وسائل الإعلام بدقة، والانحرافات قد يؤدي إلى تحفيز فعال من السكان خلية سلفية الهدف وكفاءة أقل من جيل IPSC. من المهم أن تجعل المتوسطة التوسعة الجديدة مع ديكساميثازون جديدة مع كل تغيير وسائل الاعلام. وقاعدة المتوسطة وديكساميثازون QBSF-60 يجب حماية من الضوء أثناء التخزين. خلال nucleofection، غسل DPBS أمر بالغ الأهمية ل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب نود أن نعترف المنح التالية من المعاهد الوطنية للصحة لدعم هذا البحث: K08DK082783 (AR)، P30DK56465 (BTS)، U01HL099993 (BTS)، T32HL00715036 (SKS)، وK12HL0806406 (SKS)؛ ومؤسسة JP مكارثي (AR).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PLUSFisher Scientific45-001-750يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية دافئ إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
متجر DPBSLife Technologies14190-250عند 4 درجات مئوية.
RPMI 1640Life Technologies11875-093يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
مصل الأبقار الجنينية (FBS)متجر LifeTechnologies 10437028عند -20 درجة ؛ ج لحين الحاجة. ذوبان الجليد ، aliquot ، تخزين في 4 درجات مئوية.
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)154938سيجما ألدريتشيحفظ في درجة حرارة الغرفة.
QBSF-60 متوسط خال من المصلفيشر Scientific50-983-234مخزن عند 4 درجات مئوية.
بنسلين / ستربتومايسينلايف تكنولوجيز15140122مخزن في 4 درجات مئوية.
مجموعة نواة خط الخلية VLonzaVCA-1003تخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
محلول جيلاتين 2٪Sigma-AldrichG1393يخزن في 4 درجات ؛ C ، تسييل في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)Life Technologies14175-103Store at 4 درجات مئوية.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies11965-092Store at 4 درجات مئوية.
الحياة المتوسطة (IMDM) من Iscove المعدلة12440-061عند 4 درجات مئوية.
L-glutamine ، 200 mMLife Technologies25030-081Aliquot ، يتجمد عند -20 درجة مئوية.
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 100XLife Technologies11140-050يخزن في 4 درجات ؛ C ، بعيدا عن الضوء.
DMEM / Ham's F12 ، 1: 1فيشر ساينتفيكSH30023.02مخزن عند 4 درجات مئوية.
KnockOut مصل استبدالتقنيات الحياة10828-028Aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية.
بيروفات الصوديوم ، 100 ملي مولارLife Technologies11360-070يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
بيكربونات الصوديوم ، 7.5٪Life Technologies25080094يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF)PHG0263 Life Technologiesاصنع مخزونا 10 مجم / مل في DPBS ، aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
زبدات الصوديوم Sigma-AldrichB5887-1Gاصنع مخزونا 2000x (400 ملم) في DPBS ، aliquot ، جمد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
استنساخ الخلايا hES & مكمل الاستردادStemgent01-0014-500يخزن في -20 درجة ؛ ج لحين الحاجة. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
matrigelBiosciences35-4277ESC ذوبان الجليد بين عشية وضحاها على الجليد عند 4 درجات ؛ C ، في أنابيب مبردة مسبقا باستخدام أطراف ماصة مبردة مسبقا. يخزن في -20 درجة ؛ ج لحين الحاجة. ذوبان الجليد عند 4 درجات ؛ ج ، استخدمه على الفور.
StemSpan SFEM STEMCELL Technologies9650Aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية.
حمض الأسكوربيك ، مسحوقSigma-AldrichA4403-100MGاصنع مخزون 5 مجم / مل في DPBS ، مرشح معقم ، يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
عامل الخلايا الجذعية البشرية المؤتلف (SCF)R & D Systems255-SC-010Make 100 & mu ؛ جم / م المخزون في SFEM ، aliquot ، يتجمد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
إنترلوكين بشري مؤتلف 3 (IL-3)R & D Systems203-IL-010Make 100 & mu ؛ جم / مل من المخزون في SFEM ، aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
الإريثروبويتين (EPO)R & D Systems287-TC-500اصنع مخزون 1000 وحدة / مل في SFEM ، حسب الطلب ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
عامل النمو البشري المؤتلف الشبيه بالأنسولين 1 (منتدى إدارة الإنترنت-1)R & D Systems291-G1-200Make 100 & mu ؛ جم / مل من المخزون في SFEM ، aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM7522اصنع مخزون 1000x (100 مل) في DPBS.
ديكساميثازونسيجما ألدريتشD4902-25MGاصنع مخزون 50x (50 & mu; M) في DPBS ، مرشح معقم ، يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
SAHA (vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9اصنع مخزون 2,000 x (400 مل) في DPBS ، aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
12 لوحة زراعة أنسجة البئرفيشر ساينتفيك08-772-29
15 مل أنبوب مخروطيSarstedt62553002
1.5 مل أنبوب Eppendorfفيشر Scientific05-408-129
6 لوحة زراعة أنسجة الآبارفيشر Scientific08-772-1B
35 مم لوحات ثقافة tisue BDBiosciences353001
10 مل ماصات مصلية يمكن التخلص منهافيشر ساينتفيك13-675-20
5 مل ماصات مصلية يمكن التخلص منهافيشر ساينتفيك13-675-22
2 مل ماصات مصلية يمكن التخلص منهافيشر ساينتفيك13-675-17
20 & ل أطراف الماصة ، نصائح الحاجزGenessee24-404
ماصات باستور زجاجيةفيشر ساينتفيك13-678-20D
ماصة مساعدةفيشر Scientific13-681-15
pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-FAddgene27077
pCXLE-hSKAddgene27078
pCXLE-hULAddgene27080
pCXLE-EGFPAddgene27082
pCXWB-EBNA1Addgene37624
تخزين تقنيات BD BD المؤهل من

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).
  3. Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).
  4. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  5. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  6. Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).
  7. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  8. Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).
  9. Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).
  10. Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).
  11. Azuara, V., et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).
  12. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).
  13. Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
  14. Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
  15. Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

iPS Cell GenerationEpisomal PlasmidsHDAC InhibitorsPeripheral Blood Mononuclear CellsErythrocyte Progenitor CellsNucleofectionMouse Embryonic FibroblastsIntegration Free iPSCsReprogramming MediumFluorescence Microscopy

Related Articles