يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الحقن في الوريد في الفئران حديثي الولادة

61.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52037

⸱

نوفمبر 11, 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University, 2Center for Gene Therapy, Nationwide Children's Hospital Research Institute, Ohio State University

في هذه المقالة

ملخص

نماذج حيوانية من المرض لدى الأطفال يمكن أن تواجه بداية مبكرة وتطور المرض العدواني. سريريا تقديم العلاج ذات الصلة لنماذج الماوس الشباب يمكن أن يكون صعبا من الناحية الفنية. يصف هذا البروتوكول طريقة الحقن في الوريد غير الغازية عن الفئران حديثي الولادة في غضون شهرين بعد الولادة الأيام الأولى من الحياة.

الملخص

الحقن في الوريد هي الطريقة المعمول بها سريريا لتقديم العلاجات. للقوارض الكبار والحيوانات الكبيرة، والحقن الوريدية هي مجدية تقنيا والروتينية. ومع ذلك، يمكن لبعض نماذج الماوس يكون بداية مبكرة من المرض مع التقدم السريع الذي يجعل إدارة العلاجات المحتملة صعوبة. الوريد الصدغي (أو الوجه) هو مجرد الأمامي لبرعم الأذن لدى الفئران وبشكل واضح للعيان اليومين الأولين بعد الولادة على جانبي الرأس باستخدام مجهر تشريح. خلال هذا الإطار، يمكن حقنه في الوريد الصدغي مع وحدات التخزين ما يصل إلى 50 ميكرولتر. الحقن هو آمن وجيد التحمل من قبل كل من الجراء والسدود. اكتمال إجراء حقن نموذجي في غضون 1-2 دقائق، وبعد ذلك يتم إرجاع الجرو إلى قفص المنزل. في اليوم الثالث بعد الولادة الوريد من الصعب تصور ويصبح إجراء الحقن لا يمكن الاعتماد عليها من الناحية الفنية. وقد استخدمت هذه التقنية لإيصال فيروس الغدة المرتبطة (AAV) vectأملاح الإماهة الفموية، والتي بدورها يمكن أن توفر تقريبا في جميع أنحاء الجسم، ومستقر التعبير التحوير لحياة الحيوان اعتمادا على المصلي الفيروسي الذي تم اختياره.

المقدمة

تقديم العلاجات للجهاز العصبي المركزي (CNS) في نماذج الفئران من أمراض الأطفال ما زال يمثل تحديا. الفئران هذا النموذج الحالات المرضية حديثي الولادة هي الأصغر وغير ناضجة تنمويا، وبالتالي يمكن أن يكون صعبا لحقن مباشرة في الهياكل المناسبة داخل الجهاز العصبي المركزي. الحقن داخل الأوعية الدموية من العوامل العلاجية هو غير الغازية أو أسلوب جيد التحمل لتوصيل الخلايا، والمخدرات، أو ناقلات فيروسية لكامل الجسم بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي وشبكية العين 1-5 3،5-9. المنشورات السابقة تصف الزمانية الوريد حقن الوجه باستخدام نقل transilluminator 10،11، دون مجهر تشريح 11،12، أو التي تتطلب شخصين لحقن 10. تقنية الحقن الموصوفة في هذا البروتوكول هو مفيد لشخص واحد يمكن أن تضخ الجراء، ومصدر الضوء لعرض الوريد الصدغي لا لمس الجرو، مما يلغي الحاجة إلى الشريط الجراحية أو مرفق من الجرو على سطح ثابتمثل نقل transilluminator 11. تسليم الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية المصلي 9 (AAV9) في الفئران ينتج التعبير القوي في الخلايا العصبية والخلايا النجمية في جميع أنحاء الدماغ والحبل الشوكي (الشكل 1). تسليم داخل الأوعية ناقلات فيروسية في الوريد الوجهي الصدغي السطحي قد استخدمت بشكل صحيح في مختلف الدراسات في الفئران حديثي الولادة لعلاج الخلل العصبي العضلي للأطفال ضمور العضلات الشوكي (SMA) 2،4،13،14 وزادت في نهاية المطاف حياة الفئران المعالجة.

