يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

13.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52085

⸱

ديسمبر 21, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest University Health Sciences, 2The Ritchie Centre, Monash Institute of Medical Research, Monash University

في هذه المقالة

ملخص

نصف بروتوكولا لعزل واستزراع الخلايا الظهارية للسلى البشري (hAECs) باستخدام الكواشف الخالية من المنتجات الحيوانية وفقا لإرشادات ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP).

الملخص

< p class = 'jove_content'> جذبت الخلايا الظهارية للسلى البشري (hAECs) المشتقة من أغشية السلى الناضجة أو المبكرة انتباه الباحثين والأطباء كمصدر محتمل للخلايا للطب التجديدي. سبب هذا الاهتمام هو دليل على أن هذه الخلايا لديها قدرة تمايز متعددة القدرات ، ومناعة منخفضة ، ووظائف مضادة للالتهابات. دفعت هذه الخصائص الباحثين إلى التحقيق في إمكانات hAECs لاستخدامها لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض والاضطرابات في الدراسات التي أجريت على قبل السريرية بنجاح كبير. وجدت

hAECs تطبيقا واسع النطاق لعلاج مجموعة من الأمراض والاضطرابات. تشمل التطبيقات السريرية المحتملة ل hAECs علاج السكتة الدماغية والتصلب المتعدد وأمراض الكبد والسكري وأمراض الرئة المزمنة والحادة. يتطلب التقدم من الدراسات التي أجريت على قبل السريرية إلى التجارب السريرية مستوى أعلى من مراقبة الجودة والسلامة لمنتجات العلاج الخلوي. لاعتبارات السلامة ومراقبة الجودة ، يفضل أن تستخدم بروتوكولات عزل الخلايا كواشف خالية من المنتجات الحيوانية.

لقد طورنا بروتوكولات للسماح للباحثين بعزل hAECs وحفظها بالتبريد واستزراعها باستخدام كواشف خالية من المنتجات الحيوانية. تتمثل ميزة هذه الطريقة في أنه يمكن عزل هذه الخلايا وتوصيفها وحفظها بالتبريد وزراعتها دون التعرض لخطر توصيل مسببات الأمراض الحيوانية الضارة المحتملة إلى البشر ، مع الحفاظ على غلة الخلايا المناسبة وقابلية البقاء وإمكانات النمو. بالنسبة للباحثين الذين ينتقلون من الدراسات التي أجريت على قبل السريرية إلى التجارب السريرية ، فإن هذه المنهجيات ستسرع بشكل كبير من الموافقة التنظيمية وتقلل من المخاطر وتحسن جودة مجموعات الخلايا العلاجية.

المقدمة

وقد اجتذبت الخلايا المشتقة من مصادر فترة ما حول الولادة، مثل المشيمة والأغشية المشيمية، الحبل السري والسائل الذي يحيط بالجنين الاهتمام من الباحثين والأطباء كمصدر محتمل للخلايا الطب التجديدي 1،2. والسبب في هذا الاهتمام هو أن هذه الأنواع من الخلايا كل تمتلك قدرا من المرونة والقدرة المناعية 3، الخصائص التي تعتبر أساسية لتطبيقات العلاجية المحتملة.

hAECs هي السكان الظهارية غير المتجانسة التي يمكن استخلاصها من مصطلح أو قبل الأجل السلى غشاء 4، وتوفير مصدر محتمل وفيرة من المواد الخلوية التجدد. الخصائص التي تجعل hAECs جذابة كعلاج الخلوي تتضمن multipotency بهم، وانخفاض المناعية، وخصائص مضادة للالتهابات. تم العثور على hAECs أن يكون متعدد القدرات العالية على حد سواء في التجارب المختبرية والحية، وقادرة على التفريق في الأنساب أرومية متوسطة (cardiomyocytes، myocytes، osteocytes، الخلايا الشحمية)، الأنساب الأديم الباطن (خلايا البنكرياس وخلايا الكبد وخلايا الرئة) والأنساب الأدمة (الشعر، والجلد، والخلايا العصبية والخلايا النجمية) 5-10.

