يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اشتقاق خلايا T في المختبر من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية

10.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52119

⸱

أكتوبر 14, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

يمكن تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر

إلى الخلايا التائية في المختبر باستخدام نظام الزراعة المشتركة OP9-DL1. يتطلب النجاح في هذا الإجراء اهتماما دقيقا بصيانة الكاشف / الخلية ، والخطوات الرئيسية الحساسة للتقنية. نناقش هنا هذه المعلمات الهامة ونقدم بروتوكولا مفصلا لتشجيع اعتماد هذه التكنولوجيا.

الملخص

أصبح نظام الزراعة المشتركة OP9 / OP9-DL1 طريقة راسخة لاشتقاق أنواع خلايا الدم المتمايزة من الأسلاف الجنينية والمكونة للدم من أصل الفئران والإنسان. يستخدم الآن لمعالجة مجموعة متنوعة متزايدة من الأسئلة الجينية والخلوية والجزيئية المعقدة المتعلقة بتكون الدم ، وهو في طليعة الجهود المبذولة لترجمة هذه النتائج الأساسية إلى تطبيقات علاجية. الإجراءات واضحة ومباشرة وتؤدي بشكل روتيني إلى نتائج قوية. ومع ذلك ، فإن تحقيق التمايز الناجح المكونة للدم في المختبر يتطلب اهتماما خاصا بتفاصيل الحفاظ على الكاشف وزراعة الخلايا. علاوة على ذلك ، يتميز البروتوكول بخطوات حساسة للتقنية ، على الرغم من أنها ليست صعبة ، إلا أنها تهتم وتمارس لإتقانها. نركز هنا على إجراءات تمايز الخلايا الليمفاوية التائية عن الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (mESC). نحن نقدم بروتوكولا مفصلا مع مناقشات حول الخطوات والمعلمات الحاسمة التي تتيح التمايز الخلوي القوي بشكل متكرر في المختبر. من مصلحة المجال النظر في اعتماد هذه التكنولوجيا على نطاق أوسع ، حيث أن لديها القدرة على تقليل استخدام وخفض التكلفة وتقصير الجداول الزمنية للتجارب الأساسية والانتقالية.

المقدمة

تم إنشاء نظام زراعة الخلايا حيث يتم تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESC) إلى الخلايا التائية في المختبر.1 يستغل هذا النظام قدرة إشارات Notch على دفع تمايز الخلايا التائية. 2 تم إنشاء خط خلايا OP9-DL1 عن طريق تحويل خلايا OP9 المشتقة من نخاع العظام3 مع ترابط Notch ، يشبه دلتا 1 (DL1). 4 تنشيط سلسلة إشارات الشق في المختبر يسهل تطور الخلايا التائية لاستبعاد سلالات الخلايا الأخرى. مع إدراج السيتوكينات المناسبة ، يوفر هذا النظام "بيئة مكروية" لثقافة الخلايا تدعم التقدم المتسلسل ل mESC نحو سلالات الخلايا التائية المكونة للدم وفي نهاية المطاف. يدعم هذا النظام تحديد قياس التدفق الخلوي للخلايا التائية في مراحل النمو المختلفة التي تظهر أثناء تطور الخلايا التائية الطبيعية في الغدة الصعترية. للتحقيق في أسئلة مختارة تتعلق بتطور الخلايا التائية ، أصبح هذا الإجراء بديلا جذابا لنماذج الفئران الكاملة في الجسم الحي 5 وطرق زراعة الأعضاء الصعترية للجنين في المختبر المستخدمة لاستنباط نمو الخلايا التائية من السلائف المكونة للدم المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. 6 الميزة الرئيسية لنظام الاستزراع المشترك OP9 هي أنه يتضمن تقنيات استزراع الخلايا القياسية والمباشرة ولا يعتمد على الاستخدام المستمر لحيوانات التجارب.

