مقالة منهجية

التعبير عن البروتينات الفلورية في السهيم من جانب مرنا حقن البويضات غير المخصبة في

10.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52042

⸱

يناير 12, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Département de Biologie du Développement et Cellules Souches, Institut Pasteur, 2Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer (UMR7009 CNRS/UPMC Univ Paris 06), Sorbonne Universités, 3Equipe Epigenetic Control of Normal and Pathological Hematopoiesis, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, 4Unité de Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR5235/DAA/cc107/Université Montpellier II, 5Plateforme BioEmergences IBiSA FBI, CNRS-NED, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard

في هذه المقالة

ملخص

نحن التقرير هنا التعبير القوي والفعال للالبروتينات الفلورية بعد حقن مرنا في البويضات غير المخصبة من السهيم. فإن تطوير تقنية حقن مكروي في هذا حبلي القاعدية يمهد الطريق لبعيدة المدى الابتكارات التقنية في هذا النظام النموذجي الناشئة، بما في ذلك في مجال التصوير فيفو والتلاعب الجينات المحددة.

الملخص

نبلغ هنا عن بروتوكول قوي وفعال للتعبير عن البروتينات الفلورية بعد حقن mRNA في البويضات غير المخصبة من cephalochordate amphioxus ، Branchiostoma lanceolatum. نحن نستخدم تركيبات mCherry و eGFP المستهدفة بالغشاء والنووية التي تم تعديلها لاستيعاب استخدام كودون البرمائية وتسلسلات إجماع Kozak. نصف نوع إبر الحقن التي سيتم استخدامها ، وبروتوكول الشلل للبويضات غير المخصبة ، وإعداد الحقن الشامل. تولد هذه التقنية أجنة مصنفة بالفلورسنت ، حيث يمكن تحليل ديناميكيات سلوكيات الخلية أثناء التطور المبكر باستخدام أحدث استراتيجيات التصوير في الجسم الحي. سيسمح تطوير تقنية الحقن المجهري في هذا النوع من البرمائيات بإجراء تحليلات تصوير حية لسلوكيات الخلايا في الجنين بالإضافة إلى التلاعب الخاص بالجينات ، بما في ذلك الإفراط في التعبير الجيني والضربة القاضية. إجمالا ، سيعمل هذا البروتوكول على تعزيز مضخم الحبل القاعدي كنموذج حيواني لمعالجة الأسئلة المتعلقة بآليات التطور الجنيني ، والأهم من ذلك ، تطورها.

المقدمة

خلال التنمية، خلية واحدة يثير كائن حي كامل في عملية معقدة للغاية التي تنطوي على كل من الانقسامات والحركات الخلية. من أجل فهم أفضل للمبادئ البيولوجية الكامنة وراء ديناميات سلوك الخلية، والتي علماء البيولوجيا التطورية، لاستخدامها في تقنيات التصوير المجراة على أساس مضان. مقصورات محددة من الخلايا، مثل أغشية الخلايا، يمكن أن تكون إما وصفت من قبل العلاج مع الأصباغ الفلورية، وهو نهج يعوقها عدم وجود خصوصية واختراق الأنسجة 1، أو من خلال إدخال محدد في جنين من mRNAs الخارجية ترميز البروتينات الفلورية 2. تقنيات مختلفة يمكن استخدامها لإيصال الفعال للمركبات خارجية، مثل من mRNAs. وتشمل هذه، ولكن ليس على سبيل الحصر، حقن مكروي، Electroporation للوالقصف مع المجهرية الدقيقة، lipofection والتنبيغ 3،4. على الرغم من كل هذه الأساليب يمكن أن تستخدم لإدخال مركبات خارجية إلىوضع الجنين، حقن مكروي فقط يسمح تطبيق كميات محددة سلفا ودقيقة في كل خلية 3. وقد وصفت تقنيات Microinjection لجميع أنظمة النموذج التنموي الكبرى 4 (على سبيل المثال، ذباب الفاكهة والديدان الخيطية، الزرد، والضفادع، والفئران)، وكذلك لبعض نماذج بديلة 4، بما في ذلك تلك المستخدمة في الدراسات المقارنة التي تهدف إلى فهم تطور آليات التنموية (على سبيل المثال، شقائق البحر والديدان الحلقيات قنافذ البحر، الزقيات ascidian، والحسيكة رأس حبليات).