مطمئن، على الرغم من hAECs multipotency بهم لا تظهر إلى أي شكل أو أورام تعزيز التنمية الورم في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، hAECs هي أيضا في مأمن حظا، معربا عن انخفاض مستويات مستضدات الكريات البيض الدرجة الثانية البشرية (HLAs) 8. هذا العقار على الأرجح راء قدرتهم على التهرب من الرفض المناعي بعد زرع خيفي وxenogenic، كما هو موضح في الدراسات التي تستخدم القرود المناعة المختصة والأرانب وخنازير غينيا والجرذان والخنازير 11-13. عرض hAECs المناعية قوية وخصائص المثبطة للمناعة وبالتالي توفر مزايا عملية كبيرة لالتطبيقات السريرية المحتملة في علاج أمراض المناعة الذاتية. ويعتقد hAECs لممارسة مهام المناعية على كل من أنظمة المناعة الفطرية والتكيفية. في(ه) من الآليات المقترحة، هو من خلال إفراز المناعية عوامل 14.

وتشمل التطبيقات الحالية للhAECs في نماذج الأمراض الحيوانية ما قبل السريرية لعلاج السكتة الدماغية، والتصلب المتعدد، وأمراض الكبد والسكري وأمراض الرئة المزمنة والحادة. وقد أظهرت الباحثون اهتماما باستخدام hAECs لعلاج ما بعد السكتة الدماغية والتهاب الدماغ بسبب خصائصها الفريدة. هناك أدلة على أن hAECs يمكن عبور حاجز الدم في الدماغ حيث يمكنهم تدبر، البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 60 يوما، وتفرق في الخلايا العصبية، وتقليل الالتهاب وتعزيز تجديد الأنسجة التالفة الجهاز العصبي المركزي في النماذج الحيوانية من الأمراض العصبية 15.

hAECs توفر القدرة على استهداف وعكس مسارات متعددة المرضية التي تساهم في تطور وتقدم مرض التصلب المتعدد. على سبيل المثال، ينتج من الدراسات على الحيوانات ما قبل السريرية تشير إلى أن hAECs هي مناعة بقوة ويمكن أن يحتمل لحث على التسامح المناعي الطرفية وعكس الاستجابات الالتهابية الجارية. كما تبين hAECs لديها القدرة على التمايز إلى خلايا العصبية في الجسم الحي وتعزيز neuroregeneration الذاتية من خلال إفراز مجموعة واسعة من التغذية العصبية عوامل 16.

وقد أظهرت الخلايا الظهارية الإنسان والقوارض السلى بالفعل فعاليتها العلاجية لعلاج أمراض الكبد في النماذج الحيوانية. في رابع كلوريد الكربون نموذج الضرر تحريض أمراض الكبد، وhAEC زرع تؤدي إلى engraftment من hAECs قابلة للحياة في الكبد، وترافق مع انخفاض الخلايا الكبدية، وانخفاض التهاب الكبدي وتليف 17.

hAECs يمكن حفز لعوامل البنكرياس أعرب بما في ذلك الأنسولين والجلوكوز النقل. حققت العديد من الدراسات إمكانية hAECs لاستعادة مستويات السكر في الدم في الفئران السكري 18. في الفئران تلقيhAECs، انخفضت كل من الوزن والسكر في الدم جسم الحيوان المستويات لمستوياتها الطبيعية بعد حقن الخلايا. هذه الدراسات تمثل حجة قوية لاستخدام hAECs لعلاج داء السكري.

hAECs يكون لها دور ثبت في منع وإصلاح التجريبية الحادة والمزمنة إصابة الرئة في كل من الكبار ونماذج حديثي الولادة 19. وجدت هذه الدراسات أن hAECs التفريق في المختبر في الرئة وظيفية الخلايا الظهارية معربا متعددة البروتينات المرتبطة الرئة، بما في ذلك التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR)، والقناة الايونية التي تحور في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي 20. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم تسليم hAECs إلى الكبار المصابين والرئة لحديثي الولادة، وأنها تمارس تأثيراتها تعويضية عن طريق تعديل الخلايا المناعية، والحد من التوظيف الكرية البيضاء الرئوي، بما في ذلك العدلات، الضامة والخلايا اللمفية 21-23.

