مقالة منهجية

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الضمور العضلي المرضى: كفاءة خالية من التكامل إعادة برمجة الخلايا المستمدة البول

DOI:

10.3791/52032

⸱

يناير 28, 2015

 , 
1Department of Medicine, Medical College of Wisconsin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستلزم هذا البروتوكول إجراءات مفصلة لعزل الخلايا المشتقة من البول من مرضى الحثل العضلي ؛ إعادة برمجتها الفعالة والسريعة من خلال نقل فيروس سينداي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتلال عضلة القلب التصنع هو نتيجة غير مفهومة من الضمور العضلي. توليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) من المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات هو مصدر الخلوي لا يقدر بثمن لفي المختبر أنظمة نموذج المرض، ويمكن استخدامها للدراسات فحص المخدرات. وقد استخدمت خلايا البول المستمدة من المريض في إعادة برمجة ناجحة في الخلايا الجذعية المحفزة من أجل نموذج اعتلال عضلة القلب حثلي 1. معالجة مخاوف تتعلق بالسلامة دمج أنظمة النواقل، نقدم بروتوكول باستخدام غير دمج-سينداي ناقلات الفيروس لتنبيغ ياماناكا العوامل في خلايا البول التي جمعت من المرضى الذين يعانون من الضمور العضلي. هذا البروتوكول يولد برمجتها بالكامل الحيوانات المستنسخة في غضون 2-3 أسابيع. الخلايا المحفزة هي خالية من متجه من قبل مرور 13. يمكن التفريق بين هذه iPSCs التصنع في العضلية وتستخدم إما لدراسة آليات المرض أو لفحص المخدرات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتلال عضلة القلب هو السبب الرئيسي الثاني للوفاة في المرضى الذين يعانون من دوشين وبيكر ضمور العضلات (MD). على الرغم من أن الطفرات في العاشر مرتبطة الدستروفين الجينات تحدث في 1: 3،500 المواليد الذكور، والقليل جدا هو المعروف عن الأحداث الجزيئية والخلوية مما يؤدي إلى تلف العضلات التدريجي القلب. وظهرت الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان المستمدة من مرضى ضمور العضلات كأداة جديدة لدراسة آليات المرض الكامنة واستخدامها لفحص المخدرات 1،2.

عدم الراحة المتوقعة من خزعات الجلد أو عينات الدم قد يثني المرضى الصغار و / أو أولياء أمورهم لإعطاء الموافقة للمشاركة الدراسة. عينات البول هي مصدر غير الغازية من الخلايا الجسدية التي هي قابلة للتعديل لأساليب إعادة برمجة. لقد أظهرنا مؤخرا أن الخلايا البول التي جمعت من مرضى ضمور العضلات قد يكون مثقف وكفاءة برمجتها في iPSCs باستخدام تنبيغ فيروسات مع العوامل ياماناكا (Oct3 / 4، Sox2، Klf4، وج. Myc على. OSKM) 1. وعيب توصيل الجينات فيروسات هو دمج عشوائي من الجينات إعادة برمجة في الكروموسومات المضيف. للتغلب على هذا القيد، وقد استخدمنا غير دمج الفيروسات سينداي لإعادة برمجة خلايا البول.

هذا البروتوكول تفاصيل إعادة برمجة فيروس سينداي الخلايا البول معزولة من مرضى ضمور العضلات ومن ثم يمكن متباينة في العضلية أو أنواع الخلايا الأخرى لمزيد من الدراسة. ويمكن أيضا هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأمراض محددة المريض الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يجب على المرضى و / أو أولياء أمورهم إعطاء الموافقة المسبقة للمشاركة في مجلس المراجعة المؤسسية وافق الدراسة.