نتبع بروتوكولا مفصلا ومنشورا مسبقا في تجاربنا باستخدام هذا النهج. 7 لقد استخدمنا هذه التقنية لفحص منتجات التمايز المكونة للدم لاستنساخ mESC غير المتلاعب بها ، واستنساخ mESC عالي الجودة المختار يدويا لصنع أجنةخيميرية 8 واستنساخ ESC المنقول بثبات والذي يخرج مباشرة من اختيار الدواء. 9 لقد لاحظنا أن الحركية الزمنية للتمايز الأولي في المختبر من mESC إلى مستعمرات شبيهة بالأديم المتوسط في هذا النموذج يمكن أن تكون متغيرة بين المستنسخة الفردية. يمكن تقييم المزارع المشتركة mESC-OP9 بصريا للتقدم إلى الأديم المتوسط. في حين أن هذا سيتم الانتهاء منه عادة بحلول اليوم الخامس من الثقافة المشتركة ، من بين المستنسخة الفردية ، يمكن أن يتأخر الإكمال لمدة يوم أو يومين. يجب تحقيق التكوين الكمي (~ 80-90٪) للأديم المتوسط قبل النقل من أجل الحصول على تكوين الخلايا السلفية المكونة للدم (HPC) الأمثل وتكون اللمفاويات القوية. وبالتالي ، عند العمل مع العديد من المستنسخة من mESC ، من الأفضل تأخير هذا المقطع "اليوم 5" حتى تكمل جميع المستنسخة الانتقال إلى مستعمرات تشبه الأديم المتوسط. يتيح ذلك تزامن التطور اللاحق بين المستنسخة بعد نقلها إلى ظروف التمايز المكونة للدم. بعد ثلاثة أيام من مرور تكوينات الأديم المتوسط بنسبة 80-90٪ ، يتم جمع HPCs من الطبقات الأحادية OP9. يمكن زرع الحوسبة عالية الحمل على خلايا OP9 الجديدة للسماح بتمايز سلالات الخلايا الأحادية والحمر والباء. بدلا من ذلك ، يمكن زرع الحوسبة عالية الأداء على خلايا OP9-DL1 ودفعها نحو تطوير الخلايا التائية. يتم توفير جميع ثقافات التمايز في المختبر Flt-3L بدءا من اليوم 5 ، مع إضافة أخرى ل IL-7 بدءا من اليوم 8. تتيح تحليلات قياس التدفق الخلوي التي يتم إجراؤها في نقاط زمنية مختلفة أثناء التجربة مراقبة التقدم عبر مراحل وسلالات التمايز المكونة للدم وتطور الخلايا التائية. تبدأ الخلايا التائية الإيجابية المزدوجة CD4 / CD8 في الظهور بحلول اليوم 16 من الثقافة المشتركة ، وتكون كل من الخلايا الموجبة المفردة DP و CD8 (SP) وفيرة بحلول اليوم 20. تعتمد النتيجة العامة ومتانة الثقافة المشتركة إلى حد كبير على القدرة على التأكد بصريا من اكتمال نقاط التحول التنموية المهمة التي تحدث. يهدف هذا البروتوكول إلى أن يكون دليلا للتعرف على هذه المعالم ، بالإضافة إلى المعايير الهامة الأخرى ، التي تعتبر أساسية للتمايز الناجح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، ومركبات السيتوكينات مهيلم

