مقالة منهجية

الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

DOI:

10.3791/52021

⸱

نوفمبر 6, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نصف مقايسة بيولوجية قوية لتحديد المعدل النسبي لانحلال البروتين بواسطة نظام ubiquitin-proteasome. قراءة الفحص هي معدل نمو الخميرة في الثقافة السائلة ، والذي يعتمد على المستويات الخلوية لبروتين المراسل الذي يشتمل على إشارة تحلل مدمجة في علامة التمثيل الغذائي الأساسية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تدهور البروتين من قبل النظام اليوبيكويتين-بروتوزوم (UPS) هو آلية تنظيمية رئيسية لتوازن بروتين في جميع حقيقيات النوى. المنهج المعياري لتحديد تدهور البروتين داخل الخلايا يعتمد على فحوصات البيوكيميائية لمتابعة حركية انخفاض البروتين. مثل هذه الأساليب غالبا ما تكون شاقة وتستغرق وقتا طويلا وبالتالي غير قابلة للتجارب تهدف إلى تقييم ركائز متعددة، وتدهور الأوضاع. كبديل، تم إعداد المقايسات المعتمدة على نمو الخلايا، التي هي، في الشكل التقليدي، المقايسات نقطة النهاية التي لا يمكن تحديد كميا التغيرات النسبية في مستويات البروتين.

نحن هنا تصف طريقة التي يحدد بأمانة التغيرات في معدلات تدهور البروتين اقتران لهم الخميرة خلية حركية النمو. وتستند هذه الطريقة على نظام اختيار أنشئت حيث -deleted اليوراسيل auxotrophy من URA3 هو انقاذ خلايا الخميرة عن طريق البروتين مراسل أعرب خارجيا، تتألف من مزيج بين الجينات URA3 أساسيا ومحددا تدهور (degron). تم تصميم هذا البروتين مراسل بحيث معدل تخليق لها هو ثابت في حين يتم تحديد معدل التدهور من قبل degron. كما نمو الخلايا في واليوراسيل نقص المتوسطة يتناسب مع المستويات النسبية للUra3، حركية النمو تعتمد كليا على تدهور البروتين المراسل.

هذه الطريقة يقيس بدقة التغيرات في الخلايا الحركية تدهور البروتين. تم تطبيقه على: (أ) تقييم المساهمة النسبية للعوامل التصريف اليوبيكويتين المعروف أن التحلل البروتيني (ب) E2 انزيم التصريف هيكل وظيفة تحليلات (ج) تحديد وتوصيف degrons الرواية. تطبيق نظام URA3 المستندة degron- يتجاوز مجال تدهور البروتين، كما يمكن أيضا أن تتكيف مع التغييرات رصد مستويات البروتين المرتبط ظائف مسارات الخلوية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام تدهور اليوبيكويتين-بروتوزوم هو آلة التنظيمية الرئيسية، والتي تورطت في الحفاظ على توازن بروتين في جميع حقيقيات النوى. يو بي إس تقارن البداية جزيئات اليوبيكويتين متعددة لبروتين بعد الهدف الذي تتدهور البروتين بولي اليوبيكويتين الموسومة من قبل بروتوزوم 26S. في معظم الحالات، فإن معدل الحد خطوة لاليوبيكويتين بوساطة التحلل هو الركيزة ubiquitylation بوساطة E2 التصريف الإنزيمات والإنزيمات E3 ligating (E3 Ligases) 1. بالتالي، الاستقرار داخل الخلايا بروتينات معينة تعكس قابليتها للاليوبيكويتين-الاقتران ونشاط الانزيمات وما شابه ذلك ubiquitylation بهم.

