يمكن تحقيق التلاعب بالتعبير الجيني الزمني في تمايز الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) باستخدام أنظمة الجينات المحفزة. ومع ذلك ، فإن توليد هذه الخطوط الخلوية مكلف ويستغرق وقتا طويلا. يحقق هذا البروتوكول التعبير السريع عن الجين المعدل وراثيا في التفريق بين الخلايا المشتقة من ES والتحليل اللاحق للتمايز المكونة للدم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عدوى فيروسات الفئران الجنينية الجذعية المستمدة خلية خلايا الجسم مضغي لتحليل التمايز لدم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي نموذج رائع لتوضيح الآليات الجزيئية للتمايز الخلوي. إنها مفيدة بشكل خاص للتحقيق في تطور الخلايا السلفية المكونة للدم المبكرة (HPCs). يمكن التلاعب بالتعبير الجيني في الخلايا الجذعية الجذعية بواسطة العديد من التقنيات التي تسمح بتحديد دور الجزيئات الفردية في التطور. تتمثل إحدى الصعوبات في أن التعبير عن جينات معينة غالبا ما يكون له تأثيرات نمطية مختلفة تعتمد على تعبيرها الزمني. يمكن التحايل على هذه المشكلة من خلال توليد ESCs التي تعبر بشكل محفز عن جين ذي أهمية باستخدام تقنية مثل نظام الجينات المعدل المحفز للدوكسيسيكلين. ومع ذلك ، فإن توليد خطوط الخلايا المحفزة هذه مكلف ويستغرق وقتا طويلا. الموصوفة هنا هي طريقة لتصنيف الأجسام الجنينية المشتقة من ESC (EBs) إلى معلقات خلية واحدة ، وإصابة معلقات الخلية بأثر رجعي ، ثم إصلاح EBs عن طريق تعليق القطرة. ثم يتم تقييم التمايز في اتجاه مجرى النهر عن طريق قياس التدفق الخلوي. باستخدام هذا البروتوكول ، تم إثبات أن التعبير الخارجي لجين microRNA في بداية تمايز ESC يمنع توليد الحوسبة عالية الأدنى. ومع ذلك ، عند التعبير عنها في الخلايا المشتقة من EB بعد إنتاج الأديم المتوسط الناشئ ، فإن جين microRNA يعزز التمايز المكونة للدم. هذه الطريقة مفيدة للتحقيق في دور الجينات بعد اشتقاق أنسجة طبقة جرثومية معينة.
المقدمة
الخلايا الجذعية الجنينية الفئران (ESCs) متعددة القدرات ، وتبقى غير متمايزة ومتجددة ذاتيا في وجود عامل مثبط سرطان الدم السيتوكين (LIF) 1. عند سحب LIF ، سوف يتمايزون تلقائيا إلى هياكل ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) تسمى الأجسام الجنينية (EBs) 2. تسمح البنية ثلاثية الأبعاد بتطوير الطبقات الجرثومية الثلاث الأديم الظاهر والأديم الباطن والأديم المتوسط ، والتي تؤدي لاحقا إلى ظهور أنواع الأنسجة الناضجة3. تعد الخلايا الجذعية بالدماغ نموذجا استثنائيا لتوضيح الآليات الجزيئية للتمايز الخلوي ، ولا سيما التحقيق في تطور الخلايا السلفية المكونة للدم المبكرة (HPCs)4.
يمكن التلاعب بالتعبير الجيني في ESCs بواس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. مضغي الشكل الجسم (EB) تشكيل
- الجيلاتين التكيف مع المجالس الاقتصادية والاجتماعية التي حافظت على الخلايا الليفية الماوس الجنين (MEFs). المجالس الاقتصادية والاجتماعية مرور 3 مرات في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين لإزالة MEFs.
- تنمو الخلايا في وسائل الإعلام ESC الصيانة مع LIF للحفاظ على خلايا غير متمايزة (الجدول 1). جعل خلايا المؤكد لم تتجاوز 80٪ التقاء. استخدام مرور منخفضة (10 أو أقل بعد إزالة مقاطع من MEFs) الخلايا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذه الدراسات مهيلم RW4 (مشتقة من 129X1 / SVJ سلالة الماوس) المجالس الاقتصادية والاجتماعية تم استخدامها. تم عزل EBS في 3 أيام من التمايز. للحصول على أفضل النتائج يجب أن يكون EBS كروية وغير ملتصقة (الشكل 1A، B). بعد spinoculation بفيروس المشارك تعبر عن GFP علامة الفلورسنت جنبا إلى جنب مع الجينات في المصالح، تم إصلاحه EBS بواسطة طريقة قطرة شنقا. تم إصلاحه EBS بنجاح من الايقاف الخلية أعدت من 2.0، 2.5، و 3.0 يوم EBS. ومع ذلك، EBS لا يمكن إصلاحه من تعليق خلية المحضرة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كما نوقش أعلاه، يمكن أن تتولد استنساخ ESC التي تعبر عن inducibly الجينات ذات الاهتمام باستخدام نظم الدوكسيسيكلين، ومع ذلك، جيل من هذه السطور هو وقتا طويلا وعمالة كثيفة. الموصوفة في هذا البروتوكول هو وسيلة للتعبير عن الجينات في المصالح في تعليق خلية واحدة أعدت من ESC المستمدة EBS. ثم يتم إصلاح هذه الخلايا المصابة في EBS شنقا انخفاض لدراسة التمايز لاحق. في المثال (الشكل 3)، يتبين أن التعبير عن الكتلة mirn23a يعزز تنمية المكونة للدم عندما أعرب في يوم 3 من ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة في الكشف عنها.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منح تجريبية وجدوى من مركز كلية الطب بجامعة إنديانا (IUSM) للتميز في أمراض الدم الجزيئية (NIDDK ، 5P30DK090948). تم توفير تمويل إضافي من خلال منحة التعزيز الطبي الحيوي من IUSM. نود أن نشكر الدكتورة كارين كاودن دال على التعليق على المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | سيجما / ألدريتش | D5796 | |
| & # 946 ؛ -ميركابتو إيثانول | سيجما / ألدريتش | M3148 | |
| FBS (تم فحصه ES) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (محدد) | Hyclone | SH30070.03 | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية | تقنيات الحياة | 11140 | |
| L-Glutamine | Life تقنيات | 35050 | |
| بنسلفانيا / ستراب | لايف تكنولوجيز | 15070 | |
| Trypsin / EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin / EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6- ويل | فيشر ساينتفيك | 08-772-1B | |
| فالكون لوحات غير معالجة 6 آبار | فيشر ساينتفيك | 08-772-49 | |
| صحن فالكون بتري 10 سم | فيشر ساينتفيك | 08-757-100D | |
| صحن فالكون بتري 15 سم | فيشر ساينتفيك | 08-757-148 | |
| أنبوب فالكون 5 مل | فيشر ساينتفيك | 14-959-11A | |
| فالكون تيوب 5 مل مع غطاء مصفاة الخلية | فيشر ساينتفيك | 08-771-23 | |
| مستودع أبيض معقم | المتحدة الأمريكية Scientific | 111-0700 | |
| الفئران المضادة للفأر CD41 | Biolegend | المترافق PE 133906 | |
| الفئران المضادة للفأر CD117 APC / CY7 | Biolegend | المترافق 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
المراجع
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