  1. إعداد وسائل الاعلام الخلية ES باستخدام تعديل Dulbecco لمن النسر المتوسطة (DMEM) مع ارتفاع نسبة الجلوكوز والصوديوم البيروفات. إضافة 20٪ ESC المؤهلين الجنين مصل بقري (FBS) و 1٪ البنسلين / الستبرتوميسين، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ HEPES العازلة، الأحماض الأمينية 1٪ غير الضرورية، 0.1٪ جنتاميسين (50 ملغ / مل) و 0.1٪ ( 55 ميكرومتر) β-المركابتويثانول. تعقيم وسائل الاعلام الخلية ES عن طريق الترشيح.
  2. إعداد وسائل الاعلام OP9 بجعل 1 L ألفا الأساسية الدنيا متوسط ​​(α-MEM) من مسحوق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إضافة 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين. عكس إلى المزيج. تعقيم عن طريق الترشيح إلى قسمين 500 مل مأخوذة.
    ملاحظة: ينصح استخدام وسائل الإعلام مصنوعة من مسحوق، ومن المرجح أن تسفر عن تحسين صيانة الخلايا OP9 والتمايز في نتائج المختبر. وقد أصبح هذا النهج الإجراء لدينا معيار. ومع ذلك، نلاحظ أيضا ثار قمنا في بعض الأحيان يستخدم السائل مسبقة الصنع α-MEM مع النجاح الكافي.
  3. إعداد تجميد وسائل الإعلام من خلال إضافة 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى 90٪ FBS. دوامة بلطف وتعقيم عن طريق الترشيح. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  4. إعداد 2،000x العميد بحري 3 يجند (10 ميكروغرام / مل) عن طريق إذابة البشري المؤتلف العميد بحري 3 يجند (العميد بحري-3L) في كامل وسائل الإعلام OP9 إلى 10 ميكروغرام / مل. قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية. اتبع توصيات المورد بشأن الاستقرار والتخزين.
    ملاحظة: استقرار العميد بحري-3L قصيرة (1 شهر في 4 درجات مئوية أو 3 أشهر في -80 درجة مئوية).
  5. إعداد 1،000x IL-7 (1 ميكروغرام / مل) باستخدام وسائل الإعلام OP9 الكامل. قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية. اتبع توصيات المورد على الاستقرار والتخزين (IL-7 غير مستقر لمدة تصل إلى 12 شهرا في -80 درجة مئوية).
  6. إعداد 1،000x اللوكيميا التثبيطي عامل (LIF) (10 ميكروغرام / مل) من 1:10 تخفيف من 10 7 وحدات من LIF طن وسائل الإعلام خلية ES. متجر قسامة في 4 درجات مئوية. تأكد من ملاحظة تاريخ انتهاء الصلاحية المقدمة من قبل الشركة المصنعة على قارورة قسامة.
    ملاحظة: المنتج هو مستقر في مركزة أو مخففة شكل لا يقل عن 18 شهرا من تاريخ الصنع.
  7. إعداد مهيلم 6 لوحات جيدا قبل إضافة 1.5 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين في كل بئر من لوحة 6 جيدا. ترك الأطباق في غطاء العقيمة في درجة حرارة الغرفة مع أغطية على، مما يسمح لا يقل عن 30 دقيقة للطلاء. ويمكن أيضا أن تترك الأطباق في الحاضنة بين عشية وضحاها مرطب. إزالة أي حل الجيلاتين بقايا الحق قبل البذر الخلية. لا تدع حل الجيلاتين يجف تماما في البئر.

2. إعداد وصيانة الخلايا المغذية والفأر الخلايا الجذعية الجنينية (مسك)

ملاحظة: احتضان كل الخلايا في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

