يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عدوى فيروسات الفئران الجنينية الجذعية المستمدة خلية خلايا الجسم مضغي لتحليل التمايز لدم

8.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52022

⸱

أكتوبر 20, 2014

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

في هذه المقالة

ملخص

يمكن تحقيق التلاعب بالتعبير الجيني الزمني في تمايز الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) باستخدام أنظمة الجينات المحفزة. ومع ذلك ، فإن توليد هذه الخطوط الخلوية مكلف ويستغرق وقتا طويلا. يحقق هذا البروتوكول التعبير السريع عن الجين المعدل وراثيا في التفريق بين الخلايا المشتقة من ES والتحليل اللاحق للتمايز المكونة للدم.

الملخص

الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي نموذج رائع لتوضيح الآليات الجزيئية للتمايز الخلوي. إنها مفيدة بشكل خاص للتحقيق في تطور الخلايا السلفية المكونة للدم المبكرة (HPCs). يمكن التلاعب بالتعبير الجيني في الخلايا الجذعية الجذعية بواسطة العديد من التقنيات التي تسمح بتحديد دور الجزيئات الفردية في التطور. تتمثل إحدى الصعوبات في أن التعبير عن جينات معينة غالبا ما يكون له تأثيرات نمطية مختلفة تعتمد على تعبيرها الزمني. يمكن التحايل على هذه المشكلة من خلال توليد ESCs التي تعبر بشكل محفز عن جين ذي أهمية باستخدام تقنية مثل نظام الجينات المعدل المحفز للدوكسيسيكلين. ومع ذلك ، فإن توليد خطوط الخلايا المحفزة هذه مكلف ويستغرق وقتا طويلا. الموصوفة هنا هي طريقة لتصنيف الأجسام الجنينية المشتقة من ESC (EBs) إلى معلقات خلية واحدة ، وإصابة معلقات الخلية بأثر رجعي ، ثم إصلاح EBs عن طريق تعليق القطرة. ثم يتم تقييم التمايز في اتجاه مجرى النهر عن طريق قياس التدفق الخلوي. باستخدام هذا البروتوكول ، تم إثبات أن التعبير الخارجي لجين microRNA في بداية تمايز ESC يمنع توليد الحوسبة عالية الأدنى. ومع ذلك ، عند التعبير عنها في الخلايا المشتقة من EB بعد إنتاج الأديم المتوسط الناشئ ، فإن جين microRNA يعزز التمايز المكونة للدم. هذه الطريقة مفيدة للتحقيق في دور الجينات بعد اشتقاق أنسجة طبقة جرثومية معينة.

المقدمة

الخلايا الجذعية الجنينية الفئران (ESCs) متعددة القدرات ، وتبقى غير متمايزة ومتجددة ذاتيا في وجود عامل مثبط سرطان الدم السيتوكين (LIF) 1. عند سحب LIF ، سوف يتمايزون تلقائيا إلى هياكل ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) تسمى الأجسام الجنينية (EBs) 2. تسمح البنية ثلاثية الأبعاد بتطوير الطبقات الجرثومية الثلاث الأديم الظاهر والأديم الباطن والأديم المتوسط ، والتي تؤدي لاحقا إلى ظهور أنواع الأنسجة الناضجة3. تعد الخلايا الجذعية بالدماغ نموذجا استثنائيا لتوضيح الآليات الجزيئية للتمايز الخلوي ، ولا سيما التحقيق في تطور الخلايا السلفية المكونة للدم المبكرة (HPCs)4.

يمكن التلاعب بالتعبير الجيني في ESCs بواسطة العديد من التقنيات التي تسمح بتحديد دور الجزيئات الفردية في التطور. تتمثل إحدى التقنيات الأكثر شيوعا في استخدام إعادة التركيب المتماثل لتوليد خطوط ESC ، والتي تفتقر إلى جين ذي أهمية5،6. هناك أيضا عدد من التقنيات التي تم استخدامها للإفراط في التعبير عن الجينات. كانت التقنية الأولى المستخدمة لتعديل التعبير الجيني في الخلايا الجذعية الجذعية هي إصابتها بالفيروسات القهقرية المؤتلفة7،8. ومع ذلك ، غالبا ما يتم إسكات الجين محل الاهتمام حيث تتمايز الخلايا الجذعية الجذعية إلى أنواع الخلايا السلفية والناضجة. نجح استخدام فيروسات العدسات في الحد من إسكات الجينات المعبر عنهافيروسات 9. تشمل النواقل الفيروسية الأخرى المستخدمة للإفراط في التعبير الفيروس الغدي والفيروس المرتبطبالغدة 10. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم تقنيات التعدي القياسية لإدخال بلازميدات التعبير بثبات على نطاق واسع للتعبير الجينات المعدلة ESC11. تتمثل إحدى الصعوبات في هذه الأنظمة في أن التعبير عن جين معين غالبا ما يكون له تأثيرات مختلفة اعتمادا على تعبيره الزمني. على سبيل المثال ، يؤثر بروتين Smad1 على نمو الخلايا المكونة للدم بشكل مختلف خلال مراحل مختلفة من تطور EB12،13.

