نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان من الدم المحيطي باستخدام استراتيجية إعادة برمجة يصبوغ مقرها ومثبطات deacetylase هيستون.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتوضح هذه المخطوطة بروتوكول لخلق بكفاءة من صنع الإنسان خلايا خالية من التكامل الجذعية المحفزة (iPSCs) من الدم المحيطي باستخدام البلازميدات episomal وdeacetylase هيستون (HDAC) مثبطات. مزايا هذا النهج ما يلي: (1) استخدام كمية ضئيلة من الدم المحيطي كمادة المصدر؛ (2) nonintegrating ناقلات إعادة برمجة. (3) وسيلة فعالة من حيث التكلفة لتوليد iPSCs خالية النواقل؛ (4) وترنسفكأيشن واحد؛ و (5) استخدام جزيئات صغيرة لتسهيل إعادة برمجة جينية. باختصار، يتم عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من عينات الفصد الروتينية ومن ثم تربيتها في عوامل نمو محددة لانتاج الكريات الحمر السكان الخلية السلف التكاثري للغاية وقابلة للبرمجة بشكل ملحوظ. Nonintegrating، البلازميدات episomal nontransmissible معربا عن OCT4، SOX2، KLF4، MYCL، LIN28A، والبروتين p53 دبوس الشعر القصير (SH) RNA هي introduدائرة الهندسة المدنية في الأرومة الحمراء المستمدة عبر nucleofection واحد. Cotransfection من يصبوغ التي تعبر عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) يسمح لسهولة تحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. يضاف البلازميد-تكرار نقص منفصل معربا عن ابشتاين بار مستضد النووي (1 EBNA1) أيضا إلى خليط التفاعل لزيادة التعبير عن البروتينات episomal. ثم يتم مطلي الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على طبقة من الخلايا الليفية الفأر الجنينية المشع (iMEFs) لاستمرار إعادة برمجة. حالما تظهر المستعمرات IPSC تشبه في حوالي اثني عشر يوما بعد nucleofection، يتم إضافة مثبطات HDAC إلى المتوسطة لتسهيل إعادة جينية. وقد وجدنا أن إدراج مثبطات HDAC يزيد بشكل روتيني الجيل المستعمرات IPSC برمجتها بالكامل بنسبة 2 أضعاف. مرة واحدة المستعمرات IPSC المعرض نموذجي الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) التشكل، يتم نقلها برفق لiMEF الفردية المغلفة لوحات زراعة الأنسجة لاستمرار النمو والتوسع.
المقدمة
وتستمد iPSCs من الأنسجة الجسمية عن طريق التعبير خارج الرحم من مجموعة صغيرة من جينات تعدد القدرات. وقد تجلى هذا الأسلوب في البداية من قبل تنبيغ فيروسات من الخلايا الليفية الإنسان مع OCT4، SOX2، KLF4، وcMYC، التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في الدولة المحفزة 1. أعرب عابر هذه "عوامل إعادة برمجة" يغير المشهد جينية والجينات الشخصية التعبير الخلية المستهدفة مماثلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية 2. مرة واحدة تم إنشاؤها، iPSCs يحتمل أن تكون متباينة في أي نوع الأنسجة لمزيد من التحقيق. وبالتالي، فإنها تبشر لاستخدامها في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، وتطبيقات العلاج الجيني. ومع ذلك، وتعطيل الجينات مع فيروس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
مكتوبة المستنيرة، كما وافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية لمركز أبحاث السرطان فريد هاتشينسون والأطفال "في مستشفى فيلادلفيا، تم الحصول عليها من المرضى قبل جمع عينات الدم الطرفية. وحظت جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية. جميع التجارب على الحيوانات بما في ذلك توليد MEF و وتمت الموافقة على تشكيل مسخي من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.
1. Ficoll فصل PBMCS وتوسيع الأرومة الحمراء - اليوم 0
- تمييع الدم المحيطي 1: 1 مع Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS). في 15 مل جولة ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد ثلاثة أيام nucleofection وقبل طلاء الخلايا nucleofected على iMEFs، ينبغي تقدير كفاءة nucleofection ناجحة بواسطة المجهر مضان لEGFP الشكل 1 يبين تجربة نموذجية nucleofection مع ما يقرب من 5-10٪ من مجموع السكان خلية معربا عن EGFP.