  1. ذوبان الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEF)
    1. سريعة الذوبان قارورة المجمدة (~ 5 × 10 6 خلايا / قارورة) من ميتوميسين (أو القبض ميتوتيكلي المعالجة C) MEFs ونقلها إلى أنبوب 15 مل.
    2. إضافة 8 مل من وسائل الاعلام الخلية ES لإذابة الخلايا، بطريقة الإفلات من الحكمة أن تضعف تدريجيا DMSO المتوسطة من التجمد.
    3. خلايا الطرد المركزي في 400 ز س في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إزالة بعناية وطاف resuspend الكرية خلية في 3 مل من وسائل الاعلام الخلية ES.
    4. إعداد أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع 33 مل من قبل تحسنت وسائل الاعلام الخلايا ES. إضافة 3 مل من MEFs معلق لجلب الحجم النهائي إلى 36 مل.
    5. توزيع 3 مل من MEFs معلق في كل بئر من صفيحتين مهيلم 6 جيدا. وضع لوحات في الحاضنة لمدة ست ساعات على الأقل للسماح للخلايا لإرفاق وانتشرت قبل بذر mESCs عليها. قد تكون هذه الطبقات المغذية القبض ميتوتيكلي صالحة للاستعمال لعدة أيام بعد البذر الأولي، إن وسائل الإعلام الخاصة يتم تغيير كل 2-3 أيام.
      ملاحظة: يمكن أيضا MEFs القبض طازجة استخدامها.
    6. mESCs البذر
      1. سريعة الذوبان قارورة مع استنساخ مسك المجمدة في 37 ° C حمام المياه وإعداد الخلايا كما هو موضح في 2.1.1-2.1.3.
        ملاحظة: نحن تجميد 2 قارورة من مسك من بئر متموجة من لوحة 6 جيدا.
      2. إزالة وسائل الاعلام من جانب واحد (لكل مسك استنساخ) من لوحة 6 جيدا مع الطبقات الوحيدة MEF اعتقال (المعد في الخطوة 2.1.5) وبذر مل 3 من mESCs على رأس أحادي الطبقة MEF. إضافة 3 ميكرولتر من 1،000x LIF (10 نانوغرام / مل). العودة الأطباق في الحاضنة.
    7. ES صيانة الخلية والتربسين بوساطة مرور
      ملاحظة: تغيير وسائل الإعلام يوميا، أو تقسيم على أساس التقاء مسك. على النحو الأمثل، والحصاد وانقسام / إعادة لوحة الخلايا كل يوم.
      1. إزالة الخلايا ES سائل الإعلام ويغسل mESCs مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقيقة.
      2. جمع الخلايا trypsinized وتحويلها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. بقوة الماصة تعليق خلية لتفتيت كتل من مالمجالس الاقتصادية والاجتماعية. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام الخلية ES الكامل لتعليق خلية لتحييد التربسين.
      3. تدور في الخلايا ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه في 3 مل ES سائل الاعلام الخلية.
      4. إزالة وسائل الاعلام من 6 لوحات جيدا تحتوي على إعداد الطبقات الوحيدة MEF المعتقلين. إضافة كمية مناسبة من تعليق خلية (استنادا إلى نسبة الانقسام المطلوب) في 3 مل من وسائل الاعلام الخلية ES إلى كل بئر إلى أن المصنف. إضافة 3 ميكرولتر من 1،000x LIF. ومتموجة مسك تقسيم جيدا 1: 6 وسوف يكون جاهزا للمرور في 2 يوما.
    8. OP9 / OP9-DL1 صيانة الخلايا
      1. ذوبان الجليد قارورة من الخلايا OP9 (اتبع الخطوات 2.1.1-2.1.3 باستخدام وسائل الإعلام OP9)
      2. إضافة 7 مل سائل الإعلام OP9 إلى 10 سم صحن زراعة الأنسجة. إضافة 3 مل من الخلايا معلق بطريقة الإفلات من الحكمة، وتوزيع الخلايا في جميع أنحاء اللوحة. وضع الخلايا بين عشية وضحاها في الحاضنة.
      3. تحقق التقاء الخلايا OP9 في اليوم التالي. إذا كان الطبق يحتوي على العديد من خلايا ميتة طافية، ريمولقد وسائل الإعلام وإضافة 10 مل من وسائل الإعلام OP9 الطازجة. إعادة الإناء إلى الحاضنة إذا لم يتم ملاحظة التقاء كامل تقريبا. سبليت (باستخدام التربسين) 1: 4 في القريب أحادي الطبقة متموجة OP9.
        ملاحظة: يجب أن تصل إلى نفس المستوى لوحات التقاء مرة أخرى في حوالي 2 يوما. والحرص على عدم السماح لخلايا OP9 تصبح أكثر متموجة.
      4. تجميد المقاطع الأولى من خلايا OP9 كما أسهم التوسع.
        ملاحظة: نحن تجميد 2 قارورة من الخلايا OP9 متكدسة بالقرب من واحدة 10 سم الطبق. كل قارورة من الأسهم التوسع يمكن نشر مزيد من العمل لخلق الأسهم التي يتم استخدامها لاحقا في مسك التجارب ثقافة مشتركة. إبقاء جميع الأسهم OP9 مجمدة في النيتروجين السائل وليس في الفريزر -80 درجة مئوية، لأن التقلبات في درجات الحرارة يمكن أن تؤثر سلبا على جودة يتجمد.