يمكن التحايل على هذه المشكلة من خلال توليد ESCs التي تعبر بشكل محفز عن جين مثير للاهتمام. يستخدم النظام الأكثر شيوعا للتعبير عن الجينات المعدلة وراثيا بشكل محفز في الخلايا الجذعية الجذعية أوبرون مقاومة التتراسيكلين من الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية). تم تطوير العديد من أنظمة التتراسيكلين المختلفة. تم تطوير واحدة من أكثر الاستراتيجيات شيوعا من قبل Kyba وزملاؤه14. لقد قاموا بإنشاء خط ESC (Ainv15) ، والذي يحتوي على جين منشط التتراسيكلين العكسي الذي تم إدخاله في موضع ROSA26 النشط بشكل أساسي. تم إدخال عنصر استجابة التتراسيكلين (TRE) ، وموقع LoxP في اتجاه مجرى النهر (موضع X-over P1 من العاثية P1) ، وشريط نيومايسين بدون مروج في HPRT (هيبوكسانثين - جوانين فوسفوريبوسيلترانسفيراز) على الكروموسوم X. باستخدام نهج إعادة تركيب CRE ، يمكن إدخال جين مثير للاهتمام جنبا إلى جنب مع محفز حقيقيات النواة لدفع التعبير عن جين مقاومة النيومايسين في موقع LoxP. يتم عزل ESCs المستهدفة بشكل صحيح عن طريق تحديد G418. يجب بعد ذلك اختبار هذه المستنسخة المستهدفة بحثا عن التعبير المحفز للدوكسيسيكلين (أو التتراسيكلين) للجين المعدل وراثيا. نجح هذا النهج في إنشاء خطوط ESC التي تعبر بشكل محفز عن HoxB4 و Stat5 و SCL و Smad714-17. ومع ذلك ، فإن توليد خطوط الخلايا المحفزة هذه يستغرق وقتا طويلا. الموصوفة هنا هي طريقة لتقسيم الأجسام الجنينية المشتقة من ESC (EBs) إلى معلقات خلية واحدة ، وإصابة معلقات الخلايا بأثر رجعي في أيام مختلفة من التطور ، ثم إصلاح EBs عن طريق تعليق القطرة. يتم تقييم التمايز النهائي لاحقا عن طريق قياس التدفق الخلوي. في هذه المقالة ، يتم عرض مثال على كيفية تأثير تعبير miRNA في الخلايا المشتقة من EB على التمايز المكونة للدم. هذه الطريقة مفيدة للتحقيق في دور الجينات بعد اشتقاق أنسجة طبقة جرثومية معينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. مضغي الشكل الجسم (EB) تشكيل