ligases E3 هي مكونات التعرف على الركيزة الرئيسية لشركة يو بي إس. على هذا النحو، وهذه الانزيمات تعترف degrons ضمن الركائز التي هي إما غائبة أو لم تتعرض في نظرائهم مستقرة 2. على سبيل المثال، العديد من المنظمين دورة الخلية مأوست يتم توليفها وتدهورت بطريقة محددة زمنيا من أجل الحفاظ على تقدم دورة الخلية في النظام. وغالبا ما تسيطر على تدهور هذه البروتينات من خلال الفسفرة، بوساطة الخلايا، مما يشير إلى تحركات التنظيم 3،4. من ناحية أخرى، يتم التعرف على البروتينات مطوية aberrantly من خلال degrons خفي. وهذه هي المناطق التي تكون مخفية عادة في البنية الأصلية ويتعرضون على هيكل الاضطراب. وتشمل مجالات مثل degrons مسعور 5-7 وشرائح المختلين جوهريا 8.

منذ اكتشاف المنوي للنظام اليوبيكويتين لتدهور البروتين وتوصيف العوامل الأساسية في الخلايا الشبكية 9 لست]، وكانت الوراثة الخميرة مفيدة في اكتشاف العديد من مكونات النظام اليوبيكويتين 10. هو نجاح الخميرة كما كائن نموذج لتحليل منهجي من تدهور البروتين من قبل شركة يو بي إس يرجع ذلك أساسا إلى كون يو بي إس هي عاليةلاي المحفوظة في جميع حقيقيات النوى 4، إلى جانب قابليته على كنظام تجريبي. في الواقع، وتستخدم النظم القائمة على الخميرة عادة إلى فك آليات عمل آلية ubiquitylation.

دراسة تحلل البروتين عن طريق البيوكيميائية وعادة ما يتطلب إعداد مقتطفات الخلية. بينما بروتينات الخلية الحيوانية يمكن استخراجه تحت ظروف معتدلة نسبيا التي تحافظ على تفاعلات البروتين وظيفة، وجود جدار الخلية قوية في الخميرة 11 يتطلب أقسى بكثير الظروف التي قد تؤثر على تعطيل الانتعاش البروتين. في الواقع، وإجراءات مختلفة لتعطيل خلية الخميرة تختلف اختلافا كبيرا في قدرتها على استعادة بروتينات سليمة في المبالغ التي تمثل الوفرة النسبية الخلوية الخاصة بهم بشكل صحيح. مزيد من الدقة متأصلة في الطرق المختلفة المستخدمة لتحديد معدلات تدهور للبروتينات محددة: تجارب "نبض مطاردة" الاستقلابية القائم على العلامات تليها ايمmunoprecipitation، لعزل بروتينات معينة 12، في كثير من الأحيان لا الكمية بدقة. وبالتالي، عندما تتم مقارنة تدهور البروتين بواسطة هذه الطريقة، ينبغي توخي الحذر في تفسير النتائج. للتحايل على هذا العيب، وهو سيكلوهيكسيميد البديل (فروج) مطاردة الفحص ويمكن استخدام 12. في هذا الاختبار، يتم إضافة مثبط الترجمة إلى مزارع الخلايا والتغيرات الزمانية في مستويات بروتين ثابت للدولة يتم رصدها في وقت لاحق. ومع ذلك، فإن استخدام فروج يقتصر على البروتينات مع عمر نصف قصيرة نسبيا (<90 دقيقة)، وكبت طويل الأجل لتخليق البروتين السامة للخلايا. والجدير بالذكر أن كلا من المقايسات المذكورة أعلاه تتطلب استخدام الأجسام المضادة بروتين معين، والتي ليست متاحة دائما.