    3. OP9-DL1 الإجراءات المشارك الثقافة

    1. الاستعدادات ثقافة مشتركة
      1. ما يقرب من أسبوع واحد قبل الشروع في الثقافة المشتركة، ذوبان الجليد MEFs، mESCs وستو الخلايا OP9 العملCKS. بما أنه لا حاجة خلايا OP9-DL1 حتى اليوم ثقافة مشتركة 8، ذوبان الجليد الخلايا OP9-DL1 خلال الأيام الثلاثة الأولى بعد ثقافة مشتركة البدء. المحافظة أو تجميد جميع الخلايا حسب الحاجة.
      2. تحديد العدد الأولي من 10 سم لوحات مع الطبقات الوحيدة الخلية OP9 أعدت لتصل إلى 80٪ على التقاء شارك في ثقافة اليوم 0 بناء على حجم التجربة (على سبيل المثال، عدد من الحيوانات المستنسخة مسك أن تكون متباينة، وعدد من النقاط الزمنية ثقافة مشتركة ل يتم تحليلها). للتحضير لالثقافة المشتركة، وتقسيم بالقرب طبق متموجة من OP9 الخلايا بين 1: 4 و 1: 6 قبل يومين من متى تكون هناك حاجة إلى الطبقات الوحيدة.
        ملاحظة: يحتاج المرء لوحة واحدة على الأقل في ESC استنساخ. عادة، المصنف على ESC استنساخ واحد على لوحة واحدة (كما هو موضح أدناه) يوم 0 ينبغي أن تسفر خلايا كافية لبذر ست لوحات في اليوم مرور 5. كل يوم سوف 5 لوحة تمكين نقطة زمنية لاحقة تحليل واحد.
      3. انه ستكون هناك حاجة باستمرار الطبقات الوحيدة لOP9 شارك في ثقافة المرور، ورعاية لmainta دائمافي عدد كاف من لوحات إضافية الثقافة OP9 بالتوازي مع الثقافة المشتركة.
    2. 0 اليوم: بدء شارك في ثقافة
      1. جمع مسك كما في 2.3.1-2.3.4. عد الخلايا.
      2. لكل استنساخ مسك إعداد 5 × 10 4 مسك في 10 مل من وسائل الإعلام OP9 لكل لوحة.
        ملاحظة: على الرغم من أننا لم تستخدم، نلاحظ أن وسيلة بديلة تتكون من α-MEM 10٪ FBS، و5 × 10 -5 M تم الإبلاغ أيضا عن β-المركابتويثانول لاستخدامها في التمايز المشترك الثقافات 10.
      3. إزالة وسائل الإعلام القديمة من OP9 الأطباق وإضافة 10 مل من تعليق لمسك الأطباق مع الحرص على توزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء اللوحة. ضع الأطباق في الحاضنة 37 ° C.
    3. يوم 3: تغيير وسائل الإعلام
      1. إزالة الأطباق من الحاضنة ومراقبة تحت المجهر. يجب المستعمرات تبدأ لانقاص اللمعان ويبدو بالارض.
      2. إزالة وسائل الاعلام من أطباق بلطف وإضافة 10 مل من OP9 جديدةوسائل الاعلام.
      3. العودة الأطباق المشارك الثقافة الحاضنة. مراقبة بصريا تشكيل مستعمرة مثل الأديم المتوسط ​​يوميا إبلاغ توقيت OP9 إعداد أحادي الطبقة المغذية للمرور القادم (يوم 5)، والتي لا ينبغي أن تنفذ حتى ~ 80-90٪ من المستعمرات عرض بصريا مثل الأديم المتوسط ​​التشكل. تأجيل الأقصى للخطوة نقل خلية يوم 5 هو 2 يوما.
    4. يوم 5: التربسين مرور بوساطة مع ما قبل الطلاء.
      ملاحظة: إعداد مقدما عدد كاف من أطباق 10 سم مع الخلايا OP9 متكدسة على النحو الأمثل. المضي قدما في الخطوات المقبلة إلا إذا كانت الثقافات المشتركة بصريا عرض الميزات الموضحة في الخطوة 3.3.3 (انظر ممثل النتائج أيضا).
      1. إزالة وسائل الاعلام من الأطباق ثقافة مشتركة. إضافة 4 مل PBS لغسل. دوامة PBS وإزالتها. إضافة 4 مل من 0.25٪ التربسين ووضع الأطباق في الحاضنة لمدة 5 دقائق ~.
      2. تعطيل طبقة من الخلايا trypsinized من قبل pipetting قوية، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء المفرطة، حتىويتحقق متجانسة، تعليق خلية في الغالب واحد.
      3. إضافة 4 مل من وسائل الإعلام OP9 كاملة ومزيج من قبل pipetting. نقل الخلايا إلى جديد وفارغ 10 سم طبق وضعها في الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا OP9 التمسك الطبق. هذا "ما قبل الطلاء" خطوة يقلل من عدد الخلايا OP9 نقل إلى الخطوة التالية من ثقافة مشتركة.