1. المخازن والاستعدادات وسائل الإعلام

  1. غسل العازلة: لتحضير 100 مل من غسل العازلة، إضافة 1 مل من القلم 100X / بكتيريا الحل (100 U / البنسلين مل + 100 ميكروغرام / مل من الستربتوميسين) إلى 99 مل من المياه المالحة عازلة الفوسفات (PBS).
  2. البولية السلف خلية (UPC) المتوسطة: لإعداد UPC المتوسطة، مزيج أحجام متساوية من الكيراتينية المصل الحرة (KSF) متوسطة + السلف خلية متوسطة.
    1. KSF المتوسطة: لتحضير القرنية المتوسطة، إضافة 5 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة (EGF)، 50 نانوغرام / مل من مستخلص الغدة النخامية البقري (BPE)، 30 نانوغرام / مل من السم الكوليرا، والحل القلم / بكتيريا (100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) إلى 500 مل المتوسطة قوة أمن كوسوفو.
    2. متوسط ​​السلف الخلية: إضافة ثلاثة أرباع DMEM مع ربع من وسائل الاعلام هام-F12 وتكملة مع 10٪ FBS، 0.4 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، 0.1نانومتر السم الكوليرا، 5 نانوغرام / مل الأنسولين، 1.8 × 10 -4 M الأدينين، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 2 × 10 -9 M triiodo ثيرونين، 10 نانوغرام / مل EGF، والقلم / بكتيريا الحل.
  3. [هس المتوسطة: إضافة 20٪ استبدال KO المصل (K-SR)، 1X MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، 2 ملي لتر-الجلوتامين، و 100 ميكرومتر β المركابتويثانول، 20 نانوغرام / مل bFGF والقلم / بكتيريا إلى 400 مل DMEM / F12 المتوسطة.

2. البول جمع العينات

  1. إرشاد المرضى على شرب السوائل 30 دقيقة قبل جمع البول للتأكد من أن كمية كافية (~ 30-40 مل) من البول يمكن جمعها.
  2. إعطاء المرضى و / أو أولياء أمورهم مجموعة جمع البول تحتوي على العناصر التالية: (1) تعليمات مكتوبة حول كيفية الحصول على معقمة أو نظيفة عينة البول الصيد، (2) المراحيض مضادة للبكتيريا رطبة، و (3) 100 مل العقيمة عينة كوب المجموعة. إرشاد المرضى لجمع العينة.
  3. وضع على الفور عينات البول على الجليد ونقل إلى لابوراحزب المحافظين في برودة. معالجة البول لعزل الخلايا الفور. إذا كان تأخير أمر لا مفر منه، وتخزين العينة على الجليد لمدة تصل إلى 4 ساعات مع فقدان الحد الادنى من بقاء الخلية.

3. عزل وتوسيع الخلايا البول

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية تحت ظروف معقمة في BSL2 خزانة السلامة البيولوجية.

  1. استخدام ماصات معقمة، وعينات البول لنقل العقيمة أنابيب الطرد المركزي 50 مل. الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في RT.
  2. نضح طاف وترك 1 مل في أنبوب؛ يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
  3. في resuspend والجمع بين الكريات من أنابيب متعددة في 7 مل من غسل العازلة وتكرار الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في RT.
  4. نضح بعناية طاف، وترك بيليه الخلية و~ 0.2-0.5 مل من طاف. resuspend في 2-3 مل من البول السلف خلية (UPC) متوسطة ونقل إلى تعليق 4-6 الآبار من الامم المتحدةالمغلفة لوحة 24-جيدا.
  5. بعد 72 ساعة، تكملة الثقافة مع 0.5 مل من المتوسط ​​UPC جديدة لكل بئر وتغيير المتوسطة بعد كل 2-3 أيام. سيتم إزالة كريات الدم الحمراء والخلايا الحرشفية التي لا نعلق على لوحة مع التغييرات المتوسطة.
  6. مراقبة الثقافة بعد 4-6 أيام.
    ملاحظة: سوف تبدأ صغيرة 2-4 مستعمرات الخلايا على ما يبدو. سيتم تقريب الخلايا أو ممدود التي تمثل النوع الأول أو النوع الثاني من الظهارية الكلوي (RE) الخلايا على التوالي 3.
  7. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام مرة واحدة منذ ظهور الخلايا، فإنها تخضع لمرحلة التوسع السريع.
  8. وبمجرد أن تصل إلى خلايا 80-90٪ التقاء، حوالي 9-15 أيام بعد الطلاء، فصل ومرور الخلايا (15،000-18،000 خلية / سم 2) على 2-4 الآبار من 24 لوحة جيدا لمزيد من التوسع. بمناسبة هذا الأمر خلية مرور 1 (P1).
  9. تميز خلايا البول للمواصفات النسب من خلال تحليل تدفق cytometric، immunohistochemتلطيخ كال أو من خلال العكسي الناسخ، البلمرة سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR).
  10. إعادة برمجة خلايا البول معزولة (القسم 4) أو تجميد عليهم في تجميد المتوسطة (DMEM تستكمل مع 10٪ مصل و 10٪ DMSO) لcryostorage على المدى الطويل.