Cephalochordates، الذي جنبا إلى جنب مع الزقيات والفقاريات إنشاء بعائلة حبلي، بشكل خاص نماذج مناسبة تماما لدراسة تطور الحبليات وتنويع الفقاريات من سلف اللافقاريات 5-8. نسب رأس حبليات تباينت في وقت مبكر جدا أثناء التطور حبلي. وcephalochordates موجودة، والتي تنقسم إلى ثلاثة أجناس (النخالةchiostoma، Asymmetron وEpigonichthys)، تشبه الفقاريات سواء من حيث التشريح العام والهندسة المعمارية الجينوم 5-8. من حوالي 30 نوعا من cephalochordates التي تم وصفها حتى الآن، خمسة المتاحة للدراسات الجنينى والتنموية 6،9: Asymmetron lucayanum (والرميح حيوان باهاما)، الحسيكة floridae (والحسيكة فلوريدا)، السهيم (والحسيكة الأوروبية)، الحسيكة belcheri (والحسيكة الصينية) والحسيكة البلهارسيات اليابانية (للالحسيكة اليابانية). الكبار قد حان لثلاثة من هذه الأنواع (B. السنانية، B. belcheri وB. البلهارسيات اليابانية) يمكن أن يتسبب لتفرخ على الطلب خلال موسم التكاثر 10،11. وبالإضافة إلى ذلك، على الأقل بالنسبة B. السنانية، وضع البيض كفاءة ويمكن أيضا أن يتسبب في مياه البحر الاصطناعي 12، مما يجعل هذا النوع رأس حبليات معينة يمكن الوصول إليها عن المختبرالمنشأ التي ليس لديها إمكانية الوصول إلى مياه البحر الطبيعي. الجمع، في B. السنانية، لسهولة الوصول وموثوق بها إلى الأجنة مع طريقة التسليم كفاءة، مثل حقن مكروي، حتى الآن هذه التقنية تسليم الوحيدة المتقدمة في الحسيكة (في كل B. floridae وB. belcheri) 13-15، سيمكن من تطوير جناح رواية تقنيات التلاعب، بما في ذلك tracing- النسب والنهج القائم على سلوك الخلية الحيوية.

بروتوكول للحقن مكروي كفاءة من mRNAs للتعبير عن البروتينات الفلورية في B. وبالتالي وضعت السنانية الجنين. وعلاوة على ذلك، لتوفير مجموعة أدوات أساسية للتصوير حي لB. الأجنة السنانية، تم تطوير أنظمة النواقل التي تسمح المرتبط الغشاء والتعبير النووي من البروتينات الفلورية. لاستهداف الغشاء، وتنصهر تعزيز الأخضر البروتين الفلوري (EGFP) إلى HRAS مربع CAAX البشري وتوطين النووية من mCherry وEGFP كانالتي حصلت عليها الانصهار إلى الزرد هيستون 2B (H2B) اكسون (الشكل 1، الملف التكميلي 1). وعلاوة على ذلك، وذلك بهدف تحسين الترجمة البروتين، تم تعديل تسلسل كوزاك وكودونات من يبني وتكييفها مع الاستخدام في B. السنانية. أخذت معا، فإن طريقة الحقن والتعبير ناقلات المقدمة هنا بمثابة الأساس لجيل من النهج التجريبية الجديدة للcephalochordates، ولا سيما التحليلات باستخدام المستندة إلى مضان أحدث تقنيات التصوير في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد أدوات والكواشف