      4. تحضير 50 ​​مل أنابيب الطرد المركزي مع مصافى الخلية 40 ميكرومتر.
      5. جمع الخلايا غير ملتصقة من طبق مطلي قبل وتمريرها من خلال مصفاة الخلية في أنبوب. غسل الطبق برفق مع 6 مل من برنامج تلفزيوني وتمريرها من خلال نفس مصفاة، وترك الخلايا OP9 المرفقة خلف.
      6. خلايا الطرد المركزي في 400 ز × 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend الخلايا مكعبات في 3 مل من وسائل الإعلام OP9 الكامل. عد الخلايا.
      7. إزالة وسائل الإعلام من 10 سم لوحات مع خلايا OP9 متكدسة على النحو الأمثل.
      8. عن كل نقطة زمنية التحليل، البذور 5 × 10 5 خلية أحادية على OP9طبقة في 10 مل الحجم النهائي.
      9. إضافة 5 نانوغرام / مل البشري المؤتلف العميد بحري-3L ووضع الأطباق في الحاضنة.
    5. يوم 8: لدم السلف الخلية (HPC) جمع
      ملاحظة: إعداد مقدما عدد كاف من 6 لوحات جيدا مع الطبقات الوحيدة OP9 أو OP9-DL1 الخلية بحيث أنها ستكون ~ 80٪ متكدسة في الوقت المناسب لهذه الخطوة.
      1. تحضير 50 ​​مل أنابيب الطرد المركزي مع 40 ميكرون المصافي.
      2. إزالة الأطباق من الحاضنة ومراقبة تحت المجهر. عناقيد لامعة من HPCS يجب أن يرفق فضفاضة لأحادي الطبقة OP9. جمع أكبر عدد ممكن من هذه الخلايا ممكن عن طريق غسل (ولكن ليس بشكل مفرط تعطيل) أحادي الطبقة OP9 مع ماصة ووسائل الإعلام الموجودة على الطبق. لمنع الرغوة، وترك دائما لا يقل عن 1 مل من وسائل الإعلام في غيض من الماصة خلال هذه المجموعة HPC / خطوة الغسيل.
      3. تمر الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب. إضافة 8 مل PBS لنفس لوحة وتحقق تحت المجهر إذا كان كل HPCS نحنإعادة جمعها. كرر الخطوة الغسيل / جمع مع برنامج تلفزيوني و(إذا لزم الأمر) مع الغسيل أكثر قوة. سلالة الخلايا في الأنبوب الذي يحتوي بالفعل على خلايا من نفس اللوحة.
      4. خلايا الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
      5. إعداد مزيج الرئيسي من 3 مل (لكل لوحة المصنفة في يوم 5) وسائل الإعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل العميد بحري-3L و 1 نانوغرام / مل IL-7.
      6. إزالة وطاف بيليه resuspend في وسائل الإعلام OP9 مع العميد بحري-3L + IL-7 مزيج الرئيسي (3 مل لكل 10 سم طبق معالجتها). نقل الخلايا التي جمعت من كل لوحة في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا مع الخلايا OP9.
        1. من أجل دفع الخلايا نحو حيدي، خلية B أو الأنساب محمر، خلايا البذور التي تم جمعها على خلايا OP9. لاستخلاص خلايا T، خلايا البذور على الطبقات الوحيدة الخلية OP9-DL1.
      7. وضع 6 لوحات جيدا في الحاضنة.
    6. يوم 10: تغيير وسائل الإعلام
      1. إعداد أنبوب الطرد المركزي 15 مل لكل متميز مسك استنساخ نوع من الخلايا المغذية-combinaنشوئها في ثقافة مشتركة.
      2. إعداد مزيج الرئيسي من وسائل الاعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل من العميد بحري-3L و 1 نانوغرام / مل من IL-7. إعداد 3 مل لكل بئر.
      3. جمع بلطف وسائل الإعلام من كل بئر من لوحة 6 جيدا يجمع بين وسائل الإعلام من آبار متعددة تحتوي على نفس ESC-استنساخ نوع من الخلايا المغذية الجمع.
      4. إضافة 2 مل من مزيج الرئيسي وسائل الإعلام OP9 (انظر 3.6.2) في كل بئر.
      5. الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها في 400 ز س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend كل بيليه (صغير جدا إذا مرئية) في 1 مل من مزيج الرئيسي OP9 سائل الإعلام (انظر 3.6.2) لكل بئر جمعها أصلا في الخطوة 3.6.3.