للتغلب على هذه القيود التقنية، فقد طور الباحثون العديد من الأساليب التي لا تتطلب استخراج الخلايا والبروتين التعامل المباشر. ويستند نهج واحد بشأن إنشاء نعم العوز الغذائيسلالات الواحد، التي حصلت عليها حذف الجينات التي تكود الإنزيمات الأيضية الأساسية. وتشمل هذه الجينات HIS3، LEU2، LYS2 وTRP1، ترميز الإنزيمات اللازمة لالحيوي من الأحماض الأمينية، فضلا عن URA3 أن يشفر المرصد المغربي للسجون كربوكسيل (Ura3)، وهو إنزيم أساسي من البيريميدين ريبونوكليوتيد الحيوي. وقد Ura3 تستخدم على نطاق واسع في الدراسات تدهور البروتين. في هذه المقايسات والتعبير التأسيسية للUra3 ينقذ نمو الخلايا ura3 في واليوراسيل نقص المتوسطة 13. بالتالي زعزعة استقرار Ura3 من خلال الانصهار من degron يمكن أن يقلل من نمو الخلايا في الحد الأدنى من المتوسط ​​تفتقر اليوراسيل. وقد استخدم هذا الأسلوب في مختلف الدراسات تدهور البروتين، بما في ذلك تحديد تدهور محددات 5، E3 ligases 14 و 15 مساعد عوامل ubiquitylation واكتشاف UPS رواية degrons 16. كل من هذه الأساليب المستخدمة نمو الخلايا على لوحات أجار كما فحص قراءات. ومع ذلك، رانه معيار النمو (الإيجابي / النمو السلبي)، في حين قوية وفعالة، هي في معظمها النوعية وليس الكمية توفير المعلومات التي من المهم لتقييم فعالية وdegron أو المساهمة النسبية لمختلف العوامل تدهور المساعدة.

لذا قمنا بتطوير وتستخدم ناقلات الخميرة وطرق الفحص تمكين التحليل المنهجي والكمي للتدهور البروتين بواسطة URA3 -degron نظام الانصهار. ويستند البروتوكول على الفحص سهلة لمقبض الذي يقيس حركية النمو في الثقافة السائلة في ظل ظروف الانتقائية (GiLS) وعلى الجيل من منحنيات النمو القياسية. وتتميز حركية نمو الخميرة قبل ثلاث مراحل رئيسية - تأخر والأسي (سجل) ومرحلة ثابتة. حساب حركية تكرار الخميرة خلال مرحلة السجل ظل ظروف انتقائية، والتي يتم تحديدها من خلال مستويات التعبير عن Ura3-degron، يوفر متحيز قياس الكمي سو تدهور البروتين. هذه الطريقة يمكن تطبيقها على قياس ومقارنة معدلات تدهور ركائز UPS متعددة في وقت واحد في سلالات متعددة وتحت ظروف مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية ثقافة

  1. تحويل خلايا الخميرة بعامل نمائي المناسبة، مثل Try467 (الجدول 2)، مع البلازميد التي تحتوي على (أ) URA3 -degron الانصهار و (ب) علامة الأيض إضافية لاختيار البلازميد والصيانة.
    ملاحظة: مثال على البلازميد هو مناسبة YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) وهذا هو الخميرة بلازميد التكاملي تحتوي على البروتين الانصهار تتألف من Deg1 - وهو degron المستمدة من النسخ الخميرة. عامل Mat2 17، حاتمة FLAG - للكشف من قبل immunoblotting، Vma12 - بروتين ER مستقر، وUra3 15،18 (الشكل 3A). (انظر الجدول 3 لالبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة وللحصول على أمثلة إضافية من البلازميدات مناسبة).
  2. لاختيار البلازميد والصيانة، والحفاظ على الخلايا في لوحات أجار تحت الاصطناعية مناسبة معينة (SD) المتوسطة تفتقر علامات اختيار الأحماض الأمينية 19 (على سبيل المثال، يتم تحديد Deg1 -UV وحافظت تحت SD-LYS سائل الإعلام الانتقائي).
  3. زراعة خلايا O / N عند 30 درجة مئوية في المتوسط ​​SD انتقائية مناسبة لصيانة بلازميد حتى يتم التوصل إلى مرحلة ثابتة. تنمو الخلايا في أنابيب اختبار أو في لوحة 96-جيدا، اعتمادا على عدد من العينات المراد فحصها (القسم 2).