  1. نقل الماصات باستور
    1. توليد سلسلة من الماصات نقل باستور بأقطار مختلفة غيض من خلال سحب 230 ملم الماصات باستور طويلة فوق لهب بسرعات مختلفة. تأكد من أن تفتق طويل ممكن، من أجل السيطرة على نحو سلس وغرامة من الطموح.
    2. مع الكاتب الماس، وخدش ماصة على طول خط عمودي على طول ماصة. بكلتا يديه، وسحب بالتوازي ماصة لطوله لتوليد قطع حادة. بسرعة اللهب البولندية ماصة دون ختم الحافة.
    3. تختلف القطر من طرف مع مرحلة البويضات / الأجنة إلى أن pipetted: 300-400 ميكرون لالبويضات غير المخصبة (حوالي 150 ميكرون في القطر)، 600 ميكرون لالبويضات المخصبة (حوالي 500 ميكرون في القطر)، 200-400 ميكرون لneurulae تحاك. استخدام ماصات مع أنبوب الطموح الذي يرصده الفم لنقل البويضات / الأجنة من طبق واحدإلى آخر.
  2. الإبر حقن
    1. التلاعب في الشعيرات الدموية مع قفازات لضمان ظروف خالية من ريبونوكلياز. استخدام الزجاج البورسليكات مع خيوط الشعيرات الدموية مع أبعاد OD 1.20 ملم، ID 0.94 ملم، وطول 10 مم.
    2. إذا تم سحب الشعيرات الدموية على نوع من التدفئة خيوط إبرة مجتذب موضح في قائمة المواد، استخدام الإعدادات التالية: حرارة 600، سحب 50، سرعة 80، الوقت 60، الضغط 200 أو 300. وإلا، تأكد من أن الشكل، الذي هو حاسمة لحقن ناجحة، كما هو مبين في الشكل رقم 2 مع الخصائص التالية: 4-8 ميكرون قطر الحافة الخارجي، 2 سم طول تفتق.
      ملاحظة: يمكن سحب الإبر قبل موسم وضع البيض وتستخدم طوال الموسم.
  3. 5٪ محلول المخزون الفينول الأحمر (4X)
    1. إعداد جديدة قبل كل موسم وضع البيض.
    2. في أنبوب 0.22 ميكرون الترشيح، وتزن من 25 ملغ من الفينول مسحوق أحمر.
    3. إضافة 0.5 مل من DNase- وريبونوكلياز خالية من المياه لالأنبوب الذي يحتوي على مسحوق.
    4. تدور لمدة 3-5 دقائق عند 18،000 x ج في درجة حرارة الغرفة لتصفية تعقيم الحل وإزالة البلورات التي يمكن أن تسد إبرة الحقن.
    5. تخزينها في 4 ° C أو تخزين 250 مكل في -20 ° C.
  4. 0.25 ملغ حل بولي يسين / مل
    1. إعداد جديدة قبل كل موسم وضع البيض.
    2. حل 5 ملغ من بولي-L-يسين في 20 مل من الماء المقطر. مخزن 5 مل aliquots في -20 ° C.
    3. استخدام قسامة مطلق فورا ومرة ​​واحدة فقط لضمان التصاق استنساخه وقوية من البويضات إلى الطبق المغلفة بولي يسين.
  5. التوليف مرنا
    1. إعداد جديدة قبل كل موسم وضع البيض.
    2. خطي 5 ميكروغرام من الحمض النووي في المصالح مع انزيم الكافي (عادة لمدة 2 ساعة، عند 37 درجة مئوية). للتحقق من اكتمال عملية الهضم، تشغيل 2٪ في حجم المزيج الهضم على 1٪ الاغاروز-TBE هلام العازلة في TBE في 150 W لمدة 20 دقيقة.
    3. استخراج الخطDNA rized بين 25: 24: 1 الفينول (درجة الحموضة 8.0): الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي. دوامة لمدة 20 ثانية، الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج وجمع (العليا) المرحلة المائية.
    4. استخراج المرحلة المائية ثانية مع 24: 1 الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي. دوامة لمدة 20 ثانية، الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج وجمع المرحلة المائية.
    5. ترسيب الحمض النووي خطي مع 100: 10: 300 DNA خطي: ​​3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2): الإيثانول بنسبة 100٪ بين عشية وضحاها في -20 ° C.
    6. الطرد المركزي 20 دقيقة في 18،000 x ج في 4 درجات مئوية. شطف في 70٪ من الإيثانول.
    7. الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج في 4 درجات مئوية. اسمحوا الجافة وresuspend في ريبونوكلياز خالية من المياه في تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
    8. نسخ 1 ميكروغرام من الحمض النووي خطي باستخدام عدة التوليف مرنا مع البلمرة المناسب، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    9. استخراج مرنا مع 5: 1 الفينول (درجة الحموضة 4.7): الكلوروفورم وخلات الأمونيوم الحل محطة وقدمت مع عدة.