  1. الجيلاتين التكيف مع المجالس الاقتصادية والاجتماعية التي حافظت على الخلايا الليفية الماوس الجنين (MEFs). المجالس الاقتصادية والاجتماعية مرور 3 مرات في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين لإزالة MEFs.
    1. تنمو الخلايا في وسائل الإعلام ESC الصيانة مع LIF للحفاظ على خلايا غير متمايزة (الجدول 1). جعل خلايا المؤكد لم تتجاوز 80٪ التقاء. استخدام مرور منخفضة (10 أو أقل بعد إزالة مقاطع من MEFs) الخلايا للتمايز.
  2. في اليوم قبل المجالس الاقتصادية والاجتماعية والثقافية وللEB التمايز، ومرور الخلايا بحيث أنها ستكون حوالي 50-70٪ متكدسة في اليوم التالي. الاستمرار في زراعة الخلايا ESC صيانة المتوسطة للاحتفاظ تعدد القدرات الخلية.
  3. في يوم تمايز والإعلام الصيانة نضح ESC وتغسل مع 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS: 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، و 11.9 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4) لكل بئر من لوحة 6 جيدا.
    1. إضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ trypsفي / EDTA إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    2. إبطال نشاط التربسين / EDTA مع 800 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز. الماصة صعودا وهبوطا في 2 مل الماصة المصلية مع طرف P200 إلى تفكك الخلايا في تعليق خلية واحدة. تأكد من أن طرف P200 يلائم بشكل مريح على نهاية حتى وسائل الإعلام لا ترتفع بين الماصة واجهة طرف.
    3. الماصة صعودا وهبوطا بحوالي 5-10 مرات. والحرص على عدم خلق فقاعات خلال pipetting ل.
  4. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. طرح حجم 10 مل مع برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 315 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة طاف. غسل مرتين مع 5 مل PBS لإزالة ما تبقى وسائل الإعلام التي تحتوي على LIF. أجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.4 لكل غسل.
    1. resuspend الكرية خلية النهائي في 2 مل من وسائل الإعلام التمايز (الجدول 2).
  6. عد الخلايا مع عدادة الكريات أو خلية مكافحة وطبق 6،000-10،000 خلية / مل في 10 سم لوحة بيتري(ثقافة غير الأنسجة المعالجة).
    1. تحديد بالضبط خلية / مل تجريبيا لكل خط ESC. استخدام لوحات بتري معقمة تستخدم عادة للعمل بكتيرية أو لوحات التقيد منخفضة.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج التمايز، ينبغي أن تشكل EBS المجالات التي لا تزال معلقة دون ربط إلى اللوحة. اختبار العديد من العلامات التجارية لوحات منها لإيجاد أقل الالتزام.
    2. احتضان المجالس الاقتصادية والاجتماعية التفريق في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة مع 5٪ CO 2.
كاشف الأسهم تركيز النهائي حجم شركة عدد كتالوج
DMEM 1X 410 مل S IGMA / الدريتش D5796
FBS (ES المفحوص) 100٪ 15٪ 75 مل Hyclone SH30070.03E
الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 11140
L-الجلوتامين 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 35050
Penncillin / الستبرتوميسين 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 15070
β-المركابتويثانول 14.3 M 114 ميكرومتر 4 ميكرولتر سيغما / الدريتش M3148
سرطان الدم التثبيطي عامل (LIF) 10 7 وحدة / مل 1،000 وحدة / مل 50 ميكرولتر ميليبور ESG1107
ontent "> الجدول 1: ESC صيانة وسائل الإعلام.

كاشف الأسهم تركيز النهائي حجم شركة عدد كتالوج
DMEM 1X 410 مل سيغما / الدريتش D5796
FBS (العضو فحص لتمايز الأمثل) 100٪ 15٪ 75 مل Hyclone SH30070.03E
الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 11140
L-الجلوتامين 100X 1X 5 مل الحياة تقانةخيس 35050
Penncillin / الستبرتوميسين 100X 1X 5 مل تقنيات الحياة 15070
β-المركابتويثانول 14.3 M 114 ميكرومتر 4 ميكرولتر سيغما / الدريتش M3148

الجدول 2: التمايز وسائل الإعلام.

2. إعداد الخلايا لعدوى فيروس EB

  1. في المرحلة المطلوبة للتنمية (بين يوم 2 ويوم 3)، ونقل EBS من طبق بتري 10 سم إلى 15 مل أنبوب مخروطي. غسل لوحة مع 5 مل PBS وإضافة إلى غسل أنبوب مخروطي.
  2. بيليه EBS في 315 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. غسل الخلايا EB مع 5 مل PBS.
  3. إضافة 1 مل من محلول مذاب مفرزة الخلية (يحتوي على بروتين الكولاجين والانزيمات) ووضع الأنابيب في 37 ° C حمام الماء (أو حاضنة) لمدة 30 دقيقة مع أورينتالتحريض asional (من vortexing لعبها أو الضوء).
  4. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام التمايز. الماصة صعودا ونزولا مع الماصة 2 مل مع طرف الماصة P200. وضع أنبوب في 37 ° C حمام الماء مرة أخرى لمدة 30-60 دقيقة.
  5. تدور أسفل الخلايا في 315 x ج لمدة 5 دقائق وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.

عدوى فيروس 3.

