تصور الإيماس غير التحللي من الأدعومية المستخفية من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Summary

نحن تصف كيفية تصور macrophage- C. الأدعومية (CN) التفاعل في الوقت الحقيقي، مع التركيز بوجه خاص على عملية إيماس غير التحللي باستخدام المجهر الضوئي الرقمي. باستخدام هذه التقنية بشكل فردي الضامة المصابة يمكن دراستها للتأكد مختلف جوانب هذه الظاهرة.

Abstract

العديد من إصابة الضامة بواسطة الأدعومية المستخفية جوانب تم دراستها على نطاق واسع واضحة المعالم. ومع ذلك، واحدة تفاعل معين ليست مفهومة بشكل واضح هو إيماس غير التحللي. في هذه العملية، يتم الإفراج خلايا الخميرة في الفضاء خارج الخلية من خلال آلية غير مفهومة أن يترك كل من البلاعم و CN قابلة للحياة. هنا، نحن تصف كيفية متابعة عدد كبير من الضامة المصابة بشكل فردي لفترة العدوى 24 ساعة بواسطة المجهر-ساقطا الوقت. ويعيش الضامة المصابة في غرفة التدفئة مع جو CO ₂ تعلق على المجهر التي توفر نفس الشروط حاضنة خلية ثقافة. يمكن المجهر الرقمي الحي تقديم معلومات عن التفاعلات الدينامية بين المضيف والممرض الذي لا يتوفر من الصور الثابتة. القدرة على تصور كل خلية مصابة يمكن أن توفر أدلة حول كيفية التعامل مع الضامة الالتهابات الفطرية، والعكس بالعكس. هذا ط تقنيةسا أداة قوية في دراسة القوى المحركة التي تقف وراء ظاهرة معقدة.

Introduction

مراحل العدوى الفطرية بين الخلايا الضامة بالمستخفيات وموثقة جيدا ^1-3. بعد أن يتم تناولها من قبل خلايا الخميرة الضامة، قد تحدث مجموعة متنوعة من التفاعلات: لبلعم قد ليز الإفراج عن حمولتها الفطرية في الفضاء خارج الخلية، أو أنها يمكن السيطرة على العدوى عن طريق الحفاظ على خلايا الخميرة في كنف الغشاء الخلوي لها ^4. ومع ذلك، منذ عدة سنوات وقد وصفت نتائج جديدة بشكل مستقل من قبل مجموعتين: إيماس غير التحللي، وهي العملية التي والبلاعم شطب بعض أو كافة الخلايا بالمستخفيات في البيئة المحيطة أو خلية المجاورة وكلا المضيف والممرض تبقى قابلة للحياة ^{5 -8.} وقد حاول العديد من الدراسات لفهم الآليات الجزيئية وراء هذا التفاعل ولكن ما زلنا لم يكن لديك فهم كامل حول ما يدفع هذه الظاهرة.

القدرة على التقاط الصور في الوقت الحقيقي ومن ثم تحليلها لاحقا تصيب متعددةإد الضامة يسمح احد للإجابة على العديد من الأسئلة حول الخصائص الفيزيائية المحيطة إيماس غير التحللي في ما يخص التوقيت، والقدرة المكانية، وتغير في التشكل وحتى إجهاد الضامة خلال العدوى الفطرية. عن طريق السماح للخلايا أن يضم في بيئة غير قابلة للمقارنة إلى أن من حاضنة، يمكننا أن نلمح طبيعة الديناميكية لل-بلعم الفطرية التفاعلات الخلية. وقد استخدم الباحثون هذه التقنية لدراسة مختلف مكونات هذه العملية. وجاء دور يبلوع في هذه العملية واضحة باستخدام تلطيخ الفلورسنت والأكتين منع وكلاء ^9، في حين أن مجموعة أخرى تستخدم هذه الطريقة لإظهار أن إيماس غير التحللي تم حظره في الخلايا والتي كان لها المياه والصرف الصحي nucleating المجالات البروتين حذف ^10. كما تم التأكد من تأثير خلوى يشير في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر ^11. ولا تقتصر هذه العملية على C. كما لوحظ الأدعومية كما مع المبيضات البيض، anotheص الممرض الفطرية التي لديها القدرة على إصابة ¹² الضامة. هذه النتائج هي أمثلة على كيف أن هذا الأسلوب يمكن أن توفر ثروة من المعلومات لمنطقة نحن لا نعرف سوى القليل عنه.

Protocol

وقد تم عمل جميع الحيوانات وفقا للوائح ومبادئ توجيهية لمعهد الدراسات الحيوانية في كلية ألبرت اينشتاين للطب.

1. شروط النمو من C. الأدعومية H99 (المصلي A)

1. النمو الفردي C. الأدعومية (CN) المستعمرات على لوحات أجار سابورو.
2. يوم واحد قبل التجربة، حدد مستعمرة واحدة وتطعيم 10 مل من مرق سابورو.
3. السماح ثقافة أن تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تهتز بسرعة 250 دورة في الدقيقة.