    10. دوامة لمدة 20 ثانية، ومntrifuge 10 دقيقة في 18،000 x ج وجمع المرحلة المائية.
    11. استخراج المرحلة المائية ثانية مع 24: 1 الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي. دوامة لمدة 20 ثانية، الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج وجمع المرحلة المائية.
    12. ترسيب مرنا مع 100٪ الأيزوبروبانول بين عشية وضحاها في -20 ° C.
    13. الطرد المركزي 20 دقيقة في 18،000 x ج في 4 درجات مئوية. شطف في 80٪ من الإيثانول.
    14. الطرد المركزي 10 دقيقة في 18،000 x ج في 4 درجات مئوية. السماح للبيليه الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد 5-10 دقيقة لأنها سوف تكون بعد ذلك من الصعب ل resuspend. resuspend في DNase- وريبونوكلياز خالية من المياه إلى التركيز النهائي لا يقل عن 2 ميكروغرام / ميكرولتر لضمان تركيز مرنا النهائي لائق في مزيج الحقن.
    15. للتحقق من الجودة وحجم المنتج النسخ، وتشغيل 0.5 ميكرولتر من مرنا على 1٪ الاغاروز-TBE هلام خالية من ريبونوكلياز العازلة في TBE في 150 W لمدة 20 دقيقة. متجر 2 مكل في -80 ° C.
  6. أطباق المغلفة بولي يسين-
    ملاحظة: بولي يسين الصوتستخدم أطباق تيد لشل حركة البويضات أثناء الحقن.
    1. لكل 35 مم خلية ثقافة طبق بتري (5 في المجموع)، وتغطي الجزء السفلي من طبق بيتري مع 1 مل من 0.25 ملغ / مل حل بولي يسين إذابة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. لكل 35 مم خلية ثقافة طبق بتري (5 في المجموع)، ونقل 0.25 ملغ / مل حل بولي يسين إلى 35 مم خلية ثقافة طبق بتري آخر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. تجاهل 0.25 ملغ / مل حل بولي يسين.
    4. السماح للأطباق بتري الجاف، رأسا على عقب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    5. تخزين الأطباق المغلفة بولي يسين ملفوفة في غلاف بلاستيكي في 4 درجات مئوية لتجنب التلوث لأقصى مدة أسبوع واحد.
  7. أطباق المغلفة الاغاروز
    ملاحظة: يتم استخدامها لثقافة حقن الأجنة. يوفر الاغاروز وسادة للأجنة حقن ويمنعها من الالتصاق إلى أسفل الطبق.
    1. جعل مياه البحر الاصطناعي (ASW) باستخدام 37-38 ز / L بالاتصالاتالأملاح ercial + 0.25 ملي NaHCO 3 في المياه بالتناضح العكسي.
    2. حل الاغاروز إلى تركيز 1٪ في 0.22 ASW تصفيتها ميكرون عن طريق تسخين الحل في الميكروويف.
    3. صب بسرعة الحل الاغاروز حارا من واحد 35 مم طبق بتري إلى واحد آخر من أجل ضمان طلاء الاغاروز رقيقة جدا من الطبق.
    4. تخزين الأطباق المغلفة الاغاروز ملفوفة في التفاف ساران في 4 درجات مئوية لتجنب التلوث لأقصى مدة أسبوع واحد.
  8. مزيج الحقن وتحميل الإبر حقن
    1. حوالي 2 ساعة قبل بدء الحقن، وجعل مزيج حقن 2 ميكرولتر في RNase- والمياه خالية من الدناز مع تركيزات النهائي من 1-1،8 ميكروغرام / ميكرولتر من مرنا، و 15٪ الجلسرين، 1.25٪ الفينول الأحمر.
      ملاحظة: الألوان الفينول الأحمر الحل، والذي يسمح رصد كفاءة الحقن وتحديد الأجنة المحقونة بنجاح. الجلسرين تفضل مرنا نشر داخل البويضة.
    2. الطرد المركزي 4 دقائق عند 18،000 x ج لبلورات بيليه. الحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
    3. مع ماصة 10 ميكرولتر، وجمع 0.5 ميكرولتر من مزيج الحقن، وتجنب أسفل الأنبوب، حيث تم مكعبات البلورات.
    4. الردم اثنين على الاقل من الإبر حقن (في حالة فواصل واحدة خلال حقن) من قبل pipetting انخفاض 0.5 ميكرولتر من حقن مزيج في افتتاح كبير من الإبرة.
    5. تثبيت الإبر في وعاء تخزين مع السائل في الجزء السفلي في 4 درجات مئوية لمنع التبخر من مزيج الحقن. السماح للمزيج حقن السفر ببطء إلى غيض من إبرة الحقن لا يقل عن 1 ساعة لتقليل خلق فقاعات.
    6. متجر مزيج حقن إضافية في -80 درجة مئوية لمدة أقصاها ثلاثة استخدامات إضافية، وبعد ذلك تدهور نوعية مرنا (لا تظهر البيانات).