2. إعداد الخلايا لتحليل

  1. عندما يتم يعاير عدد قليل من عينات (N≤15)، وتمييع الخلايا واستبدال المتوسطة على النحو التالي:
    1. تمييع 50 ميكرولتر من الخلايا من O / N ثقافة مع 150 ميكرولتر من SD المتوسطة لكل بئر في 96-جيدا لوحة (قاع واضح). ملاحظة، يتم تعيين العينة الأولى كما يحتوي فارغا المتوسطة فقط.
    2. تحديد القيم OD 600 من العينات في 96 لوحة جيدا باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
    3. حساب OD الفعلي 600 في كل بئر بضرب القراءة OD 600 من قبل عامل التخفيف (X4)، من ذوي الخوذات البيضاءICH قيمة القراءة فارغة يتم طرح. تطبيع القيم الناتجة بتقسيم بنسبة 0.55 في الحصول على احتساب مسار بطول 1 سم وفقا للقانون بير لامبرت. ملاحظة هذه القيمة ثابتة عند قياس OD 600 من 200 ميكرولتر من الخلايا في القياسية لوحة 96-جيدا.
    4. حساب حجم الذي تحتاجه للحصول على خلايا الخميرة بمبلغ يعادل 600 OD 0.25 وتحويلها إلى أنبوب إيبندورف.
    5. تدور أسفل الخلايا بسرعة عالية (12،000 x ج) لمدة 1 دقيقة.
    6. إزالة طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من المتوسط ​​انتقائية المناسب (انظر القسم 3.1) للحصول على OD 600 0.25.
    7. نقل 200 ميكرولتر من سلالات المخفف لبئر جديد في لوحة 96-جيدا.
  2. عندما يتم اختبار عدد كبير من العينات (ن> 15)، وتمييع الخلايا واستبدال وسيط وبدون سابق قياس OD 600، على النحو التالي:
    1. نقل 10 ميكرولتر من خلايا ثابتةنمت O / N في لوحة 96-جيدا في لوحة 96 بئر جديدة تحتوي على 190 ميكرولتر (تخفيف 1:20) من وسائل الإعلام انتقائية مناسبة (انظر القسم 3.1).

3. حركية النمو في الثقافة السائل تحت شروط انتقائية (GiLS)

  1. استخدام وسائل الإعلام التالية لقياس النمو باستخدام مراسل Ura3-degron:
    1. عن الضوابط الإيجابية للنمو الخميرة تحت ظروف غير مقيدة، واستخدام البلازميد وسائل الإعلام الانتقائي SD (انظر القسم 1.2). إذا كان مطلوبا أي اختيار البلازميد، على سبيل المثال، عند استخدام البلازميد التكاملي مثل Deg1 -UV، SD متوسطة تحتوي على جميع الأحماض الأمينية الضرورية (SD الكامل) يمكن استخدامها.
    2. لعينات تجريبية قياس النمو في ظل ظروف مقيدة، استخدم SD-URA المتوسطة.
  2. وضع القارئ المتعدد صفيحة ميكروسكوبية ل: درجة حرارة الحضانة من 30 درجة مئوية، OD 600 فترات قياس 15 دقيقة، ودورات المدارية والخطية تهتز من 1 دقيقة كل سبع دقائق <ر /> ملاحظة: هذا الوضع المزدوج تم تحسين يهز الحصول على توزيع متجانس للخلايا. ومع ذلك، وسائط اهتزاز أخرى أو حتى أي اهتزاز قد تعمل أيضا.
  3. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية في قارئ صفيحة ميكروسكوبية O / N أو حتى وصلت إلى مرحلة خلايا ثابتة (12-24 ساعة).
  4. تصدير البيانات الخام إلى ملف جدول البيانات.
  5. تحديد حركية نمو الخميرة باستخدام MDTcalc، وهو برنامج مخصص تقوم بحساب الوقت الحد الأدنى (في ساعة) للخلايا لمضاعفة حجم سكانها (الحد الأدنى مضاعفة الوقت (MDT)؛ لمزيد من التفاصيل انظر القسم 4).