الحقن داخل الأوعية الدموية للفئران حديثي الولادة تستهدف أيضا بشكل فعال على الجهاز العصبي المحيطي والأجهزة الطرفية (الشكل 2). بعد حقن AAV، وقد لوحظ تنبيغ العقد الجذرية الظهرية والكبد والقلب والعضلات والهيكل العظمي والرئة، والضفيرة العضلية المعوية للامعاء 1،3،6،7،15. التنبيغ واسع النطاق للجهاز العصبي المركزي ومحيط يجعل هذه الطريقة من الحقن مثالية للأمراض التي تتطلب التعبير العالميالتحوير، مثل مرض 16 وغيرها من أمراض التخزين الليزوزومية غوشر 17،18، مرض باتن وlipofuscinoses سيرويد الخلايا العصبية ذات الصلة، 19 ومتلازمة بارديه-بيدل، وهو اضطراب وراثي المتعددة للمع ظهور الأعراض التي تحدث في مرحلة الطفولة المبكرة (20). وينبغي أيضا النظر الحقن داخل الأوعية الدموية في الفئران حديثي الولادة كوسيلة رواية النمذجة أمراض الأطفال على نطاق المنظومة. وقد ترجمت هذه التقنية لنماذج حيوانية أكبر 5،21، والحقن داخل الأوعية موجود بالفعل كوسيلة مقبولة سريريا لتقديم العلاجات.

يصف البروتوكول الحالي وسيلة بسيطة وفعالة لتقديم وكلاء لالفئران حديثي الولادة عن طريق الوريد الصدغي السطحي وجه في موعد أقصاه يوم بعد الولادة 2. حقن يمكن أن يتم الانتهاء من واحدة، يمارس الفرد وجيد التحمل من قبل كل من الجراء والسدود. الجراء تجربة الحد الأدنى من الشدة والتعافي بسرعة. الاهميهTLY، وحقن الناجح يؤدي إلى تسليم العالمي للعامل تدار. هذا البروتوكول هو المناسب لتسليم ناقلات فيروسية، وكلاء الصيدلانية أو خلايا الفئران حديثي الولادة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الواردة في بروتوكول معهد للاستخدام الحيواني والعناية جنة (IACUC) من جامعة ولاية أوهايو.

1. إعداد مساحة العمل

  1. جمع الجليد الرطب لتخدير الجراء الماوس، قفص فارغ للفصل بين السد من القمامة، ومجهر تشريح، مصدر الضوء الذي يمكن وضعه في زاوية لحقن (استخدام مصدر الضوء في 90 °   زاوية لتحجب موقع الحقن في الوريد)، سطح نظيف لوضع الحيوان للحقن، ومسحات القطن، 10/03 سم مكعب حقنة الأنسولين مع 3/8 "30 G إبرة (واحد لكل حيوان) و 1٪ ايفانز الأزرق صبغ ( مصنوعة من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)) حل للتدريب.
  2. إزالة السد إلى قفص منفصل بينما التلاعب الجراء.

2. إجراء حقن

  1. وضع الجرو واحد مباشرة على الجليد الرطب لمدة 30-60 ثانية لتخدير الحيوان. لا تترك رانه حيوان على الجليد فترة طويلة جدا بسبب خطر حدوث مضاعفات انخفاض حرارة الجسم ذات الصلة بما في ذلك الرجفان البطيني، نقص الأكسجة الأنسجة والحماض الأيضي.
    ملاحظة: تجربتنا هو أن 30-60 ثانية كافية لإبطاء الحركات الجرو للسماح للحقن. إذا كان مطلوبا التخدير أعمق، المستنشقات مثل 1-2٪ الأيزوفلورين قد يكون مناسبا.
  2. في حين أن الحيوان هو على الجليد، تحميل المحاقن مع 30 ميكرولتر من ايفانز صبغة زرقاء.
  3. عندما يتم تخدير الحيوان بالكامل، والتي أكدتها قلة الحركة على الجليد في حين لا يزال يتنفس، نقله تحت المجهر. لحقن يمنى، تواجه كمامة الحيوان إلى اليمين. وضع السبابة اليسار على كمامة وترك الذيلية الاصبع الوسطى إلى الأذن برعم بحيث برعم الأذن بين السبابة والوسطى (الشكل 1).
  4. دراسة فقط الأمامي لبرعم الأذن لسطحية الشعرية التي تتحرك عندما يتم التلاعب الجلد. هذه الشعرية ليس هو الهدف، ولكنتحديد مهم لتحديد الوريد الصدغي. المقبل، وتحديد مكان مظلم، غامض أدنى من الوريد الشعرية التي تظل ثابتة بغض النظر عن الموقف الجلد. يظهر الوريد الصدغي غامضة، يعمل على ظهري بطني، ويغذي في الوريد الوداجي (الشكل 1).
  5. أدخل الوريد الصدغي مع الإبرة شطبة تصل. في حالة إدخالها بشكل صحيح، فمن الممكن لعرض شطبة إبرة ملء مع الدم من خلال الجلد. ثم تضغط على المكبس ببطء ومذكرة ابيضاض الوريد أسفل الجانب من وجهه.
  6. السماح الإبرة بالبقاء داخل الوريد لمدة 10-15 ثانية مضافة لمنع ارتجاعي من injectant.