2. عزل وإعداد الابتدائية الضامة العظام من C57 / BL6 الفئران

1. الموت ببطء الفئران عن طريق وضع الحيوان في غرفة CO ₂ حتى لم يعد التنفس. كإجراء الثاني، خلخل cervically الرقبة قبل البدء في تشريح. تعقيم كامل الجسم، مع 70٪ الكحول الإيثيلي.
2. إزالة كل عظام الفخذ والساق وعظام في مكان معقم DMEM.
3. إزالة الأنسجة الزائدة والعضلات باستخدام ديlicate تمسح حتى عظام نظيفة تماما.
4. وضع عظام سليمة فقط في طبق بتري تحتوي على 70٪ الكحول الإيثيلي واحتضان لمدة 3 دقائق لقتل الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بها. إزالة العظام وضعها في طبق بتري مع DMEM معقمة.
5. قطع نهايات العظام بعناية. عقد العظام على مدى فارغة 50 مل أنبوب مخروطي يوضع على الجليد وبعناية دافق 10 مل من DMEM الباردة باستخدام إبرة 25 G من خلال كل العظام.
   ملاحظة: كل الماوس تسفر 4 عظام (2 عظام الفخذ، tibias 2). ولذلك ينبغي الماوس واحد تسفر حوالي 40 مل من التعليق الخلية.
6. تعليق خلية الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 650 ز س.
7. خلال هذا الطرد المركزي، وإعداد وفلتر تعقيم العظام نخاع بلعم تغذية وسائل الاعلام التي تتألف من DMEM تستكمل مع 20٪ L929، و 10٪ مصل العجل الجنين، و 10٪ NCTC-109، 1٪ القلم بكتيريا، 1٪ HEPES، 1٪ L-الجلوتامين ، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، 0.1٪ 2 المركابتويثانول.
8. مما أدى في resuspend بيليه مع 10 مل من تغذية وسائل الاعلام. تمرير suspens خليةايون من خلال مصفاة ميكرون 70 خلية لتعطيل كتل الخلايا وإزالة الأنقاض واسع.
9. لوحة 1 مل من تعليق خلية في 10 مل من تغذية وسائل الإعلام في أطباق بتري المحددة للاستخدام زراعة الأنسجة (أي ما مجموعه 10 لوحات).
10. السماح للخلايا الالتزام عند 37 درجة مئوية مع 10٪ CO _2. إضافة 5 مل من وسائل الاعلام التغذية الطازجة في اليوم 3. في يوم 7، تحل تماما محل وسائل الاعلام التغذية والضامة جاهزة للاستخدام.
11. في اليوم قبل التجربة، فصل الضامة من لوحة عن طريق إزالة وسائل الاعلام تغذية وإضافة 5ml من خلية لطيف تجريد كاشف لوحة.
12. احتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وإزالة الضامة مع pipetting لطيف.
13. خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 650 x ج لمدة 10 دقيقة.
14. بيليه resuspend في 1 مل من تغذية وسائل الاعلام. باستخدام 01:20 التخفيف، وحساب تركيز الضامة قبل pipetting 10 ميكرولتر من تعليق خلية في الصعود إلى haemocytometer.
15. باستخدام 14 مم الزجاج الى أدنى مستوى أطباق بتري، لوحة لتركيز 1 × 10 ⁵ الضامة مباشرة على البئر الداخلي الذي يحمل بحد أقصى 200 ميكرولتر، حتى تأخذ الحذر لعدم تجاوز هذا الحجم كما هو مبين في الشكل 4.
16. تسمح للخلايا التمسك الزجاج طبق بتري عن طريق وضع الأطباق في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
17. إضافة 1-2 مل من تغذية وسائل الإعلام تستكمل مع LPS في 1 ملغ / مل وIFNg في 500 U / مل وتسمح للخلايا لاحتضان بين عشية وضحاها.