4. احتساب الحد الأدنى مضاعفة الوقت (MDT): مبادئ MDTcalc خوارزمية

ملاحظة: مبادئ خوارزمية MDTcalc، وذلك باستخدام عينة من خلايا الخميرة Try467 (الجدول 2) نمت في SD وسائل الإعلام كاملة، ويوضح الجدول (1) والشكل (1)، مما يدل على جداول البيانات والنمو المؤامرات، respecنسبيا.

  1. طرح OD 600 القيم الفارغة، التي تم الحصول عليها في البئر المعنية، من كل من القراءات التي تم الحصول عليها في العينة جيدا. تقسيم الفروق الناتجة بنسبة 0.55 (لوحات 96-جيدا) لتصحيح طول مسار الضوء. رسم القيم النهائية (الجدول 1، العابرة.) مع الزمن لإنتاج منحنى نمو الخميرة الفعلي (OD 600 / ساعة) (الشكل 1A).
  2. سجل حساب 2 (OD 600) لكل من القيم تحولت إلى تحويل مرحلة النمو اللوغاريتمي في منحنى خطي (الشكل 1B).
  3. حساب المنحدر من فاصل 10 نقطة زمنية (N = 10) ابتداء من الساعة 0 وتتحرك مرة واحدة نقطة في كل مرة إلى N <10 (الجدول 1، المنحدر، الشكل 1C).
  4. حساب قيمة معكوس كل منحدر من الحصول على الوقت اللازم للسكان الخلية لمضاعفة (الجدول 1، 1 / المنحدر، الشكل 1C). حساب الحد الأدنى1 / القيمة المنحدر لتحديد MDT (الجدول 1، المستطيل الأسود، الشكل 1C). استخراج MDT يحسب للخلايا في العينة (الجدول 1، 1 / المنحدر، مستطيل أسود) من الفاصل الزمني المحدد (الجدول رقم 1، التي حددها مستطيل أحمر، أرقام 1B، 1D).
    ملاحظة: معدل نمو الخلايا في SD-URA المتوسطة يتناسب عكسيا مع هذا الدواء.

5. باستخدام MDTcalc

  1. نسخ ملفات البرنامج تستكمل في مجلد معين في الكمبيوتر.
  2. تأكد من حفظ ملف جدول البيانات التي تحتوي على بيانات النمو ومغلقة. فتح برنامج تطبيق MDTcalc أن نرى بداية ظهور الشاشة.
    1. إدراج المعلومات المطلوبة، كما هو موضح في الشكل رقم 2:
      1. تحت عنوان "مسار الملف"، انقر فوق مستطيل على اليمين لتحديد موقع ملف جدول البيانات.
      2. تحت "اسم ورقة"، وكتابة اسم جدول حيث tانه يقع البيانات الخام.
      3. تحت عنوان "وضع البداية، إدراج جدول تنسيق الوقت 0 من العينة الأولى.
      4. تحت عنوان "عمود الوقت، إدراج الرسالة تحديد موقع العمود نقطة زمنية (ينبغي توفير الوقت بالثواني).
      5. تحت عنوان "عمود فارغ، إدراج الرسالة تحديد موقع العمود فارغة (عادة ولكن ليس بالضرورة في بئر A1 من لوحة 96-جيدا).
      6. تحت عنوان "قيمة OD"، اختر الحد الأدنى تحولت OD 600 القيمة المطلوبة لبدء MDT حساب (عادة 0،15-0،25). تعيين هذه القيمة يمنع حسابات MDT للثقافات في مرحلة متخلفة بسبب التخفيف المفرط بحيث يتم احتساب هذا الدواء فقط للعينات التي تصل إلى 600 OD محددة القيمة أو أعلى.
    2. مرة واحدة تم إدخال القيمة الأخيرة، اضغط على زر "حساب" في الجزء السفلي من الشاشة. تأكد من أن شريط التقدم على اليمين يتغير تدريجيا إلى زreen. لا فتح ملف جدول البيانات أثناء عملية حسابية.
    3. تصدير مجموعتين من البيانات التي تظهر تلقائيا على الشاشة عند الانتهاء من حساب MDT في جدول بيانات. تأكد من أن البيانات تشمل ما يلي: (أ) قيمة MDT لكل بئر يمر اختبار الحد الأدنى من قيمة OD (كما هو مبين في القسم 5.2.1.6) و (ب) نقطة زمنية الأولية للفترة التي تم احتساب مليون دينار تونسي (البداية الوقت).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحقيق في دور الانزيمات من المسار Doa10 في تدهور ركيزة مراسل