      6. توزيع 1 مل من الخلايا مرة أخرى في كل بئر من التي تم جمعها وسائل الإعلام أصلا ليصل حجم في كل بئر إلى 3 مل. العودة الأطباق إلى الحاضنة.
    7. اليوم 12: لا التربسين مرور
      ملاحظة: إعداد مقدما عدد كاف من الأطباق 6 جيدا مع الخلايا OP9 أو OP9-DL1 بحيث سيتم متموجة على النحو الأمثل في الوقت المناسب لهذا لياليتيب. يوم 12 هو المثل الأعلى للالتدفق الخلوي تحليلات محمر النامية، وحيدي، وخلايا T مرحلة مبكرة.
      1. إعداد مزيج الرئيسي (3 مل لكل بئر التي ستستمر في التعاون ثقافة) وسائل الإعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل من العميد بحري-3L و 1 نانوغرام / مل من IL-7.
      2. تحضير 50 ​​مل أنابيب الطرد المركزي مع 40 ميكرومتر مصافى (واحد لكل ESC استنساخ-المغذية نوع من الخلايا في الجمع المشارك الثقافة).
      3. بقوة ماصة وسائل الإعلام الموجودة في كل بئر إلى تفصيل جميع الخلايا (بما في ذلك أحادي الطبقة) في البئر. تواصل مع pipetting لقوي حتى يتحقق حالة تشبه تعليق خلية واحدة.
      4. تمر الخلايا التي تم جمعها من خلال مصفاة في أنبوب. أضف 3 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر لغسل وجمع كل الخلايا المتبقية. تمر الخلايا من خلال نفس مصفاة. الجمع بين الخلايا من آبار متعددة تحتوي على نفس ESC-استنساخ نوع من الخلايا المغذية الجمع.
      5. تجاهل مصفاة الخلية المستخدمة وإزالة ما يعادل قسامة إلى بئر واحدة (~ 6 مل) لأي المطلوبالتدفق الخلوي (أو غيرها) التحاليل التي يتعين الاضطلاع بها في ذلك اليوم. تخزين هذه مأخوذة على الجليد قبل الاستخدام.
      6. خلايا الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. resuspend الكرية من 50 مل أنابيب الطرد المركزي في 3 مل من مزيج الرئيسي لكل بئر لإعادة المصنف. إضافة 3 مل لكل بئر من كل تعليق الخلية إلى نوع من الخلايا المغذية المناسبة ووضع الأطباق في الحاضنة.
    8. يوم 14: تغيير وسائل الإعلام
      1. اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.6.
    9. اليوم 16: لا التربسين مرور
      ملاحظة: إعداد مقدما أطباق 6 جيدا الخلايا OP9 أو OP9-DL1 متكدسة على النحو الأمثل لهذه الخطوة.
      ملاحظة: يوم 16 هو المثالي لتدفق تحليل الخلوي من الخلايا الليمفاوية B وخلايا T المرحلة المتوسطة.
      1. اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.7.
    10. يوم 18: تغيير وسائل الإعلام
      1. اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.6.
    11. اليوم 20: لا التربسين مرور
      ملاحظة: يوم 20 طق مثالية لتحليل التدفق الخلوي من منتصف إلى أواخر مرحلة تطوير خلايا T.
      1. اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.7. إذا رغبت في ذلك، وتحمل تمييز الخلايا الماضي يوم 20 التغيير سائل الإعلام بالتناوب ولا التربسين الممرات كل يومين، مع الرصد اليومي لمعدل التوسع اللمفاويات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عندما نمت على MEFs بحضور LIF، mESCs يمكن الحفاظ في حالة غير متمايزة. في ظل ظروف مثالية، فإنها تبدو وكأنها مستعمرات المدمجة للخلايا تحيط بها هالة لامعة في المرحلة النقيض المجهر (الشكل 1). يجب مراقبة هذه الثقافات يوميا. اعتمادا على التقاء الخلايا، وسائل الإعلام يمكن تغيير أو الخلايا يمكن تقسيم. يجب أن المستعمرات المجاورة مسك لم يأت الى نقطة الاتصال مع بعضها البعض. والعادية، والثقافة الصحية لmESCs غير متمايزة هي نقطة انطلاق أساسية لفي المختبر الخلايا التائية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد استخدمت نظام OP9-DL1 ثقافة مشتركة لدراسة دور الجينات منتجات مختلفة خلال تطوير أنواع خلايا الدم من الخلايا الجذعية. 