  1. resuspend الخلايا في 1.5 مل من وسائل الإعلام التمايز. نقل تعليق خلية إلى 6 جيدا غير الأنسجة الثقافة وحة المعالجة.
  2. إعداد الارتجاعي من التقنيات القياسية في وقت مبكر. إضافة 5-100 ميكرولتر من طاف الفيروسي لخلايا اعتمادا على عيار الفيروسية. لا تضيف polybrene لتعزيز العدوى لأن هذا يحول دون إصلاح لاحق من EBS.
  3. Spinoculate الخلايا مع الفيروس عن طريق الطرد المركزي في 2،120 x ج لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

4. التفريق الفيروسية الخلايا المصابة EB في قطرات شنقا

  1. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام التمايز إلى كل بئر من طnfected EB التعليق الخلية.
  2. الماصة 3.5 مل من المصابين EB تعليق خلية في خزان معقم كاشف للmultipipettors. استخدام الماصة 15-20 multipipettor إلى صفوف من ثمانية 20 ميكرولتر قطرات على الغطاء المقلوب من 15 سم لوحة بيتري.
  3. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة أو المياه إلى النصف السفلي من لوحة بيتري. ثم قلب الغطاء مع قطرات ومكان على طبق بيتري. تأكد من أن قطرات معلقة رأسا على عقب من غطاء مع برنامج تلفزيوني أو الماء أقل للحفاظ على ترطيب الغرفة.
  4. ضع الأطباق في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة مع 5.0٪ CO 2.
  5. بعد 2 أيام، جمع EBS شكلت في قطرات شنقا بواسطة قلب الغطاء والغسيل مع 4.5 مل من وسائل الإعلام التمايز.
    1. وسائل الاعلام نقل وEBS للثقافة 10 سم غير الأنسجة بيتري لوحة جديدة. غسل غطاء مرة أخرى مع 3 مل من وسائل الإعلام التمايز ونقل إلى 10 سم لوحة.
  6. حصاد الخلايا لتحليلها من قبل التدفق الخلوي بعد ما مجموعه 8أيام الثقافة بدءا من نقل الخلايا الأولية إلى وسائل الإعلام التمايز (-LIF).

5. إعداد الخلايا لتحليل تدفق عداد الكريات

  1. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل مع 10 مل الماصة. غسل لوحة مع 5 مل PBS ونقل إلى نفس أنبوب مخروطي.
  2. خلايا بيليه في 315 ز س. غسل الكريات مع 10 مل PBS.
  3. إضافة 1 مل من محلول مذاب مفرزة الخلية ووضع الأنابيب في 37 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة مع الإثارة في بعض الأحيان. للكشف عن بعض مستضدات سطح الخلية، التربسين يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك.
  4. إضافة 1 مل سائل الإعلام التمايز والماصة صعودا وهبوطا مع 2 مل الماصة. استخدام غيض P200 إلى نهاية الماصة للمساعدة في كسر المتابعة هضمها EB في تعليق خلية واحدة.
    1. وضع أنبوب في 37 ° C حمام الماء مرة أخرى لمدة 60 دقيقة حتى يتسنى للبروتينات الغشاء متكاملة لإعادة تدوير إلى سطح الخلية.
  5. بيليه الخلايا في 315 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. غسل واي خلاياال 0.1٪ مصل بقري الزلال جزء V (BSA) التي أعدت في برنامج تلفزيوني (PBS / BSA)، واحتضان الخلايا مع محددة الموسومة fluorescently الأجسام المضادة.