ونظرا فرة بهم،سجل السلامة، والتطبيقات السريرية مؤكدة لأمراض متعددة، والتجارب السريرية باستخدام hAECs أمر لا مفر منه. وذلك بهدف الإسراع في ترجمة العلاجات hAEC في التجارب السريرية، قمنا بتطوير طرق لعزل وcryopreserve وhAECs الثقافة بطريقة مناسبة للتجارب السريرية، وذلك باستخدام الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية وفقا للممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب) المبادئ التوجيهية .

نحن مقرها هذا البروتوكول بروتوكول نشرت سابقا التي كنا نستخدمها بنجاح لعزل hAECs باستخدام الكواشف المشتقة من الحيوانات 6. نحن تغيير البروتوكول الأصلي ليحل محل المنتجات المشتقة من الحيوانات مع الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية، وأجريت الأمثل لاحق لتحسين العائد الخلية، وسلامة ونقاء. كان هدفنا لوضع بروتوكول من شأنه أن تمتثل للمعايير التنظيمية لتصنيع الخلايا للتجارب السريرية الإنسان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: المشيمة ينبغي جمع من الحمل صحية مفردة، مع تفضيل أقسام المدى القيصرية الاختيارية. مكتوبة، ينبغي إيلاء الموافقة المسبقة لجمع المشيمة عند هؤلاء النساء. ينبغي للجنة أخلاقيات البحث الإنسان الخاص ذات الصلة موافقة جميع عمليات جمع واستخدام الأنسجة البشرية.