لاختبار صحة طريقة GiLS تم مقارنته مقايسة تدهور التقليدي. هذه التجربة تقيم المساهمة النسبية لمكونات غشاء ER محلية Doa10-E3 يغاز مجمع 20،21 إلى تدهور مراقبة الجودة البروتين مراسل الركيزة Deg1- VU (الشكل 3A). تم دمج البلازميد Deg1- VU إلى خلايا نوع البرية أو في الخلايا التي تفتقر إلى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا تصف مقايسة على أساس نمو الخلايا لتحديد النسبية معدلات تدهور البروتين، وتسمى "حركية النمو في الثقافة السائلة في ظل ظروف الانتقائية" (GiLS). الفحص GiLS ديها العديد من المزايا: انها بسيطة لإعداد، والحصول على البيانات وتحليل واضح وصريح وهو نموذجي للغاية. وبالتالي، يمكن تطبيق GiLS في وقت واحد لعينات متعددة في مباراة ودية شكل لوحة متعددة جيدا المستخدم التي يمكن تكييفها مع التشغيل الآلي للتطبيقات إنتاجية عالية. الأهم من ذلك، GiLS توفر بيانات استنساخه للغاية، الكمية وقوي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور يوفال ريس والدكتور ويليام بروير على المراجعة النقدية للمخطوطة وعمري الفاصي للمساعدة في تطوير مقايسة الشاشة Ura3-GFP. نشكر أيضا الدكتور م. هوشستراسر والدكتور ر. كولكا على البلازميدات والسلالات. تم تمويل هذا العمل من قبل الأكاديمية الإسرائيلية للعلوم (المنحة 786/08) والمؤسسة العلمية ثنائية القومية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (المنحة 2011253).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قاعدة برنامج

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نيتروجين خميرة ديفكو مع الأحماض الأمينية وكبريتات الأمونيومBD Biosciences233520لنمو الخميرة على وسائط SD البسيطة. الأحماض الأمينية التي سيتم توفيرها هي: الأرجينين ، الهيستيدين ، الأيزولوسين ، الليوسين ، الليسين ، الميثيونين ، فينيل ألانين ، ثريونين ، التربتوفان
كبريتات الأمونيومسيجما - ألدريتشA4418
الجلوكوزسيجما - ألدريتش16325
الأدينينسيجما - ألدريتشA8626
يوراسيلسيجما - ألدريتشU0750
الأحماض الأمينيةالأعلى النقاء المتاحة 
96 بئر لوحاتNunc167008يمكن استخدام أي علامة تجارية أخرى متوافقة
Cyclohexamide   ؛Sigma - AldrichC7698conc. 0.5 مجم / مل
سلسلة Infinite 200 PROTecanلحضانة الخميرة وقياسات OD600< / sub>. يمكن استخدام أي قارئ آخر متوافق يتم التحكم فيه بدرجة الحرارة.
MDTcalcالتجريبي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  2. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
  3. Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
  4. Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
  5. Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
  6. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  7. Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
  8. Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
  9. Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
  12. Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
  13. Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
  14. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
  15. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
  16. Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
  17. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  18. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
  19. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
  20. Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
  21. Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
  22. Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
  23. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
  24. Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
  25. Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

URA3 E2

مقالات ذات صلة