6. تحليل التدفق الخلوي للدم الأسلاف

  1. وضع 10 6 خلايا EB المستمدة في الجولة 5 مل 12 × 75 مم أنبوب أسفل. لضبط إعدادات تدفق عداد الكريات التعويض، استخدام الخرز التعويض وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. خلايا بيليه في 315 ز س. تخلصي من طاف و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني المتبقية الحل / BSA في الأنبوب.
  3. للكشف عن ESC HPCS، احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الفلورسنت المسمى: مكافحة فأر CD41-PE (R-Phycoerytherin) ومكافحة فأر CD117 (cKit) -APC / CY7 (Allophycocyanin Cyanine 7).
    1. تمييع الأجسام المضادة 1: 100 في برنامج تلفزيوني / BSA. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف لكل عينة. تحديد الصحيح التخفيف من الأجسام المضادة لكل بائع، استنساخ، والكثير أو الأجسام المضادة. تحديد التخفيف الأمثل لوصفها الخلايا بشكل فردي.
  4. احتضان العينات على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.
  5. إضافة 2 مل PBS / BSA وبيليه الخلايا في 315 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. نضح وطاف بيليه resuspend في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو متساوي التوتر عازلة أخرى.
  7. مرشح معلق الخلايا من خلال مصفاة غطاء الخلية (0.35 ميكرومتر) لإزالة الركام الخلية الكبيرة.
  8. تحليل الخلايا على وعداد الكريات التدفق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه الدراسات مهيلم RW4 (مشتقة من 129X1 / SVJ سلالة الماوس) المجالس الاقتصادية والاجتماعية تم استخدامها. تم عزل EBS في 3 أيام من التمايز. للحصول على أفضل النتائج يجب أن يكون EBS كروية وغير ملتصقة (الشكل 1A، B). بعد spinoculation بفيروس المشارك تعبر عن GFP علامة الفلورسنت جنبا إلى جنب مع الجينات في المصالح، تم إصلاحه EBS بواسطة طريقة قطرة شنقا. تم إصلاحه EBS بنجاح من الايقاف الخلية أعدت من 2.0، 2.5، و 3.0 يوم EBS. ومع ذلك، EBS لا يمكن إصلاحه من تعليق خلية المحضرة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كما نوقش أعلاه، يمكن أن تتولد استنساخ ESC التي تعبر عن inducibly الجينات ذات الاهتمام باستخدام نظم الدوكسيسيكلين، ومع ذلك، جيل من هذه السطور هو وقتا طويلا وعمالة كثيفة. الموصوفة في هذا البروتوكول هو وسيلة للتعبير عن الجينات في المصالح في تعليق خلية واحدة أعدت من ESC المستمدة EBS. ثم يتم إصلاح هذه الخلايا المصابة في EBS شنقا انخفاض لدراسة التمايز لاحق. في المثال (الشكل 3)، يتبين أن التعبير عن الكتلة mirn23a يعزز تنمية المكونة للدم عندما أعرب في يوم 3 من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة في الكشف عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح تجريبية وجدوى من مركز كلية الطب بجامعة إنديانا (IUSM) للتميز في أمراض الدم الجزيئية (NIDDK ، 5P30DK090948). تم توفير تمويل إضافي من خلال منحة التعزيز الطبي الحيوي من IUSM. نود أن نشكر الدكتورة كارين كاودن دال على التعليق على المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMسيجما / ألدريتشD5796
& # 946 ؛ -ميركابتو إيثانولسيجما / ألدريتشM3148
FBS (تم فحصه ES)HycloneSH30070.03E
FBS (محدد)HycloneSH30070.03
الأحماض الأمينية غير الأساسيةتقنيات الحياة11140
L-GlutamineLife تقنيات35050
بنسلفانيا / سترابلايف تكنولوجيز15070
Trypsin / EDTALife Technologies25200
LIF ESGROMilliporeESG1107
ACCUMAXMilliporeSCR006
Trypsin / EDTALife Technologies25200
Falcon Tissue Culture Plates 6- ويلفيشر ساينتفيك08-772-1B
فالكون لوحات غير معالجة 6 آبارفيشر ساينتفيك08-772-49
صحن فالكون بتري 10 سمفيشر ساينتفيك08-757-100D
صحن فالكون بتري 15 سمفيشر ساينتفيك08-757-148
أنبوب فالكون 5 ملفيشر ساينتفيك14-959-11A
فالكون تيوب 5 مل مع غطاء مصفاة الخليةفيشر ساينتفيك08-771-23
مستودع أبيض معقمالمتحدة الأمريكية Scientific111-0700
الفئران المضادة للفأر CD41Biolegendالمترافق PE 133906
الفئران المضادة للفأر CD117 APC / CY7Biolegendالمترافق 105826
RW4 ESCsATCCCRL-12418
الولايات

المراجع

  1. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  2. Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
  3. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  4. Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
  5. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
  6. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
  7. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
  8. Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
  9. Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
  10. Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
  12. Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
  13. Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
  14. Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
  15. Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
  16. Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
  17. Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
  18. Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
  19. Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
  20. Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
  21. Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
  22. Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
  23. Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
  24. Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
  25. Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
  26. Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

خلايا جذعية جنينيةتكوين أجسام شبيهة بالأجنةتحليل قياس التدفق الخلويتحضير معلق خلويطريقة القطرة المعلقةصبغ بالأجسام المضادة الفلوريةعلامات CD41 وCD17أنسجة الطبقات الجرثومية
عدوى فيروسات الفئران الجنينية الجذعية المستمدة خلية خلايا الجسم مضغي لتحليل التمايز لدم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.