2. جمع المواد البيولوجية، حقن مكروي والثقافة الأجنة

  1. البويضة والحيوانات المنوية جمع
    ملاحظة: انظر Theodosiouوآخرون. (12) لبروتوكول مفصلة لإحداث التبويض وجمع الأمشاج.
    1. الذكور والإناث في صدمة مضادة للغواصات في 23 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    2. واحدة إلى ساعتين قبل غروب الشمس، ونقل البالغين في أكواب فردية في ASW في 19 ° C لأن معظم البالغين سوف تفرخ 1-2 ساعة بعد غروب الشمس.
    3. شطف 35 مم أطباق بتري في ASW تصفيتها والسماح لهم الجافة رأسا على عقب لمنع البويضات من الالتصاق إلى أسفل الطبق.
    4. على وضع البيض، وجمع الحيوانات المنوية والبويضات على الفور مع ماصة 1،000 ميكرولتر.
      1. إبقاء الحيوانات المنوية والبويضات منفصلة عن الحسيكة الكبار لأن الاتصال هو ضار للصحة الأمشاج (لا تظهر البيانات).
      2. وعلاوة على ذلك، وتجنب مذهلة من البالغين و الذي يؤدي إلى الحركات التي تبدد، وبالتالي تمييع، سواء الحيوانات المنوية والبويضات. للحفاظ على الحيوانات المنوية النشطة لأطول فترة ممكنة وتحسين معدل الإخصاب، وجمع الحيوانات المنوية كما تتركز ممكن.
    5. احتفظالحيوانات المنوية على الجليد في أنبوب 1.5 مل.
    6. نقل البويضات في تصفيتها ASW إلى 35 مم أطباق تشطف قبل بيتري.
    7. نقل 100-500 البويضات مع سبق سحبت 300-400 ميكرون نقل ماصة باستير إلى 35 مم طبق بتري آخر لإجراء الحقن.
    8. تسميد تبقى من مخلب كعنصر تحكم عن الحيوانات المنوية ونوعية بويضة أو لتجارب أخرى.
  2. حقن بويضة
    1. تثبيت إبرة الحقن على مياداة مجهرية عند 50 درجة زاوية قريب إلى المستوى الأفقي.
      ملاحظة: سوف الزوايا أقل من 50 درجة تدفع البويضات حول على طبق، في حين أن زوايا أكثر من 50 درجة لا تسمح للرصد الملائم للموقف إبرة نسبة إلى البويضة.
    2. تحت نطاق الفلورسنت تشريح مع 25X oculars، ونقل 30 البويضات مع 300-400 ميكرون نقل ماصة باستير على طبق المغلفة بولي يسين التي تحتوي على تصفيتها ASW.
    3. إيداع البويضات على طول خط لنقلالحقن خارج بطريقة مرتبة وللتمييز حقن البويضات من غير حقنه. ضخ أعداد صغيرة (30 البويضات) لتقليل الوقت تعرض البويضات لبولي، ليسين، والتي تميل إلى تشوه الأجنة النامية (لا تظهر البيانات).
    4. استخدام الإضاءة الحقل المظلمة لتقديم البويضات كما شفافة قدر الإمكان.
    5. مع مقبض حركة الخشنة من مياداة مجهرية، وجلب إبرة الحقن قريبة من بويضة.
    6. مع ملقط غرامة، وقطع فتح إبرة على مستوى حيث يبدأ تلميح إلى أن منحني. بواسطة النبض مع حاقن، تحقق من مزيج حقن الأحمر يتدفق في الواقع للخروج من الإبرة.
    7. في 200X التكبير ومع مقبض حركة غرامة من مياداة مجهرية، نقل بلطف إبرة الحقن داخل نواة البويضة.
      ملاحظة: في حالة إدخالها بشكل سطحي جدا، لن يبقى الحل حقنه داخل البويضة. في حالة إدخالها بعيدا جدا، وسيتم تدمير البويضة.
    8. حقن مع 1-3 نبضات من 120 درة ميللي ثانيةأيون والضغط 1-10 رطل. إذا كانت إبرة على ما يرام بما فيه الكفاية، حقن مع التدفق المستمر في الضغط المستمر. تأكد من أن حجم الحقن يتوافق مع 1/5 إلى 1/3 من حجم بويضة واحدة.
    9. بعد الحقن، وسحب الإبرة خارج بسرعة لتجنب تسرب البويضة.