1. عزل الخلايا الظهارية السلى

  1. وضع المشيمة على سطح معقمة داخل خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.
  2. باستخدام هانكس معقمة محلول ملحي متوازن (HBSS)، وغسل الكثير من الدم ممكن من سطح المشيمة والأغشية.
  3. مع المشيمة وضعت مع الحبل السري تواجه تصل، فصل ميكانيكيا الحافة الخارجية للالسلى والمشيمه الأغشية.
  4. مرة واحدة فصل، تجريد يدويا غشاء السلى من غشاء المشيمه من المشيمة، والعمل حول حافة الغشاء، نحو الحبل السري.
    ملاحظة: كن carefالمجاهدين لإزالة أي قطعة من تلوث غشاء المشيمه من السلى.
  5. باستخدام مقص العقيمة، وقطع غشاء السلى يقرب من 2 سم من قاعدة الحبل السري ومكان في 500 مل مختومة حاوية تحتوي على 250 مل HBSS.
  6. يغسل جيدا عن طريق هز زجاجة مغلقة تحتوي على غشاء السلى.
  7. إزالة غشاء السلى من حاويات خاصة لجمع باستخدام ملقط معقم، والمكان إلى 15 سم طبق بتري.
  8. قطع غشاء السلى إلى قطع ما يقرب من 5 سم طويلة (عندما عقدت رأسيا مع ملقط)، ونبذ قطع الدموية أو تمزقها.
  9. مكان في 500 مل مختومة الحاويات ويغسل مع 250 مل HBSS حوالي 3-5 مرات أو حتى يصبح غشاء السلى شفافة مع عدم وجود الدم الملوثة.
    ملاحظة: أي الحاضر الدم قد يقلل من كفاءة الهضم الأنزيمي الحل.
  10. نقل كل قطعة من غشاء السلى في وعاء يحتوي على 50 مل من الأنزيمية الهضم حل، مع الحرص علىتقليل المرحل من HBSS.
  11. احتضان القطع السلى في الأنزيمية الهضم حل في حمام مائي أو غرفة دافئة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف لإزالة أي الدم المتبقية.
  12. إزالة قطع غشاء السلى من الأنزيمية الهضم حل وضعها في وعاء معقم جديدة.
  13. إضافة 100 مل من الأنزيمية جديدة هضم حل للغشاء السلى واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حمام مائي أو غرفة دافئة مع طيف والهز (الهضم الأول).
  14. إزالة السلى قطع الغشاء ووضع في جديدة الرعاية أخذ حاوية للسماح للهضم الأنزيمية حل لاستنزاف من كل قطعة من الغشاء.
    ملاحظة: ويمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب القطع السلى على طول الحافة الداخلية للحاوية.
  15. إضافة 100 مل من الأنزيمية جديدة هضم حل للالسلى قطع الغشاء واحتضان 60 دقيقة في حمام مائي أو غرفة دافئة عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف (الهضم الثاني).
  16. تمرير suspensi خليةعلى من الخطوة 1.14 من خلال مرشح 70 ميكرون والطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  17. إزالة وتجاهل طاف، و resuspend بيليه خلية في 4 مل HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع ماصة 1 مل للحصول على تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة الخلايا يمكن أن تترك على الجليد حتى الخلايا من هضم الثاني هي في نفس المرحلة من المعالجة.
  18. إزالة السلى قطع الغشاء ووضع في جديدة الرعاية أخذ حاوية للسماح للهضم الأنزيمية حل لاستنزاف من كل قطعة من الغشاء.
    ملاحظة: ويمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب القطع السلى على طول الحافة الداخلية للحاوية.
  19. تمرير تعليق الخلية من الخطوة 1.18 من خلال مرشح 70 ميكرون والطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  20. إزالة وتجاهل طاف، و resuspend بيليه خلية في 4 مل HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع 1 مل صipette للحصول على تعليق خلية واحدة.
  21. خلايا تجمع من اثنين من هضم أو بدلا من ذلك الحفاظ على هضم خلية فصل حتى بعد عدد الخلايا.
    ملاحظة: هذا يمنع الاختلاط الخلايا الجدوى يحتمل أن تكون منخفضة مع الخلايا قابلية عالية.
  22. إضافة HBSS إلى الحجم النهائي من 10-20 مل وتنفيذ عدد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق لقياس قدرتها على البقاء.
  23. تأكيد النمط الظاهري الخلايا الظهارية بواسطة التدفق الخلوي. تشكل الكوكتيلات الأجسام المضادة المناسبة استخدام الألغام المضادة للEpCAM-PE (1: 2 التخفيف) لمكافحة CD90-PeCy5 (1: 250) ومكافحة CD105-APC (1: 100) في HBSS.
  24. و resuspend مجموعة فرعية من الخلايا من واحد أو كلا هضم في كوكتيل الأجسام المضادة بتركيز 25 × 10 6 خلية / مل.
  25. لالتدفق الخلوي، وصمة عار 1 × 10 6 خلايا مع الكوكتيلات الأجسام المضادة التي تحتوي على الضوابط نمط إسوي (على سبيل المثال. ضبط PE مفتش 1 + نمط إسوي مكافحة CD90-PeCy5 + مكافحة CD105-APC). إبقاء ~ 1 × 10 6 خلايا غير ملوثين لتدفق عداد الكريات انشاء.
  26. احتضان الخلايا في الجسم المضادالكوكتيلات في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  27. غسل الخلايا 3X في HBSS و resuspend كل 5 إلى 10 مليون خلية لكل مليلتر عن التدفق الخلوي.
  28. أداء التدفق الخلوي والنتائج المذكرة. ومن المتوقع أن يكون 90-95٪ و<1٪ على التوالي نقاء عزل الخلية (نسبة EpCAM إيجابي وCD90 / CD105 خلايا السلبية).
  29. تخصيص عدد مناسب من الخلايا لاختبار المعايير المناسبة لمراقبة الجودة أو الإفراج على النحو الذي يحدده التطبيق النهائي.
    ملاحظة: يمكن أن يتضمن هذا المرض / الفحص الفيروسي، أو السلامة الأخرى أو المعايير البيولوجية.
  30. للحصول على الخلايا المتبقية، متابعة بروتوكول الحفظ بالتبريد، أو بدلا من وضع مباشرة في ثقافة (المباشرة للثقافة الخطوة 3.6).

2. الحفظ بالتبريد من hAECs

  1. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام التدفق الخلوي البيانات أو العد والفرز اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. خلية في resuspendالصورة بين 1-10٬000٬000 خلايا لكل مل في الحيوانات خالية من المنتج الإعلامي الحفظ بالتبريد.
  4. ماصة حجم مناسب من الخلايا في قارورة الحفظ بالتبريد-الحلقية O والمكان الى جهاز معدل تجميد تسيطر عليها حيث يحدث التبريد في حوالي 1 ° C / دقيقة حتى -80 درجة يتحقق C.
  5. نقل قوارير في النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.

3. ذوبان وثقافة Cyropreserved hAECs

  1. إزالة قارورة الحفظ بالتبريد من النيتروجين السائل ووضع على الجليد.
    ملاحظة: بالنسبة للنقل فقط - المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية.
  2. ذوبان الجليد قارورة الحفظ بالتبريد بسرعة عند 37 درجة مئوية حتى فقط قطعة صغيرة (~ 5 مم × 5 مم) من يبقى الجليد.
    ملاحظة: من المهم أن الحل الخلية لا الحارة للحد من الآثار السامة للDMSO في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد.
  3. تمييع وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد 10 أضعاف مع الباردة (~ 4 ° C) خالية من المصل وسائل الإعلام، وأضاف الإفلات من الحكمة في حجم مناسبد أنبوب أو حاوية.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  5. resuspend في المصل خالية المتوسطة، إلى تركيز تقريبي من 1 مليون خلية لكل مليلتر. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام الفرز الآلي أو اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق. ويتوقع بقاء بعد ذوبان الجليد يكون 5-10٪ أقل من الجدوى قبل الحفظ بالتبريد.
  6. لوحة الخلايا على القياسية خلية المعالجة الثقافة البلاستيك وير، أو بدلا من ذلك استخدام النوع الأول الكولاجين على الأسطح الثقافة معطف.
  7. لمن النوع الأول الكولاجين طلاء اتباع البروتوكول التالي
    1. تحضير حامض للذوبان النوع الأول الكولاجين من المشيمة البشرية (15 ملغ الكولاجين مع 25 مل من الماء منزوع الأيونات و 50 ميكرولتر حمض الخليك الجليدي).
    2. تغطية الكأس مع بارافيلم ويقلب باعتدال عند 37 درجة مئوية حتى تذوب خيوط الكولاجين.
    3. معقم حل مرشح الكولاجين باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
    4. تمييع تصفيتها الكولاجين 1:10 الأسهم مع الماء منزوع الأيونات. هذا المخزون المخفف هو العمل بغية دراسته واقرارهحل ntration للأسطح طلاء من البلاستيك والغشاء.
    5. الكولاجين البلاستيك معطف، والزجاج، وغشاء الأسطح لمدة 2 ساعة على RT عند 37 درجة مئوية، أو O / N في 2-8 ° C.
    6. إزالة السوائل الزائدة من السطح المطلي، واتركه حتى يجف O / N.
    7. شطف مع زراعة الأنسجة المياه الصف معقمة أو HBSS قبل إدخال الخلايا والمتوسطة.
  8. hAECs لوحة في مناطق ذات كثافة من 25،000 خلية / سم 2 في المصل خالية المتوسطة، والسماح التعلق تحدث عن 72-96 ساعة.
  9. وبعد التعلق، وتغيير وسائل الإعلام بواسطة الشفط بعناية واستبدالها مع حجم مناسب من المصل خالية المتوسطة كل 2-3 أيام.
  10. خلايا مرور باستخدام بروتوكول أدناه
    1. نضح وسائل الإعلام ثقافة الخلية وتغسل مع حجم 1X من معقم HBSS
    2. إضافة حجم 1X من الأنزيمية الهضم الحل واحتضان لمدة 5-15 دقيقة، أو حتى خلايا لوحظ فصل من سطح ثقافة الخلية.
    3. جمع الأنزيمية الهضم محلول يحتوي على الخلايا، وضمان مLLS يتم فصل من سطح ثقافة الخلية بواسطة pipetting مرارا الأنزيمية الهضم حل ضد سطح خلية ثقافة
    4. أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق.
    5. Resuspend وبيليه الخلية في حجم مناسب من HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع ماصة 1ML للحصول على تعليق خلية واحدة.
    6. إضافة المصل خالية المتوسطة إلى تركيز تقريبي من 1 مليون خلية / مل. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام الفرز الآلي أو اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق.
    7. hAECs لوحة في مناطق ذات كثافة من 25،000 خلية / سم 2 في المصل خالية المتوسطة، والاستمرار في طرق زراعة القياسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عندما يتبع هذا الإجراء بشكل صحيح، ينبغي أن يتوقع متوسط ​​العائد من 120 مليون hAECs، مع مجموعة نموذجية من 80-160٬000٬000 الخلايا. من هذه المحاصيل، ويمكن توقع متوسط ​​بقاء 83 ± 4٪. قد يكون زيادة متوسط ​​العائد وانخفاض طفيف جدوى في طريقة السريري بسبب ارتفاع النشاط التربسين من المنتج المشتق من الحيوان، وربما أيضا بسبب عدم وجود بروتينات مصل. hAECs معزولة إن متوسط ​​الشخصي سطح الخلية من 92٪ EpCAM خلايا إيجابية مع <1٪ CD90، CD105 علامة الوسيطة خلايا إيجابية. وقد تم اختيار هذه العلامات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هناك العديد من المعلمات الحرجة التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير في نجاح هذه المنهجية. تخزين المشيمة أو السلى لمدة تصل إلى 3 ساعات قبل عزل hAECs قد يكون من المرغوب فيه لأغراض لوجستية أو جدولة، ومع ذلك فمن المستحسن أن تتم معالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن. إذا الأنسجة ليتم تخزينها، فمن المستحسن أن تخزين أن يؤديها التالية تشريح وغسل غشاء السلى. السلى يمكن تخزينها في HBSS العقيمة التي تحتوي على المضادات الحيوية في 4 درجات مئوية، ومع ذلك بقاء الخلية يمكن أن تقلل مع تمديد فترة التخزين. ون...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بالدعم المالي من برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية التابع لحكومة فيكتوريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة
تجريدفيشر Scientific13-361B
Liberty Dressing Corpp ، مدبب 13 سمFisher ScientificS17329   ؛
مقص - حاد / حاد مستقيمفيشر ScientificNC0562592 
قفازات مطاطية معقمة فيشر ساينتفيك19-014-643 
واقية
الملابس الواقية (ثوب)عباءات عزل U-lineS-15374-M
قفازاتS-15374-M
؛فيشر ساينتفيك19-014-643 
قناع الوجه للأغراض العامةCardinal HealthAT7511
Bonnetsحذاء MedlineCRI1001
يغطيU-lineS-7873W
Media والكواشف
Hanks ' محلول الملح المتوازن (HBSS)14175095 Life Technologiesبدون الكالسيوم أو المغنيسيوم
TrypZean (منتج حيواني– التربسين المؤتلف الحر)Sigma AldrichT3449
مثبط التربسين فول الصويا  1 جم / 50 ملSigma AldrichT6522
Cryostor CS5BioLife Solutions205102
كاشف تريبان الأزرقLife Technologies15250-061
Anti-EpCam-PEMiltenyi Biotec130 - 091-253
PE-isotype التحكمMiltenyi Biotec130-098-845
Anti-CD90-PeCy5BD Pharmingen555597
التحكم في النمط المتنظير PeCy5BD Pharmingen557224
Anti-CD105-APCBD Pharmingen562408
التحكم في النمط المتنظيرAPC BD Pharmingen340754
الكولاجين النوع السادسSigma AldrichC7521
مستهلكات
50 مل ماصة متدرجةBD / Falcon356550
10 مل ماصة متدرجةBD / Falcon356551
5 مل ماصة متدرجةBD / Falcon356543
50 مل أنابيب الصقر BD/ Falcon352070
15 مل أنابيب الصقر BD/ Falcon352096
أطباق بتري 15 سمكورنينج351058
70 مو ؛ مرشحات مBD / Falcon352350
0.22 & مرشحات MMilliporeSLGV033RS
1 مل أطراف ماصةFisherbrand02-707-401
200 & mu ؛ ل نصائح الماصةفيشربراند02-707-409
20 مل حقنةBD / ملعقة بلاستيكيةطبية 309661
فيشر Scientific14-245-97   ؛
قارب وزن بلاستيكيفيشر ساينتيك02-202-102 
قوارير التبريدNuncمعدات
السيد فروستيفيشر العلميةA451-4   ؛
خزانة
مجموعة صينية ملابس من مطاطية معقمة U-line 377267 Biohazard

المراجع

  1. Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
  2. Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
  3. Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
  4. Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
  5. Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
  6. Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3(2007).
  7. Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6(2010).
  8. Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
  9. Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
  10. Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
  11. Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
  12. Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
  13. Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
  14. Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
  15. Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
  16. Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
  17. Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631(2012).
  18. Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
  19. Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
  20. Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533(2012).
  21. Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
  22. Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763(2012).
  23. Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
  24. Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
  25. Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
  26. Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
  27. Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.