4. البول إعادة برمجة الخلية باستخدام سينداي الفيروسات

ينصح التعامل السليم واستخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، في حين التلاعب وكلاء transfecting: ملاحظة. نفذ الخطوات التالية تحت ظروف معقمة في BSL2 خزانة السلامة البيولوجية. ويوصى التخلص السليم من بنقل العدوى إلى خلايا وكيل و / أو transfected لتجنب خطر حدوث الأخطار البيئية والصحية. لالبول خلية إعادة برمجة، استخدم إعادة برمجة كيت سينداي مع تعديلات على البروتوكول التي تعتمد على التغذية الشركة المصنعة كما هو مفصل أدناه.

  1. لضمان إعادة برمجة عالية الكفاءة باستخدام فيروس سينداي، واستخدام الممرات 1-5 من الخلايا البول التي هي سريعةلاي الانقسام. إذا كانت الخلايا لا تتكاثر بشكل جيد أو تهرم، التخلص منها لأنها لن إعادة برمجة بكفاءة.
  2. البذور 60،000 الخلايا لكل بئر في بئرين لوحة 6 جيدا. اجعل هذا يوما -2. ضبط كثافة البذر الخلية (5 × 04-09 أكتوبر × 10 4 خلايا لكل بئر) حسب الحاجة للوصول إلى 80-90٪ التقاء قبل يوم 0.
  3. في يوم 0 (48 ساعة بعد طلاء الخلايا)، وإعداد موجهات إعادة برمجة سينداي (SEV) التي تحتوي على كل من العوامل OSKM الأربعة. إضافة كل من ناقلات إلى 1 مل من قبل تحسنت المتوسطة UPC. استخدام وزارة الداخلية من 1-1.5 (5-7،5 × 10 5 CIU)، وهو ما يكفي لإعادة برمجة خلايا البول. نضح المتوسطة وببطء إضافة 1 مل UPC + SEV إلى بئر واحدة من الخلايا البول. استخدام البئر الثانية كما سيطرة سلبية التنبيغ.
  4. في يوم 1، استبدل المتوسطة UPC + SEV مع الطازجة المتوسطة UPC. وينظر بعض موت الخلايا بعد 24 ساعة نظرا لسمية الخلايا الفيروسية.
  5. اعتمادا على كفاءة نسيلة برمجتهاتشكيلات الإلكترونية والتشكل المدمجة، والحفاظ على تغيير المتوسطة يوميا حتى يوم 6 أو 7.
  6. يوم واحد قبل تفكك خلايا transduced (يوم 5 أو 6)، وإعداد لوحات المغذية MEF بواسطة الطلاء ميتوميسين-C (10 ميكروغرام / مل لمدة 3 ساعة) معاملة MEFS في كثافة 5 × 10 4 خلية / سم 2، على 0.1 ٪ الجيلاتين المغلفة 100 مم 2 أطباق الثقافة.
  7. اليوم التالي (يوم 6 أو 7)، فصل الخلايا مع 0.25٪ التربسين، resuspend الخلايا في UPC المتوسطة وصفيحة 5 × 04-02 أكتوبر × 10 5 خلية / 100 مم 2 MEF لوحة المغذية.
  8. في اليوم التالي، والتحول إلى حس المتوسط ​​وتغيير المتوسطة كل يوم. مراقبة الخلايا تحت المجهر لمراقبة الخلايا تحولت.
    ملاحظة: الخلايا تشكل مجاميع نسيلي مع خاصية التشكل المرصوفة بالحصى وجود نواة لأعلى نسبة حشوية (12-18 أيام آخر التنبيغ).
  9. في غضون شهرين إلى ثلاثة أسابيع بعد التنبيغ، واختيار المستعمرات ونقل إلى لوحات جديدة للنسيلةالتوسع آل.
  10. أداء تلطيخ الخلايا الحية لاختيار الحيوانات المستنسخة التوجيهية التي تفرخ الخلايا مع TRA-1-81 الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة على 37 ° C في CO 2 حاضنة تليها مكافحة تلطيخ مع صبغة الفلورسنت محدد الضد الثانوية مترافق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة.
  11. استخدام 26 G 1½ بوصة الإبرة إلى عبر يفقس أكبر TRA-1-81 استنساخ IPSC إيجابية إلى قطع متساوية الحجم صغيرة (4-6 قطعة في استنساخ).
  12. استخدام معقم ماصة معلومات سرية لالتقاط ونقل 10-20 القطع عبر الفقس من الحيوانات المستنسخة متعددة في كل بئر من Matrigel (10 ميكروغرام / سم 2) -coated 24 لوحة جيدا مع حس المتوسطة.
    ملاحظة: قطعة من استنساخ واحد مطلي بشكل فردي في بئر واحد لا توسيع أو الحفاظ على تعدد القدرات.
  13. تغيير من حس لIPSC المتوسطة 24-48 ساعة بعد أن يتم إرفاق استنساخ برمجتها إلى السطح Matrigel.