8،12،13 وقد ثبت أيضا نموذج فعال لدراسة وظيفة الجين DNA التنظيمي خلال تمايز الخلايا. 9،14 باستخدام هذا النهج كبديل لنماذج الماوس كلها يمكن أن تسفر عن وفورات كبيرة في الوقت والتكلفة من التجارب التي تعالج العديد من الأسئلة الأساسية في تكون الدم. ومع ذلك، والتكيف مع هذا البروتوكول لهذه الأغراض يتطلب الاطلاع على التباين المحتمل بين الحيوانات المست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر جون كيم على مساعدة الخبراء في قياس التدفق الخلوي. يتم دعم البحث في مختبرات المؤلفين من قبل برنامج SCORE التابع للمعاهد الوطنية للصحة (منحة SC1-GM095402 إلى BDO) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (إلى JCZP). J.C.Z.P. مدعوم من قبل كرسي أبحاث كندا في علم المناعة التنموي. يتم دعم البنية التحتية للبحوث الطبية الحيوية في كلية هانتر جزئيا من قبل برنامج مراكز أبحاث المعاهد الوطنية للصحة في مؤسسات الأقليات (RCMI) عبر MD007599 المنح. كما نقدر برنامج علوم الخلايا الجذعية بولاية نيويورك (NYSTEM) لدعمه لبدء أبحاث الخلايا الجذعية في كلية هانتر من خلال C023048 المنح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMCorning15-013-CV
الخلايا الجذعية المؤهلة FBSGemini100-125
البنسلين / الستربتومايسينبالحرارة Corning30-002-CI
L-alanyl L-glutamineCorning25-015-CI
HEPES buffer   ؛MilliporeTMS-003-C
الأحماض الأمينية غير الأساسيةThermoScientificSH30853.01
محلول جنتاميسين ريجنت (50 مجم / مل) LifeTechnologies 15750-060
بيتا ميركابتو إيثانول (55 مليمتر) في DPBSLife Technologies 21985-023
وحدة التصفيةMilliporeSCGPU05RE0.22 & mu ؛ م PES غشاء
ثقافة الخلية الصف المياهCorning25-055-CM
& alpha ; -MEM   ;لايف تكنولوجيز 12000-022مسحوق ، إعادة التكوين حسب توصية التصنيع
بيكربونات الصوديوم   ؛SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03اختبار القطع الفردية المطلوبة 
ثنائي ميثيل سلفوكسيد   ؛سيجماD2650
المؤتلف البشري Flt-3 LigandR & D Systems308-FK
المؤتلف الفئران IL-7PeproTech217-17
LIF  MilliporeESG1107
Utrapure المياه مع 0.1٪ جيلاتينMilliporeES-006-B
MEFs mitomycin C المعالجةMilliporePMEF-CFيمكن استخدام أي MEFs تم القبض عليها انقساميا
DPBSCorning21-031-CV
مصفاة خلوية (40 & mu; م)فيشر22363547
صحن زراعة الأنسجة 100 × 20 ممBD Falcon353003
Multiwell 6-wellBD Falcon353046
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقةالولايات المتحدة الأمريكية Scientific1615-5500
15 مل أنابيب الطرد المركزيBD Falcon352096
50 ملBD Falcon352070
5 مل البوليسترين أنبوب دائري القاع مع غطاء مصفاة الخليةBD Falcon352235أنابيب ل FACS & nbsp ؛
خلايا ES R1ATCCSCRC-1011
OP9من مستودع خلايا مختبر Riken (اليابان).
خلايا OP9-DL1       يمكن طلب الخلايا من Z & uacute ؛ ñ iga-Pflü مختبر CKER.
برنامج FlowJo تحليلات بياناتTree Star
مقياس التدفق الخلويBDFACScan و FACSCalibur و FACSVantage في مختبرنا
المعطلة يمكن الحصول على خلايا تم استخدام FACS

المراجع

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تمايز الخلايا التائيةنظام الزراعة المشتركة OP9الخلايا السلفية المكونة للدمتحليل قياس التدفق الخلويصيانة المزارع الخلويةالطبقة الأحادية للخلايا السدويةتطور اللمفاويات التائيةنموذج في المختبرإيجابية مزدوجة لـ CD4 وCD8
اشتقاق خلايا T في المختبر من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.