مقالة منهجية

عزل بالسكان خلية متميزة من المخيخ تطوير من تسليخ مجهري

DOI:

10.3791/52034

⸱

سبتمبر 21, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Cancer Biology Program, Fox Chase Cancer Center, Temple University Health System

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسلاف، معربا عن Nestin هي التي تم تشخيصها حديثا من السكان الأسلاف العصبية في المخيخ النامية. باستخدام تقنية تسليخ مجهري المقدمة هنا في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية، ويمكن تنقية هذا السكان الخلية مع عدم وجود تلوث من المناطق الأخرى للدماغ ويمكن تربيتها لمزيد من الدراسات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسليخ مجهري هو أسلوب الرواية التي يمكن عزل مناطق معينة من الأنسجة وإزالة التلوث من مصادر الخلوية في المناطق المجاورة. وقد استخدمت هذه الطريقة لأول مرة في دراسة Nestin، معربا عن الأسلاف (NEPS)، يبلغ عدد سكانها التي تم تشخيصها حديثا من الخلايا في الطبقة الخارجية للدماغ جرثومي (EGL). باستخدام تسليخ مجهري في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، تم جمع السكان نقية من NEPS بشكل منفصل عن التقليدية السلائف الحبيبية الخلايا العصبية في EGL من تلويث وخلايا Nestin، معربا عن الأخرى في المخيخ. دون تسليخ مجهري، والتحليلات الوظيفية للNEPS لم يكن ممكنا مع الأساليب المتاحة حاليا، مثل التدرج Percoll الطرد المركزي والقبض على الليزر تسليخ مجهري. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية للاستخدام مع الأنسجة المختلفة التي تحتوي إما مناطق معروفة أو خلايا fluorescently المسمى. الأهم من ذلك، الميزة الرئيسية لهذا microdissectioن الأسلوب هو أن الخلايا المعزولة يعيشون ويمكن تربيتها لمزيد من التجارب، وهو حاليا غير ممكن مع الأساليب المذكورة الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون المخيخ من طبقات خلايا متعددة، تحتوي على كل أنواع الخلايا متميزة. خلال التنمية، وEGL يحتوي المتكاثرة السلائف الحبيبية الخلايا العصبية (الناتج القومي الإجمالي) في حين أن طبقة طبقة الجزيئية والعصبية تحتوي على بيرجمان الدبقية والخلايا العصبية، على التوالي. في عمق المخيخ تكمن المادة البيضاء، والذي يحتوي على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) و oligodendrocytes 1.

القنفذ الصوتي (شش) يلعب دورا حاسما في تنظيم وتطوير المخيخ على وجه الخصوص، أنه يعزز انتشار الناتج القومي الإجمالي عن طريق ملزمة لمستقبله مرقع (PTC)، منظم السلبي للشش يشير 2-4. تفعيل ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تنفيذ استخدام الحيوانات في هذا البروتوكول وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة مركز سرطان رعاية الحيوان واستخدام فوكس تشيس.

1. إعداد الآلات، حلول، وCoverslips

  1. نظيفة مجموعتين من # 5 ملقط غرامة، مجموعة واحدة من رقم 7 ملقط المنحنية الجميلة، واحدة كبيرة مقص جراحي، مقص microdissecting واحدة، ملعقة واحدة وملعقة مثقوبة واحد. وضع الصكوك في الحقيبة التعقيم الختم الذاتي والأوتوكلاف. إبقاء الأدوات في الحقيبة حتى جاهزة للاستخدام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو مبين في الشكل 1A، تم إعداد شرائح من دماغ P4 Math1-GFP / الفئران Nestin-CFP، الذي سيطر على EGL المخيخ من الناتج القومي الإجمالي، معربا عن GFP وإثراء طبقة الجزيئية الخلايا الدبقية CFP إيجابية. لعزل NEPS التي تقع في الجزء العميق من EGL، تم microdissected بين شرائح EGL وطبقة الجزيئية (على طول خط متقطع. الشكل 1A). EGLs تشريح (الشكل 1B) ثم جمعت لتفارق الأنزيمية تليها FACS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة تسليخ مجهري الموصوفة هنا هو الإجراء الأول قادرا على عزل السكان نقية من الخلايا الحية لاستخدامها في التحليلات الجزيئية والوظيفية. كما يتبين من لي وآخرون. 9، NEPS التي حصلت عليها هذه الطريقة يمكن تربيتها ودمجها في التجارب المختلفة وبسبب نقاء عالية، ويمكن أن تستخدم أيضا لتحليل ميكروأري.

من المهم جدا أن تأخذ الوقت لإتقان هذه التقنية مع تسليخ مجهري. وتقع NEPS في المنطقة العميقة من .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر جيمس Oesterling عن التدفق الخلوي المساعدة. وأيد هذا البحث من خلال منحة من المعهد الأمريكي الوطني للسرطان (R01-CA178380، ZY) ومنحة المعاهد الوطنية الأمريكية للتدريب ما بعد الدكتوراه (5T32CA009035-37، LWY).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الوسائط العصبية القاعديةGibco21103-049
PDLMilliporeA-003-E
درجة حرارة انصهار منخفضة فائقة النقاء أغاروزInvitrogen16520-050
DPBSGibco14190144

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
  2. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-11....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cerebellum MicrodissectionExternal Germinal LayerFluorescent Activated Cell SortingNestin Expressing ProgenitorsVibratome SectioningLive Cell IsolationFluorescent Dissecting MicroscopePoly D Lysine CoatingNBB 27 Culture MediaGranule Neuron Precursors

مقالات ذات صلة