  14. أثناء الصيانة على لوحات Matrigel المغلفة، يدويا SCRAPE-إيقاف أي خلايا متباينة أو تلويث الخلايا المغذية MEF باستخدام ماصة طرف لإثراء لالتصنع IPSC (MD-IPSC) استنساخ برمجتها بالكامل والمحفزة.
  15. بعد استنساخ الفردية وصلت ~ 100 حجم ميكرون، وتوسيع الحيوانات المستنسخة التي كتبها النأي مع 0.48 ملي EDTA (حمض ethylenediaminetetraacetic) حل لمدة 3 دقائق وطلي المجاميع خلية صغيرة من MD-iPSCs معلقة في IPSC المتوسطة (تستكمل مع 5 ميكرومتر Y27632، رو كيناز المانع ) على matrigel الطازجة (10 ميكروغرام / سم 2) المغلفة 12 لوحة جيدا. تغيير IPSC المتوسط ​​يوميا.
  16. إعادة برمجة الكاملة لكل استنساخ يمكن تحديد كل من تحليل التعبير الجيني الجينات OSKM وتلطيخ المناعى من علامات تعدد القدرات (Oct3 / 4 و TRA-1-81). وينبغي استخدام تقييم دقيق لإمكانية تعدد القدرات للتأكيد أن الخطوط التوجيهية إعادة برمجة بالكامل تفرق في ثلاث طبقات جرثومية. ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق هيئة مضغي الشكل (EB) تشكيل والتمايز فحص أو ثالثاatoma تشكيل الفحص.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معظم الخلايا الاصلية المعزولة من البول البشري إيجابية للسلف وخلية حوطية علامات uroepithelial مثل CD44، CD73، وCD146 (97.37٪، 97.09٪، و97.3٪ على التوالي؛ الشكل 1A و 1B). أعرب هذه الخلايا أيضا علامات الوسيطة الأخرى مثل الأكتين ألفا السلس العضلات وفيمنتين (الشكل 1B). تحليل RT-PCR يعطي دليلا على وجود يقطنها خليط سكاني من الخلايا في الثقافات في أنه لا يوجد تعبير ضعف Cytokeratin-7 (CK-7) وUroplakin (UP) -Ia و-IIIa، علامات النسب uroepith...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نمذجة أمراض القلب والشرايين باستخدام iPSCs أصبحت نهج مشترك لفهم مساهمة الوراثية 4-6. بعض الصعوبات غير المتوقعة من الحصول على عينات من خلايا المرضى، خاصة الأطفال الصغار، ويمكن تجنبها من خلال تقديم خيار نهج غير الغازية مثل جمع البول. في هذه الفئة من السكان الشباب المريض، وغالبا ما يكون من الصعب جمع كمية من البول كافية لانتاج خلايا البول ما يكفي لإعادة البرمجة. يدرب المرضى الصغار على شرب السوائل 30 دقيقة قبل جمع البول يحسن نجاح العزلة خلية البول. ومع ذلك، قد يكون مجموعات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم تطوير هذا البروتوكول من قبل النهوض بولاية ويسكونسن أكثر صحة والمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية ، المعاهد الوطنية للصحة ، من خلال المنحة رقم 8UL1TR000055. محتوياته هي مسؤولية المؤلفين فقط ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Materials< / strong>
4 Oz. كوب عينة مع غطاءSTL M9AMSAS340 الإمداد الطبيلجمع عينات
البول 15 مل BD-Falcon TubesFisher Scientific352097
50 مل BD-Falcon TubesFisher Scientific352098
Round GlassSlides Fisher Scientific12-545-81
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming KitLife TechnologiesA1378-001
PBS ، درجة الحموضة 7.4Life Technologies10010-023
Pen-Strep بدون الجلوتامين   ؛لايف تكنولوجيز15140-122دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
B-27 مكمل غذائي مع الأنسولين (50x)Life Technologies17504-044دافئ في 37 درجة; حمام مائي C قبل الاستخدام
مكمل B-27 بدون الأنسولين (50x)Life Technologies0050129SAدافئ في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام
DMEM / F12 (1: 1) LifeTechnologies11330-032دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
Versene ، 1: 5,000Life Technologies15040066دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