    10. تحقق من أن حل حقن يبقى داخل البويضة وذلك بعد قليل من ثانية، فإن الحل حقن ينتشر في جميع أنحاء بويضة.
    11. الانتقال إلى البويضة في الخط القادم.
    12. الابقاء على بعض الأجنة uninjected كل سلسلة كما سيطرة سلبية لتقدير مضان الخلفية عند مسح لحقن الأجنة.
  3. الإخصاب، واختيار الأجنة المحقونة والثقافة الجنين
    1. إخصاب البويضات في أقرب وقت تم حقن سلسلة. حيث تنخفض جودة البويضة مع مرور الوقت، وحقن تخصيب البويضات في حدود 1 ساعة بعد وضع البيض 12.
    2. اعتمادا على تركيز الحيوانات المنوية، إضافة 1-5 قطرات من الحيوانات المنوية إلى البويضات ودوامة الطبق.
      ملاحظة: يجب أن تصبح المغلف الإخصاب واضح على الأجنة بعد حوالي 1 دقيقة.
    3. السماح للأجنة لفصل من الطبق المغلفة بولي، ليسين، في حين حقن سلسلة أخرى من البويضات.
    4. نقل الأجنة مع ميكرون نقل ماصة باستير 600 إلى طبق بتري المغلفة الاغاروز. إزالة الأجنة من الطبق المغلفة بولي يسين في أقرب وقت ممكن، إذا كان ذلك ممكنا قبل مرحلة 2-الخلية.
      ملاحظة: في حالة التعرض لفترات طويلة للبولي يسين، الأجنة تميل الى ان تصبح الأريمات المزدحمة بالسكان، بالارض على الجانب لمس قاع الطبق.
    5. في 2-الخلية إلى 4 خلايا المرحلة، حدد مع نطاق الفلورسنت تشريح مع فلتر DSR الأجنة حقن بنجاح، أي تلك مع التشكل الطبيعي أن تظهر حمراء إشارة الفلورسنت الفينول الأحمر مشتقة.
    6. الحفاظ على الأجنة في الثقافة في تصفيتها ASW في أطباق بتري المغلفة الاغاروز في 19 ° C حتى المرحلة المرغوبة لفي مجال التصوير فيفو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بروتوكول المفصلة أعلاه يوفر الأساس لMicroinjection من B. البويضات السنانية، وبالتالي لإدخال في تطوير B. الأجنة السنانية مرنا ترميز البروتينات الفلورية للتصوير في الجسم الحي. على الرغم من أن الأسلوب هو قوية وموثوق بها بالتأكيد، فإن معدل الحقن ناجحة باستخدام هذا البروتوكول يبقى متغير (الجدول 1). التفسير المحتمل جدا لهذه الحقيقة مثيرة للاهتمام هو التباين الشديد من براثن بويضة: البيضة دفعات مختلفة لا بل تتصرف بشكل مختلف جدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه المقالة، نقدم، لأول مرة، بروتوكول مفصلة وقابلة للتكرار لحقن B. البويضات السنانية، والتي، بعد B. floridae 13،14 وB. belcheri 15، وبالتالي الأنواع الحسيكة الثالثة، والتي وصفت هذه التقنية. الأهم من ذلك، وصف بروتوكول هنا يشمل أيضا وصفا للأنظمة ناقلات مناسبة لإنتاج البروتينات الفلورية في B. السنانية من مرنا حقن المنتجة في المختبر (موضح أدناه). معا، وهذه الأدوات الجديدة تسمح في التصوير المجرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أنوه بالدعم من قبل "Animalerie المركزية دي الصورة المتحركة سور ايفيت" لتربية الحيوانات. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من ANR (ANR-09-بلان-0262-02 وANR-11-JSV2-002-01) لمايكل شوبرت، من خلال منحة الاتحاد الأوروبي FP6 "Embryomics" ومنحة ANR "ANR- 10-بلان-121801 ديف عملية "لجان فرانسوا نيكولا ونادين Peyriéras. ويتم تمويل جواو ايمانويل كارفاليو من قبل زمالة الدكتوراه FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