وسوف تبدأ المستعمرات IPSC برمجتها لتظهر بعد أسبوعين تقريبا nucleofection. مستعمرات دائرية بشكل عام مع حدود محددة جيدا ويمكن تحديدها من قبل مميز مورفولوجيا HESC بما في ذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لتوليد IPSC الناجح عند استخدام هذا البروتوكول، وهناك العديد من المحاذير المهمة التي ينبغي النظر فيها. خلال مرحلة التوسع أرومة الحمراء، ينبغي اتباع الجدول الزمني للتغيير وسائل الإعلام بدقة، والانحرافات قد يؤدي إلى تحفيز فعال من السكان خلية سلفية الهدف وكفاءة أقل من جيل IPSC. من المهم أن تجعل المتوسطة التوسعة الجديدة مع ديكساميثازون جديدة مع كل تغيير وسائل الاعلام. وقاعدة المتوسطة وديكساميثازون QBSF-60 يجب حماية من الضوء أثناء التخزين. خلال nucleofection، غسل DPBS أمر بالغ الأهمية ل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
الكتاب نود أن نعترف المنح التالية من المعاهد الوطنية للصحة لدعم هذا البحث: K08DK082783 (AR)، P30DK56465 (BTS)، U01HL099993 (BTS)، T32HL00715036 (SKS)، وK12HL0806406 (SKS)؛ ومؤسسة JP مكارثي (AR).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية دافئ إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. |
| متجر DPBS | Life Technologies | 14190-250 | عند 4 درجات مئوية. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | متجر Life | Technologies 10437028 | عند -20 درجة ؛ ج لحين الحاجة. ذوبان الجليد ، aliquot ، تخزين في 4 درجات مئوية. |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | 154938 | سيجما ألدريتش | يحفظ في درجة حرارة الغرفة. |
| QBSF-60 متوسط خال من المصل | فيشر Scientific | 50-983-234 | مخزن عند 4 درجات مئوية. |
| بنسلين / ستربتومايسين | لايف تكنولوجيز | 15140122 | مخزن في 4 درجات مئوية. |
| مجموعة نواة خط الخلية V | Lonza | VCA-1003 | تخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| محلول جيلاتين 2٪ | Sigma-Aldrich | G1393 | يخزن في 4 درجات ؛ C ، تسييل في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4 درجات مئوية. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 درجات مئوية. |
| الحياة المتوسطة (IMDM) من Iscove المعدلة | 12440-061 | عند 4 درجات مئوية. | |
| L-glutamine ، 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot ، يتجمد عند -20 درجة مئوية. |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 100X | Life Technologies | 11140-050 | يخزن في 4 درجات ؛ C ، بعيدا عن الضوء. |
| DMEM / Ham's F12 ، 1: 1 | فيشر ساينتفيك | SH30023.02 | مخزن عند 4 درجات مئوية. |
| KnockOut مصل استبدال | تقنيات الحياة | 10828-028 | Aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. |
| بيروفات الصوديوم ، 100 ملي مولار | Life Technologies | 11360-070 | يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| بيكربونات الصوديوم ، 7.5٪ | Life Technologies | 25080094 | يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) | PHG0263 Life Technologies | اصنع مخزونا 10 مجم / مل في DPBS ، aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. | |
| زبدات الصوديوم | Sigma-Aldrich | B5887-1G | اصنع مخزونا 2000x (400 ملم) في DPBS ، aliquot ، جمد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| استنساخ الخلايا hES & مكمل الاسترداد | Stemgent | 01-0014-500 | يخزن في -20 درجة ؛ ج لحين الحاجة. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| matrigel | Biosciences | 35-4277 | ESC ذوبان الجليد بين عشية وضحاها على الجليد عند 4 درجات ؛ C ، في أنابيب مبردة مسبقا باستخدام أطراف ماصة مبردة مسبقا. يخزن في -20 درجة ؛ ج لحين الحاجة. ذوبان الجليد عند 4 درجات ؛ ج ، استخدمه على الفور. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. |
| حمض الأسكوربيك ، مسحوق | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | اصنع مخزون 5 مجم / مل في DPBS ، مرشح معقم ، يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| عامل الخلايا الجذعية البشرية المؤتلف (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 & mu ؛ جم / م المخزون في SFEM ، aliquot ، يتجمد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| إنترلوكين بشري مؤتلف 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 & mu ؛ جم / مل من المخزون في SFEM ، aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| الإريثروبويتين (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | اصنع مخزون 1000 وحدة / مل في SFEM ، حسب الطلب ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| عامل النمو البشري المؤتلف الشبيه بالأنسولين 1 (منتدى إدارة الإنترنت-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 & mu ؛ جم / مل من المخزون في SFEM ، aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | اصنع مخزون 1000x (100 مل) في DPBS. |
| ديكساميثازون | سيجما ألدريتش | D4902-25MG | اصنع مخزون 50x (50 & mu; M) في DPBS ، مرشح معقم ، يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | اصنع مخزون 2,000 x (400 مل) في DPBS ، aliquot ، تجميد عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| 12 لوحة زراعة أنسجة البئر | فيشر ساينتفيك | 08-772-29 | |
| 15 مل أنبوب مخروطي | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 مل أنبوب Eppendorf | فيشر Scientific | 05-408-129 | |
| 6 لوحة زراعة أنسجة الآبار | فيشر Scientific | 08-772-1B | |
| 35 مم لوحات ثقافة tisue BD | Biosciences | 353001 | |
| 10 مل ماصات مصلية يمكن التخلص منها | فيشر ساينتفيك | 13-675-20 | |
| 5 مل ماصات مصلية يمكن التخلص منها | فيشر ساينتفيك | 13-675-22 | |
| 2 مل ماصات مصلية يمكن التخلص منها | فيشر ساينتفيك | 13-675-17 | |
| 20 & ل أطراف الماصة ، نصائح الحاجز | Genessee | 24-404 | |
| ماصات باستور زجاجية | فيشر ساينتفيك | 13-678-20D | |
| ماصة مساعدة | فيشر Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
المراجع
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodelin....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