3. بعد الحقن

  1. بعد الحقن السليم، يجب أن الجرو تتحول الأزرق على الفور تقريبا. إزالة الإبرة واستخدام القوة لطيف لتطبيق مسحة القطن إلى موقع الحقن حتى تجلط الدم.
  2. مراقبة الجرو لعلامات الضيق. السماح الجرو 2-3 دقائق لاستعادة وrewarm، صecognize عندما الجرو هو واعية، وتستقيم وتتحرك، قبل أن يعود إلى القفص. فنجان الجراء في أيدي القفاز المحقق لتوفير الدفء المناسب للمساعدة في التعافي إذا لزم الأمر. بدلا من ذلك، وضع وسادة التدفئة تحت القفص المنزل لتسهيل ارتفاع درجة حرارة الجرو حقن. عموما بعد حقن صبغة زرقاء ايفانز، الموت ببطء الجراء. لا تشمل صبغة عند حقن مادة الاختبار.
  3. وضع الجرو مرة أخرى في قفص المنزل وضمان المغلفة الجرو مع الفراش و / أو nestlet لضمان reacceptance من قبل السد.
  4. استخدام حقنة جديدة والقطن المسحة لكل الجرو للحفاظ على العقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

خلال حقن الصحيح، ينبغي أن تتحول الوريد للحظات واضح، أو بلانش. إذا حقن صبغ الجرو كله يجب أن يتحول الأزرق في غضون ثوان. إذا حدث حقنة غير لائق، غالبا ما يكون هناك بلعة تحت الجلد تتركز في الرأس أو الرقبة وinjectant قد يتسرب من موقع الحقن. قد ينتج عن الحقن غير لائقة أيضا في ظهور كدمات في جميع أنحاء الحلق. الجراء التي تتلقى الحقن تحت الجلد (أي لم يتم تسليم الحقن في الوريد تماما) عموما تجربة أي آثار جانبية سيئة وتستجيب عادة للعلاج كما تفعل الفئران المحقونة بشكل صحيح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تسليم داخل الأوعية الدموية وكلاء لالجهاز العصبي المركزي أو في جميع أنحاء الجسم أمر صعب في نماذج الفئران حديثي الولادة من الأمراض. بروتوكول صفها هو، طريقة سريعة نسبيا غير الغازية لإدارة حلول عن طريق الوريد في الفئران حديثي الولادة مع متطلبات الحد الأدنى من المعدات. على الرغم من مواجهة الوريد الصدغي يمكن أن ينظر إليها بالعين المجردة، قد يكون حقن مزيد من الدقة باستخدام المجهر والألياف البصرية مصدر الضوء، وخاصة لحاقن unpracticed. الحقن داخل الأوعية الدموية في الفئران حديثي الولادة لدي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

الكتاب نود أن نعترف NINDS، FightSMA، وأسر SMA للدعم المالي. ويدعم سيجل من خلال التدريب NINDS منحة # 5T32NS077984-02.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حقنة الأنسولين ThinproTerumoSS30M30093/10 سم مكعب ، إبرة 3/8 بوصة ، 30 جم ، 1 لكل فأر
صبغة إيفانز الزرقاءSigma-AldrichE2129تمييع إلى 1٪ مع 1x فوسفات
مخزن من القطن الملحي قضيبفيشر Scientific23-400-101
مصدر ضوء الأليافالبصرية فيشر Scientific12-562-36
تشريح مجهر
مخزن

المراجع

  1. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
  2. Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
  3. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
  4. Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
  5. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
  6. Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
  7. Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
  8. Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
  9. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  10. Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
  11. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
  12. Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
  13. Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
  14. Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
  15. Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
  16. Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
  17. Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
  18. Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
  19. Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
  20. Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
  21. Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
  22. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
  23. Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
  24. Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

AAV GFP
الحقن في الوريد في الفئران حديثي الولادة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.