3. المشارك حضانة الابتدائية الفئران الضامة وC. الأدعومية

1. في يوم من التجربة، وإزالة 1 مل من خلايا الخميرة الثقافة وبيليه تلقيح بين عشية وضحاها بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 420 ز س
2. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة وسائل الإعلام والمنتجات بالمستخفيات خارج الخلية مثل glucuronoxylomannan السكاريد (GXM) في السرعة والوقت المذكورة أعلاه.
3. بيليه الخلية resuspend في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وجعل التخفيف 1: 100. ماصة 10 ميكرولتر من رانه التخفيف الصعود إلى haemocytometer والعد الخلايا. إضافة خلايا الخميرة في وزارة الداخلية من 1: 5. على سبيل المثال، إذا كان هناك 1 × 10 ⁵ الضامة / جيد، وجعل تعليق خلية من 5 × 10 ⁶ / مل من اةي وإضافة 100 ميكرولتر من هذا الحل لمبلغ إجمالي قدره 5 × 10 ⁵ سي إن.
4. إضافة حجم محسوب من تعليق خلية بالمستخفيات إلى 1 مل من تغذية وسائل الاعلام مع الأجسام المضادة ماب 18B7 عند تركيز 10 ميكروغرام / مل. احتضان تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
5. إزالة تغذية وسائل الاعلام من الزجاج قاع طبق بتري وغسل 1X مع PBS العقيمة. إضافة 100 ميكرولتر من opsonized اةي مباشرة أيضا.
6. تسمح للخلايا لاحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 10٪ CO _2.
7. بعد المشاركة في الحضانة، والتحقق من أن المجهر الضامة قد استوعبت سي إن. أن ينظر المنضوية، يجب أن ينظر بوضوح خلايا بالمستخفيات داخل حدود البلاعم.
8. غسل 3X طبق بتري مع برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة أي وجميع extracellulaسي إن ص.
9. إضافة 1-2 مل من تغذية وسائل الاعلام دون إضافة ماب 18B7، ووضع المجهر.

الإيماس 4. تصور غير التحللي في الوقت الحقيقي الاستفادة الرقمية الخفيفة المجهر

ملاحظة: لتنفيذ هذه التجارب، المجهر الذي يأتي مع غرفة احتضان المرفقة التي تشمل CO ₂ التسليم ومطلوب وحدة التدفئة.

1. قبل التجربة، قبل تدفئة الغرفة احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل إلى 37 درجة مئوية. تأكد من أن وحدة CO ₂ يقرأ 5٪ في بداية التجربة.
2. القاع مكان الزجاج طبق بيتري على منصة المجهر، مع تغطية غطاء CO _2، وإغلاق جميع الأبواب لضمان عدم هروب الحرارة.
3. باستخدام الهدف 10X مع المجهر في مرحلة النقيض من ذلك، التركيز على مجال واضح للالضامة المصابة. بناء على التجربة، تحديد الهدف المستخدمة من قبل عدد الضامة تحتاج إلى دراسة.
4. إعداد برنامج المجهر لتاكه صورة كل 4 دقائق لفترة 24 ساعة.
5. بعد 24 ساعة، فإن التجربة قد وصلت الانتهاء وسيكون قد تم جمع ما مجموعه 361 الصور. تصدير هذه الصور كما .jpegs في ضغط 5٪. باستخدام صورة J البرمجيات، وعرض الصور على أنها كومة البصرية في 5 إطارات في الثانية. إذا كان الفيلم يحتاج إلى أن ينظر للنشر أو عرض تقديمي، حفظه إما لافي وسائل التحقق أو ملف اعتمادا على الشكل الذي يعمل بشكل أفضل للمشاهد.

Results

الصور التي تنتج هذه التقنية يمكن تحليلها في مجموعة متنوعة من الطرق لجمع معلومات عما يحدث المحيطة بعد أن هضم خلايا C. الأدعومية. كما رأينا في الشكل رقم 1، هناك ما يقرب من 100 الضامة التي إما أن تكون أو غير مصاب بالعدوى. كل واحدة من هذه الضامة يعطي المشاهد فرصة لدراسة التفاعلات المضيف الممرض على المستوى المجهري للغاية. كما الشكلين 2 و 3 المعرض، هناك نتائج مختلفة التي يمكن أن تحدث بين خلية بلعم والخميرة، وحتى بين بلعم بلعم-....

Discussion

هنا وصفناها الطريقة التي التفاعلات الفطرية البلاعم يمكن تسجيلها وتحليلها في الوقت الحقيقي على مدى فترة 24 ساعة. لدينا مختبر استخدمت هذا البروتوكول لدراسة العديد من الجوانب الزمنية للإيماس غير التحللي وستستمر في استخدام الوقت الحقيقي المجهر للتأكد من المكونات الشكلية التي تحيط بهذه العملية.

لهذه التقنية لتعطي نتائج مثالية، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لخطوات معينة في البروتوكول. كثافة الخلية التي تم مطلي الليلة قبل مهمة...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
سابورو سكر العنب أجار	BD	DF0109-17-1
مرق سكر العنب سابورو	BD	DF0382-17-9
النسر المعدل من دوبيلكو (DMEM)	مصل العجل الجنيني Corning Cellgro	10-013-CV
(FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
البنسلين الستربتومايسين	جيبكو	15140-122
هيبس عازلة	كورنينج سيلجرو	25-060-Cl
جلوتاماكس	إنفيتروجين	35050-061
الأحماض الأمينية غير الأساسية	كورنينج سيلجرو	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxic
3003 أطباق بتري لزراعة الأنسجة	فيشر العلمية	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek أطباق ثقافة القاع الزجاجي	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mouse IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	أجسام مضادة غير تجارية تم إنتاجها في مختبرنا
Axiovert 200M مجهر مع غرفة احتضان	زايس