طلبات ناقلات الموصوفة هنا يمكن معالجتها مباشرة إلى المؤلفين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
consumables< / strong>
35 mm Petri أطباقFalcon353001وحدة
الترشيح المعالجة بالثقافة (Stericup 1 L)FisherW217190.22 & # 956; م
أنابيب Spin-XCostar81600.22 &# 956 ؛ م
جرة تخزين إبرة للشعيرات الدموية بقطر 1.2 ممWPIE212
ماصاتبطول 230 مم
أنبوب الشفطDutscher75056
الشعيرات الدموية لإبر الحقنSutterBF 120-94-10زجاج البورسليكات مع خيوط ، OD 1.20 مم ، معرف 0.94 مم ، طول 10 مم
<قوي > كواشف < / قوي>
الاغاروز منخفض الذوبانSigmaA9414
الفينول الأحمرسيجما114537
الجلسرينسيجماG2025
بولي إل ليسين هيدروبروميدسيجماP9155
H2< / sub>O ، DNase / RNase خاليةمن Gibco10977-035
mMessage mMachine SP6 طقمالنسخAM1340mRNA
Phenol pH 8SigmaP4557
24: 1 الكلوروفورم: كحول متساوي أميليكSigmaC0549
5: 1 الفينول الرقم الهيدروجيني 4.7: الكلوروفورمSigmaP1944
أملاح كريستال الشعاب المرجانية (200 كجم)Europrix & nbsp ؛الأملاح التجارية
NaHCO3< / sub>SigmaS6014
<قوي>المعدات< / قوي>
تشريح الفلورسنت مع تكبير 200XLeicaMZ16F25X ، مرشحات DSR و GFP2
MicromanipulatorMarzhauzerM-33
حاقنPicospritzerنموذج II أو III
مجتذب إبرةSutterP97مجتذب إبرة خيوط التسخين
ملقط دقيقأدوات العلوم الدقيقة GmbH11252-30Dumont # 5
باستور مجموعة توليف Ambion نطاق

المراجع

  1. Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
  3. Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
  4. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841(2014).
  5. Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
  6. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  7. Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
  8. Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
  9. Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  10. Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
  11. Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461(2013).
  12. Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
  13. Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
  14. Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
  15. Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
  16. Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
  17. Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
  18. Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
  21. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292(2000).
  22. Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
  23. Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
  24. Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
  25. Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
  26. Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
  27. Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
  28. Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
  29. Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
  30. Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
  31. Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
  32. Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599(1371).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة