يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

رصد القائم على مضان آخر PAD4 عبر برو-مضان الركيزة النظير

9.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52114

⸱

نوفمبر 5, 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry, Lehigh University

في هذه المقالة

ملخص

PAD4 هو إنزيم مسؤول عن تحويل الببتيديل الأرجينين إلى الببتيديل السيترولين. كان خلل تنظيم PAD4 متورطا في عدد من الأمراض البشرية. تم وصف مقايسة PAD4 سهلة وعالية الإنتاجية متوافقة مع التألق القائم على الإنتاجية.

الملخص

قد تؤدي التعديلات اللاحقة للترجمة < p class = 'jove_content'> إلى تغيير الحالات الوظيفية للبروتين عن طريق زيادة الاختلافات التساهمية على السلاسل الجانبية للعديد من ركائز البروتين. تمثل ذيول هيستون واحدة من أكثر الامتدادات تعديلا بشكل كبير داخل جميع البروتينات البشرية. ثبت أن الببتيديل أرجينين ديميناز 4 (PAD4) يحول بقايا الأرجينين إلى بقايا سيترولين غير مشفرة وراثيا. عدد قليل من المقايسات الموصوفة حتى الآن كانت سهلة من الناحية التشغيلية مع حساسية مرضية. وبالتالي ، من المحتمل أن يكون الافتقار إلى المقايسات الكافية قد ساهم في عدم وجود مثبطات PAD4 غير تساهمية قوية. هنا يتم وصف اختبار جديد قائم على التألق يسمح بمراقبة نشاط PAD4. تم تصميم نظير الركيزة المؤيدة للفلورسنت لربط النشاط الأنزيمي PAD4 بتحرير التألق عند إضافة التربسين البروتيني. وقد تبين أن الاختبار متوافق مع ظروف الفحص عالية الإنتاجية وله نسبة إشارة إلى ضوضاء قوية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا إجراء الفحص باستخدام محللات الخلايا الخام التي تحتوي على PAD4 مفرط التعبير.

المقدمة

يتم تعديل عدد كبير من البروتينات الثدييات بشكل كبير بفعل الإنزيمات التالية الحيوي من البروتينات التي الريبوسوم. ويمكن لهذه التعديلات بعد متعدية (PTMs) زيادة كبيرة في التنوع الوظيفي للبروتيوم عن طريق تغيير حجم، وتهمة، وهيكل، والدولة oligomerization (من بين الميزات الأخرى) البروتينات 1-3. ونتيجة لذلك، فإن التغيير في بنية البروتين يمكن أن يؤدي إلى عواقب فيزيولوجية، مثل تدهور البروتين، التمايز الخلوي، مما يشير، في تعديل التعبير الجيني، وتفاعلات البروتين البروتين. في حين أن هذه التعديلات هي السائدة في نسبة كبيرة من جميع البروتينات البشرية، ومحطة تنتهي في البروتينات هيستون الخضوع لعدد كبير بشكل غير عادي من التعديلات التساهمية 4. البروتينات هيستون هي عائلة من البروتينات الهيكلية التي تسهل التكثيف من الحمض النووي الجيني. وتجرى التعديلات التساهمية من ذيول هيستون غير منظم بها وينظمها دوري الدرجة الاولى الايطاليS من الانزيمات التي يمكن أن تحفز تعديل التساهمية المخلفات (الكتاب)، عكس نفس التعديلات (المحايات)، والتمييز بين التغييرات التي مطبوع على الذيول هيستون (القراء) 5-7. في الواقع، فإن معظم PTMs معروفة يمكن ملاحظتها ضمن هذه الشريحة قصيرة من هيستون بما مثيلة، الفسفرة، أستلة، sumoylation، ubiquitination، وcitrullination 8.

Citrullination ينطوي على تحويل ببتيديل أرجينين إلى غير المشفرة ببتيديل ر RNA-سيترولين (الشكل 1A). البروتينات المسؤولة عن هذه السلسلة تحييد الجانب، هم أعضاء في PAD (ص eptide على rginine د eiminase) عائلة بروتين، وكلها تعتمد على الانزيمات الكالسيوم. 9،10. حتى الآن، وقد وصفت خمسة أفراد من عائلة PAD (PAD1، PAD2، PAD3، PAD4، وPAD6). يبدو أن كل عضو من أعضاء هذه الأسرة لاستهداف البروتينات الخلوية متميزة وأيضا يعرض أحاديكيو ملامح توزيع الأنسجة. PAD4 هو العضو الوحيد من هذه العائلة البروتين المعروف أن تكون مترجمة داخل النواة عبر تسلسل توطين النووية 11. تبعا لذلك، فقد تبين أن deiminate عددا من الأهداف النووية، بما في ذلك السلاسل الجانبية أرجينين على ذيول N-الطرفية من الهستونات H2A أرجينين بقايا 3 (H2R3)، H3 (H3R2، H3R17، وH3R26) وH4 (H4R3) 12، 13. في حين أن كل من isozymes PAD لها وظائف فسيولوجية معينة وحاسمة، تلقت PAD4 إيلاءها مزيدا من الاهتمام نظرا لدوره في عدد من العمليات الإنسانية في كل الخلايا المريضة والسليمة. في الآونة الأخيرة، وقد تبين PAD4 أن تكون عضوا في شبكة النسخي تعدد القدرات 14. وعرضت كل من مستويات التعبير PAD4 والنشاط لتكون مرتفعة خلال إعادة برمجة وللدولة الارض الدول المحفزة في الفئران. عن طريق التحكم في تنظيم جينات الخلايا الجذعية، قد PAD4 الاحتفاظ دورا محوريا في كفاءة إعادة برمجة الخلايا. PAD4 كما تم المتورطين فيتشكيل الفخاخ خارج الخلية المتعادلة، التي تقوم عليها ملزمة من مسببات الأمراض تمكين إزالة النظام الخاص بهم. وhypercitrullination من البروتينات هيستون من قبل PAD4 يدفع decondensation من لونين، والتي هي بمثابة المادة الأساسية للتغليف من البكتيريا المسببة للأمراض من فخ خارج الخلية، وبالتالي درء العدوى البكتيرية 15،16.

بالإضافة إلى ذلك، تم العثور PAD4 للعب دور نشط في عدد من الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تبين سابقا أن التعبير المنحرف من PAD4 يرتبط مع بداية وشدة التهاب المفاصل الروماتويدي، مرض الزهايمر، مرض باركنسون، والتصلب المتعدد 17. في الواقع، فإن وجود الأجسام المضادة بروتين مكافحة citrullinated هو واحد من المؤشرات الحيوية التشخيصية والنذير الأكثر موثوقية ونهائية من التهاب المفاصل الروماتويدي 18. وبالمثل، فقد لوحظ مؤخرا نشاط PAD4 dysregulated في عدد من السرطانات البشرية بما في ذلك المبيض والثدي والرئة، وسرطان المريء د 19-22. وقد تبين الصلة بين PAD4 والسرطان إلى أن توسطت من خلال الجين الورمي ELK1 أو عبر الورم البروتين p53 البروتين القامع 22،23، واقترح العمل السابق الذي PAD4 يمكن أن تكون مضادة للسرطان الهدف العلاجي رواية 17،24،25. كدليل على دراسة المبدأ، تم الكشف عن نضوب PAD4 عبر shRNA في القولون والمستقيم خط الخلايا السرطانية HCT116 أن تكون كافية لإحداث موت الخلايا المبرمج ودورة الخلية اعتقال 26. أدى ضعت مؤخرا لا رجعة فيه PAD4 المانع إلى انخفاض سبعين في المئة في كتلة الورم في الفئران (27). بشكل ملحوظ جدا، ويبدو PAD4 تثبيط لتكون بمثابة العلاج المستهدفة التي أسفرت عن مقتل الانتقائي للخلايا السرطانية في حين أن يجنب الخلايا untransformed.

استخدام جزيئات صغيرة لإيقاف وظيفة PAD4 قد يثبت أنه استراتيجية جديدة وقوية لاستهداف الخلايا السرطانية أو لزيادة مبحث المعالجة الكيميائية السرطانية الموجودة 28. للأسف، صوبعد أن اكتشف خيمة PAD4 عكسها المانع. وقد تم تطوير عدد من مثبطات التساهمية باستخدام الكلور / مقبض imidine الفلوري الذي يحاكي الركيزة أرجينين 27،29،30 وأثبتت أنها أدوات عملية في فهم دور PAD4 في كل خلايا الدولة السليمة والمريضة. ومع ذلك، هذه الجزيئات تمنع كل من منصات نشطة مع قوة مماثلة. وبالتالي، فإن الحاجة لفحص سطحي التي تفيد عن نشاط PAD4 أمر بالغ الأهمية. حتى الآن، وقد وصفت PAD4 المقايسات التي تربط الإفراج عن الأمونيا من رد الفعل إلى قراءات اللونية 31، الاستفادة من التناظرية chloroamidine الركيزة fluorescently المسمى لمضان الاستقطاب فحص 32، تعتمد على رد فعل حمض بمساعدة بين الجليوآسال وسيترولين 33، و زوجان النشاط PAD4 إلى مضان dequenching خطوة 34. من هذه، وقد أثبتت هذه الاستراتيجية haloacetamidine معدل التساهمية فقط لتكون متوافقة مع scre عالية الإنتاجيةمنصات ملمسه 32،35،36. نحن تصف فحص سطحي مضان القائم الذي يقيس موثوق نشاط PAD4. الفحص، الذي يعرض نسبة قوية إشارة إلى الضجيج، وسرعة تحليلها، وقياس متانة، لديه القدرة على اكتشاف قوية وانتقائية حقا PAD4 المانع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. PAD4 التحول، والتعبير، وتنقية

  1. لPAD4 التحول، وتحويل البلازميد pGEX تحتوي PAD4 GST الانصهار داخل المختصة كيميائيا E. القولونية (BL21 (DE3)) خلايا للتعبير البروتين باستخدام الإجراء التالي. إعداد المختصة كيميائيا (كلوريد الكالسيوم) E. القولونية (BL21 (DE3)) الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية.
    1. ذوبان الجليد 50 ميكرولتر من معدة مسبقا BL21 المختصة كيميائيا (DE3) الخلايا على الجليد وتخلط مع 1 ميكرولتر من البلازميد pGEX تحتوي PAD4 الجينات في أنبوب ثقافة 5 مل. احتضان الخليط على الجليد لمدة 10 دقيقة في حين تهز بلطف كل 2 دقيقة.
    2. حرارة صدمة الخلايا عن طريق وضع الخليط في 42 ° C حمام الماء لمدة 40 ثانية. ضع الخليط على الفور خلية بلازميد مرة أخرى على الجليد لمدة 2 دقيقة للسماح للخلايا لاسترداد. إضافة 1 مل من معقم LB مرق إلى الخليط ووضعه على الجليد لمدة 1 دقيقة.
    3. احتضان حرارة الخلايا صدمت عند 37 درجة مئوية، والهز في 250 دورة في الدقيقة ل1ساعة. ماصة 75 ميكرولتر من الخلايا تحولت إلى لوحة آغار مقاومة الأمبيسلين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. متجر لوحة في 4 درجات مئوية.
  2. PAD4 التعبير.
    1. 1 اختيار مستعمرة BL21 (DE3) خلايا من لوحة الأمبيسلين أجار ومكان في 5 مل من LB تحتوي على 1X الأمبيسلين. مكان في الحاضنة ويهز O / N عند 37 درجة مئوية.
    2. نقل 5 مل من LB (كاتب) في 1 لتر من LB العقيمة التي تحتوي على 1X الأمبيسلين هيدرات (MW 403.45 جم / مول). نمو مكان في هز حاضنة 37 درجة مئوية. مراقبة OD 600 من النمو. عندما يصل النمو إلى OD 600 من 0.3، تحرك النمو إلى 16 درجة مئوية تهز الحاضنة.
    3. على التوصل الى OD 600 من 0.6، لحث الخلايا مع 0.3 ملي isopropylthiagalactoside (IPTG، MW 238.30 جم / مول). السماح للخلايا ليهز لمدة 15 ساعة على 16 درجة مئوية.
    4. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 0 درجة مئوية. تخلصي من طاف وتخزين بيليه في -80 درجة مئوية.
  3. PAD4 تنقية
    1. إعادة تعليق بيليه الذي يحتوي على PAD4 أعرب في BL21 (DE3) الخلايا في منطقة عازلة من 50 ملي مول كلوريد الصوديوم (MW 58.44 غرام / مول)، و 300 ملي ناه 2 ص 4 (MW 119.98 جم / مول)، 10 ملي إيميدازول (MW 68.077 ز / مول)، 0.1 ملي phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF، MW 174.94 جم / مول) و 1 ملي dithiothreitol (DTT، 154.25 جم / مول)، ودرجة الحموضة = 8.0.
    2. ليز الخلايا عبر صوتنة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد صوتنة، جهاز طرد مركزي لالمحللة خلية في 20000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 0 درجة مئوية. تخلصي وحفظ طاف. دفعة طاف مع الجلوتاثيون (GSH) حبات الاغاروز لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. استنزاف طاف من الخرز GST / عمود عن طريق الجاذبية. تغسل حبات مع 4 × 25 مل من 1X PBS (الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة = 8.0) في RT.
    4. أزل PAD4 مع 2 × 10 مل شطف العازلة، 50 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس قاعدة، MW 121.14 جم / مول)، 10 ملي الجلوتاثيون (GSH، MW 307.32 جم / مول)، ودرجة الحموضة = 8.0.
    5. التركيز PAD4 باستخدام 100K ميغاواط قطع سأنابيب الطرد المركزي وما يليها والطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. البروتين قسامة في 200 ميكرولتر في حجم 1.0 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. إعداد حلول للسهم المخازن

  1. تزن من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم، MW 58.44 غرام / مول) وإعداد الحل 2 M. مزيج حتى حل واضح.
  2. تزن من تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس قاعدة، MW 121.14 جم / مول) وإعداد 2 M حل، ودرجة الحموضة = 8.0. مزيج حتى حل واضح.
  3. تزن خارج ثنائي الهيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2 2H 2 O، MW 147.01 جم / مول) وإعداد 500 ملي حل. مزيج حتى حل واضح.
  4. تزن من تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP، MW 250.19 جم / مول) وإعداد 200 ملي حل. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  5. تزن خارج dithiothreitol (DTT، MW 154.25 جم / مول) وإعداد محلول 1 M. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  6. إعدادحل 0.5٪ من تريتون X-100.
  7. تزن من حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA، MW 292.24 جم / مول) وإعداد 100 ملي حل. مزيج حتى حل واضح.
  8. تزن خارج Z- Arg- Arg- 7- جذر الأميدو 4- methylcoumarin هيدروكلوريد (ZRcoum، MW 621.69 جم / مول) وإعداد حل 10 ملم في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO).

3. PAD4 الفحص عند 37 درجة مئوية

  1. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 125 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل 125 ميكرومتر ZRcoum يكون الحل A.
  2. تعد منطقة عازلة من 62.5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 62.5 ملي تريس، 12.5 ملي CaCl 2، 6.25 ملي DTT، و 5 ميكرومتر PAD4 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل B.
  3. تعد منطقة عازلة من 62.5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 62.5 ملي تريس، 12.5 ملي CaCl 2، و 6.25 ملي DTT (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل C.
  4. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20° C. سوف يكون هذا الحل D.
  5. الحصول على لوحة 96-جيدا وتعيين عدد من الآبار لضوابط (أي PAD4) واختبار الآبار (+ PAD4).
  6. ماصة 160 ميكرولتر من الحل ب في آبار الاختبار وماصة 160 ميكرولتر من محلول C في آبار المراقبة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. ماصة 40 ميكرولتر من الحل وإلى جميع الآبار واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  8. ماصة 10 ميكرولتر من 2 O درهم إلى نصف آبار المراقبة ونصف من آبار الاختبار. إلى النصف الآخر من آبار المراقبة وضوابط الاختبار، ماصة 10 ميكرولتر من الحل D. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  9. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

4. PAD4 الفحص في RT

  1. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 50 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل ZRcoum 50 ميكرومتر يكون الحل A.
  2. تعد منطقة عازلة من 100 ملي ناCL 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، 2 مم TCEP، 0.02٪ تريتون X-100، و 8 ميكرومتر PAD4 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل B.
  3. تعد منطقة عازلة من 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، 2 مم TCEP، و 0.02٪ تريتون X-100 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل C.
  4. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية. سوف يكون هذا الحل D.
  5. الحصول على 384 لوحة جيدا وتعيين آبار للضوابط (لا PAD4) واختبار الآبار (+ PAD4).
  6. ماصة 25 ميكرولتر من الحل ب في آبار الاختبار وماصة 25 ميكرولتر من الحل C في آبار المراقبة. السماح عازلة مع / بدون PAD4 لاحتضان في الآبار لمدة 20 دقيقة في RT.
  7. ماصة 25 ميكرولتر من الحل C في جميع الآبار واحتضان لمدة 45 دقيقة في RT.
  8. ماصة 10 ميكرولتر من 2 O درهم إلى نصف آبار المراقبة ونصف من آبار الاختبار. إلى النصف الآخر من آبار المراقبة وضوابط الاختبار، pipettه 10 ميكرولتر من الحل D. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
  9. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

5. PAD4 الوقت فحوصات دورة في 37 درجة مئوية وRT

  1. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 125 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل 125 ميكرومتر ZRcoum يكون الحل A.
  2. تعد منطقة عازلة من 62.5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 62.5 ملي تريس، 12.5 ملي CaCl 2، 6.25 ملي DTT، و 5 ميكرومتر PAD4 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل B.
  3. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية. سوف يكون هذا الحل C.
  4. 2 الحصول على لوحات 96-جيدا والماصة 160 ميكرولتر من محلول B في كمية # الآبار (آبار # سوف يعتمد على مدى العديد من النقاط الزمنية).
  5. احتضان لوحة واحدة 96-جيدا عند 37 درجة مئوية. احتضان الأخرى 96 لوحة جيدا في RT.
  6. بذرةETTE 40 ميكرولتر من الحل وإلى جميع الآبار في كل من لوحات 96-جيدا وعلى الفور ماصة 10 ميكرولتر من الحل C في الآبار ر = 0 دقيقة. الاستمرار بإضافة 10 ميكرولتر من الحل C في نقطة زمنية محددة حتى يتم تطفئ جميع الآبار.
  7. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

6. PAD4 تثبيط الفحص في RT

  1. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 83 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل ZRcoum 83 ميكرومتر يكون الحل A.
  2. تزن خارج CL-أميدين (MW 424.8 غرام / مول) وإعداد محلول المخزون 100 ميكرومتر. سوف يكون هذا الحل B.
  3. تعد منطقة عازلة من 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، 2 مم TCEP، 0.02٪ تريتون X-100، و 8 ميكرومتر PAD4 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل C.
  4. تعد منطقة عازلة من 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، 2 مم TCEP، و 0.02٪ تريتون X-100 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). عشرهو سيكون الحل D.
  5. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية. سوف يكون هذا الحل E.
  6. الحصول على 384 لوحة جيدا وتعيين آبار للضوابط (لا PAD4)، آبار اختبار (+ PAD4)، والآبار تثبيط (PAD4 + CL-أميدين).
  7. ماصة 25 ميكرولتر من الحل C في آبار الاختبار وماصة 25 ميكرولتر من الحل D في آبار المراقبة. السماح عازلة مع / بدون PAD4 لاحتضان في الآبار لمدة 20 دقيقة في RT.
  8. ماصة 10 ميكرولتر من الحل ب في آبار تثبيط واحتضان لمدة 20 دقيقة في RTE.
  9. ماصة 15 ميكرولتر من الحل وإلى جميع الآبار واحتضان لمدة 45 دقيقة في RT.
  10. ماصة 10 ميكرولتر من الحل E لجميع الآبار. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
  11. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

7. خلية الخام المحللة الفحصفي RT

  1. بعد حصاد الخلايا من النمو PAD4 1 لتر، وخلايا resuspend في 10 مل من 50 ملي تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF، MW 174.94 جم / مول) و 1 ملي dithiothreitol (DTT، 154.25 جم / مول)، ودرجة الحموضة = 8.0.
  2. ليز الخلايا عبر صوتنة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة في 20000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 0 درجة مئوية. تركيز طاف واضحة إلى نصف حجم بواسطة الطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام 100K ميغاواط قطع أنابيب الطرد المركزي.
  3. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 250 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل 250 ميكرومتر ZRcoum يكون الحل A.
  4. تعد منطقة عازلة من 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، و 2 ملي TCEP (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل B.
  5. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية. سوف يكون هذا الحل C.
  6. الحصول السوداء لوحة 384 جيدا والتصميمأكل الآبار للضوابط (لا المحللة الخلية) واختبار الآبار (+ المحللة الخلية).
  7. ماصة 100 ميكرولتر من الحل ب في جميع الآبار وماصة 60 ميكرولتر من المحللة خلية في آبار الاختبار. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
  8. ماصة 40 ميكرولتر من الحل وإلى جميع الآبار واحتضان لمدة 45 دقيقة في RT.
  9. ماصة 10 ميكرولتر من الحل C لجميع الآبار. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
  10. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في البداية، وقد تبين أن ZRcoum يمكن أن تقدم تقريرا عن نشاط PAD4 في شكل لوحة 96-جيدا. حضنت الآبار مع ZRcoum الركيزة وحضور / غياب PAD4. بعد فترة حضانة المرض من 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وقد تم قياس مضان مع 340/40 - 475/15 نانومتر مرشح (الشكل 2A). كما هو متوقع، ظلت مستويات منخفضة مضان كما fluorophore داخل ZRcoum (أو citrullinated ZRcoum) ظلت في حالة تأمين. عند إضافة فائض التربسين / EDTA إلى حل، كان...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، تم تطوير اختبار قائم على التألق بنجاح يراقب نشاط PAD4. أثبت الاختبار أنه قوي بشكل لا يصدق في عدد من الظروف عالية الإنتاجية وهو متوافق أيضا مع محللات الخليةالكاملة 37.

يتلاشى التقارب بين بروتينات الهيستون وخيوط الحمض النووي المحيطة بها بسبب تحييد الشحنة الموجبة على سلسلة جانب الأرجينين عند الخثار. كان من المتصور أن تحييد سلسلة الأرجينين الجانبية يمكن الاستفادة منها بالمثل لمراقبة نشاط PAD4. من المتوقع أن يقلل تحويل الأرجينين إلى سيترولين بواسطة PAD4 بشكل كبير من قابليته للتحلل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال حزمة بدء تشغيل جامعة ليهاي. نشكر الدكتور والتر فاست على توفير بلازميد GST-PAD4 للتعبير عن البروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرق LB ، ميلر (LURIA-BERTANI)AmrescoJ106-2KGhttp://www.amresco-inc.com< / a>
ampicillin trihydrate (مسحوق أبيض فاتح) ، كواشف فيشر الحيويةفيشر ScientificBP902-25   ؛http://www.fishersci.com< / أ>
Isopropylthiagalactonse (IPTG)Life Technogolies15529-019http://www.lifetechnologies.com
جميع الأملاح العازلة شراء فيشر Scientificمن Fisher Scieintifc ؛ VWR. أكروس. سيجما ألدريتش. الخ.
بروتينو الجلوتاثيون (GSH) agarose Machery-Nagel745500.10مخزن عند 4 درجات ؛ C; http://www.mn-net.com/
كلورو أميدين كايمان للكيماويات 10599مخزن عند -20 درجة ؛ C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLa href = "http://www.sigmaaldrich.com/" >www.sigmaaldrich.com< / a>
Corning / Nunclon MicroWell (96 و 384)الشراء من Corning ؛ Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / برنامجi-controlwww.tecan.com< / a>
Europium Ex. 340/40 Em. مرشح 475/15http://www.perkinelmer.com< / a>
يمكن < لوحات قارئ الألواح الدقيقة Tecan

المراجع

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7(2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676(2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقايسة قائمة على الفلورةركيزة محفزة للفلورةتنشيط التربسينتعبير بروتينيتنقية GSTفحص عالي الإنتاجيةقياس الفلورةتثبيط الإنزيممحلل خلوي خام
رصد القائم على مضان آخر PAD4 عبر برو-مضان الركيزة النظير
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.