bFGF (10 & micro; ز)Life Technologies13256-029دافئة في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
Cell Counter CartridgesLife TechnologiesC10228
Knockout Serum (500   زجاجة مل)تقنيات الحياة10828-028دافئة في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
Recovery Cell Culture Frozen MediumLife Technologies12648-010
Keratinocyte-SFM (1x) ،Liquid Life Technologies17005-042دافئ في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام
DMEM ، ارتفاع الجلوكوز ، تقنيات GlutamaxLife10566-016دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
Ham's F-12 Nutrient Mix  تقنيات الحياة11765-054دافئة في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
EGF البروتين البشري المؤتلف ، تقنيات الحياة السائلةPHG0311Lدافئة في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
الأنسولين ، المؤتلف البشري ، الزنك SolnLife Technologies12585-014دافئ في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام
الخلايا الجذعيةTeSR-E85940دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
ROCK Inhibitor (Y-27632)SelleckS1049دافئ في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام
MatrigelBD Biosciences354277مصفوفة مؤهلة hESC ، مجموعة LVED المجانية
RNeasy Mini Kit   ؛Qiagen74104
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)Thermo-ScientificK1081
المؤهل FBSSigma AldrichF6178دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
الكاشف الحيوي الأدينينSigma AldrichA2786-5Gدافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
سم الكوليرا من Vibrio cholerae< / em>Sigma AldrichC8052-.5MGدافئ في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام
HydrocortisoneSigma AldrichH0888-1Gدافئ في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام
Holo-transferrin من الإنسانSigma AldrichT0665-50MGدافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
3،3 '، 5-Triiodo-L-thyronine ملح الصوديومSigma AldrichT6397-100MGدافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
DAPI سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-3598
Fluoromount Aquous تصاعد متوسطSigma AldrichF4680
16٪ ParaformaldehydeAlfa-Aesar43368
antibodies
Mouse anti CD44 - المسمى مع FITC & nbsp ؛BD Biosciences560977
Mouse anti CD146 - المسمى ب PEBD Biosciences561013
Mouse anti CD73 - المسمى PEBD Biosciences561014
الفأر المضاد للعضلات الملساء الأكتينSigma AldrichA2547
Mouse Anti-VimentinAbcamab8978-100
Mouse Anti - TRA-1-81لايف تكنولوجيز411100
أرنب مضاد لأكتوبر 3/4سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-9081
ماوس مضاد للدستروفينلايكا بيوأنظمةNCL-DYSB
تقنيات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
  2. Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
  3. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  6. Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).
  7. Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
  8. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  9. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
  10. Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
  11. González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
  12. Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة