يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الكشف عن في الموقع مجمعات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

13.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52139

⸱

يناير 20, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول كيف القرب ربط الفحص يمكن استخدامها للكشف في الموقع تفاعلات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة العصبي العضلي اليرقات تقاطع. مع هذه التقنية، وترد أقراص كبيرة وهو جين تاو لى شاو تاي لتشكيل مجمع في المنطقة بعد المشبكي، وهي جمعية التي سبق تحديدها من خلال المشاركة في مناعي.

الملخص

< p class = 'jove_content'> Discs large (Dlg) هو عضو محفوظ في عائلة غوانيلات كيناز المرتبط بالغشاء ، ويعمل كبروتين سقالات رئيسي عند التقاطع العصبي العضلي اليرقي (NMJ) في ذبابة الفاكهة. أظهرت الدراسات السابقة أن توزيع ما بعد المشبكي ل Dlg في اليرقات NMJ يتداخل مع توزيع Hu-li tai shao (Hts) ، وهو متماثل مع Adducins الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أن Dlg و Hts يشكلان مركبا مع بعضهما البعض بناء على تجارب الترسيب المناعي المشترك التي تنطوي على محللات الذباب البالغة الكاملة. نظرا لطبيعة هذه التجارب ، لم يكن معروفا ما إذا كان هذا المركب موجودا على وجه التحديد في NMJ أثناء تطور اليرقات. < p class = 'jove_content'> Proximity Assay (PLA) هي تقنية تم تطويرها مؤخرا وتستخدم في الغالب في زراعة الخلايا والأنسجة التي يمكنها اكتشاف تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع. في هذا الفحص ، يتم تحضين العينات بأجسام مضادة أولية ضد البروتينين المعنيين باستخدام الإجراءات الكيميائية المناعية القياسية. ثم يتم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية باستخدام زوج مصمم خصيصا من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع قليل النوكليوتيدات ، والتي تسمى مجسات PLA ، والتي يمكن استخدامها لتوليد إشارة فقط عندما يرتبط المجسان على مقربة من بعضهما البعض. وبالتالي ، يمكن تصور البروتينات الموجودة في مجمع. هنا ، يتم توضيح كيف يمكن استخدام PLA للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع في ذبابة الفاكهة يرقات NMJ. يتم تنفيذ هذه التقنية على مستحضرات عضلات جدار جسم اليرقات لإظهار أن مركبا بين Dlg و Hts موجود بالفعل في منطقة ما بعد المشبكي من NMJs.

المقدمة

ذبابة الفاكهة أقراص كبيرة (DLG) هو عضو الحفظ من guanylate كيناز الأسرة المرتبطة غشاء السقالات البروتينات التي تساعد في تنظيم جمعية مجمعات البروتين كبيرة في مواقع محددة من غشاء البلازما. حددت أصلا باعتبارها البروتين القامع الورم، ويخدم DLG كمقياس مهم من الظهارية apicobasal قطبية 1،2،3. يخدم أجهزة ... كذلك وحدة نمطية السقالات الرئيسية في الوصل العصبي العضلي (NMJ) من الخلايا العصبية الحركية glutamatergic خلال نمو اليرقات 4. أجهزة ... تلعب أدوارا متنوعة في NMJ اليرقات، ويعتمد تعدد النمط الظاهري على قدرته على ربط مع بروتينات متعددة 5،6. واحدة من هذه البروتين هو هو جين تاو لى شاو تاي (HTS)، ونديد إلى adducins الثدييات التي أساسا وصفت في ما يخص دورهم في تنظيم الأكتين-إسبكترن الهيكل الخلوي 7. وقد سبق يتبين أن DLG وHTS يمكن أن تشكل مجمع مع بعضها البعض على أساس في المختبر تجارب شارك في مناعي التي تنطوي على الكبار كله لست] ذبابة 8. عيب واحد من هذه النتائج، ومع ذلك، هو أنها لا تشير إلى هذا حيث أشكال معقدة. مع استخدام المناعية، ويلاحظ توزيعات DLG وHTS إلى التداخل في الغشاء بعد المشبكي من لل NMJs اليرقات، ولكن هل هم في مجمع في هذه المنطقة 8؟ كما هو مبين في الآونة الأخيرة وأكبر من التفصيل هنا، ويستخدم القرب ربط الفحص (PLA) للبحث عن وجود ارتباط بين الوضع الطبيعي DLG وHTS في خصيصا في اليرقات NMJ 27.

جيش التحرير الشعبى الصينى هو تقنية جديدة نسبيا تستخدم في الغالب في الخلايا والأنسجة الثقافة التي يمكن الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في الموقع 9. في هذا الاختبار، يتم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية ضد اثنين من البروتينات في المصالح مع زوج من الأجسام المضادة الثانوية أنواع محددة، ووصف تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، والتي يتم تصريفها إلى أليغنوكليوتيد] (الشكل 1A، B). إذا كان البروتين اثنينالصورة هي على مقربة من بعضها البعض (أي في غضون بضع عشرات من نانومتر)، والمسافة بين تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى المرفقة يمكن سد من خلال التهجين اثنين من [أليغنوكليوتيد موصل إضافية (الشكل 1C). في هذا التشكل، وينتهي خالية من أليغنوكليوتيد] موصل قريبة بما فيه الكفاية لاجراء اتصالات مع بعضها البعض، وجزيء DNA دائرية مغلقة يمكن تشكيلها على ربط في الموضع (1D الشكل). يخدم جزيء DNA دائري كنموذج لفي الموقع التضخيم دائرة المتداول، والذي وتستعد قبل واحدة من [أليغنوكليوتيد مترافق إلى تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى (الشكل 1E). تسلسل داخل تضخيمها، والمنتج DNA concatemeric الناتجة عندئذ يمكن تصور مع fluorescently المسمى، تحقيقات قليل النوكليوتيد التكميلية (الشكل 1F). منذ يبقى تضخيم الحمض النووي تعلق على واحدة من تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، وتوطين التحت خلوية من البروتين البروتين التفاعل داخلهاالأنسجة غ يمكن التأكد بسهولة.

ويشيع استخدام عدة أساليب للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات بما في ذلك تقنيات المختبر مثل شارك في مناعي، وسحب إلى أسفل المقايسات والخميرة فحص يومين الهجين، وتقنيات الجسم الحي مثل نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) وثنائي الجزيء الإسفار التكملة ( BiFC). وشرك من التقنيات في المختبر هو أنها لا تعرف أين التفاعل يحدث التطور الطبيعي، في حين تشمل المذكورة آنفا في الجسم الحي تقنيات التعبير الاصطناعي من البروتينات الانصهار التي قد لا تعكس السلوك الأصلي من نظرائهم الذاتية. واحد الميزة الرئيسية لجيش التحرير الشعبى الصينى هو أنه قادر على تحديد داخل الأنسجة توطين التحت خلوية من interactors البروتين الذاتية التي هي على مقربة من بعضها البعض، ومن المرجح تشكيل المعقدة، مع درجة من التقارب المطلوب لتوليد إشارة يجري مقارنة لFRET وBiFC. PLA يمكن الكشف عن التفاعلات مع خصوصية عالية وحساسية نظرا لاقتران الاعتراف الأجسام المضادة والتضخيم DNA. وهكذا، يمكن فحص توليد منفصلة، ​​وإشارات مضيئة في شكل نقاط والتي تكشف عن الموضع الدقيق للتفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن المستضدات مرئية بالكاد. وأخيرا، جيش التحرير الشعبى الصينى هو تقنية بسيطة نسبيا على القيام بها، ويستغرق مدة لا تزيد على إجراء المناعى القياسية لإكمال. ولذلك، يوفر PLA ميزة الفنية اكثر من غيرها من المقايسات التفاعل البروتين البروتين التي غالبا ما تعاني من الأوقات إعداد طويلة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها واسعة النطاق.

يوضح هذا البروتوكول كيف PLA يمكن تطبيقها على ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ لغرض الكشف عن الذاتية البروتين البروتين التفاعلات في الموقع. هنا، يتم تنفيذ جيش التحرير الشعبى الصينى على اليرقات الاستعدادات العضلات جدار الجسم حيث يتم عرض DLG وHTS في الوجود الواقع في مجمع في المنطقة بعد المشبكي من لل NMJs. جيش التحرير الشعبى الصينى لم تستخدم سابقا لدراسة NMJ اليرقات، وهناك في الوقت الحاضر سوى عدد قليل من الأبحاث المنشورة التي استخدمت هذا الاختبار في الأنسجة ذبابة الفاكهة. ومن المؤمل أن مزيدا من التعرض لجيش التحرير الشعبى الصينى للمجتمع ذبابة الفاكهة سوف يؤدي إلى زيادة استخدامه كأداة إضافية لتكمل الأخرى، أكثر شيوعا البروتين البروتين المقايسات التفاعل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الجسم إعداد ستريت

تم تنفيذ إعداد الطور الثالث الجدران الجسم اليرقات (لدراسة لل NMJs التي يعصب عضلات جدار الجسم) كما هو موضح سابقا في برنت 10 آخرون، أو راماشاندران وBudnik 11،12، ولكن مع بعض التعديلات: ملاحظة.

  1. تشريح
    1. رفع مخزون الطاير والصلبان عند 25 درجة مئوية لمدة 5-6 أيام باستخدام الإجراءات القياسية 13.
    2. اختيار الزحف يرقات العمر الثالثة من قوارير أو زجاجات باستخدام ملقط غرامة.
    3. غسل اليرقات في طبق بتري صغيرة تحتوي على الفوسفات عازلة المالحة (PBS) لإزالة أي جزيئات الطعام.
    4. وضع يرقة واحدة على قرص sylgard وتزج به في بضع قطرات من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. باستخدام PBS الجليد الباردة سيساعد الصاعقة اليرقة مما يجعل من الاسهل للتلاعب. في جميع أنحاء تشريح، وضمان أن إعداد الغارقة دائما في برنامج تلفزيوني لمنعها من الجفاف.
    5. ضع لاوكالة الخطوط الجوية مع الجانب الظهري لها تواجه حتى أن اثنين من مساحات القصبة الهوائية مرئية تحت المجهر تشريح (الشكل 2A). باستخدام ملقط لفهم دبوس minutien، دبوس اليرقة إلى أسفل في نهاية الخلفي بالقرب من الفتحات التنفسية (الشكل 2B). مع دبوس آخر، يخترق من خلال بشرة في نهاية الأمامية بالقرب من السنانير الفم. تمتد برفق اليرقة خارج بالطول، ثم يعلقون عليه (الشكل 2B).
    6. باستخدام مقص تسليخ مجهري، قرصة نهاية الخلفي بالقرب من دبوس لخلق فتحة صغيرة. يجب أن يكون شق سطحي يكفي لتمرير فقط من خلال بشرة.
    7. وضع غيض من شفرة الجزء السفلي من مقص في شق، وقطع على طول على طول خط الوسط الظهرية بين اثنين من مساحات القصبة الهوائية (الشكل 2C). يشير ريش مقص صعودا طفيفا عند قطع لتجنب إتلاف بطني عضلات جدار الجسم.
    8. إجراء شق صغير الأفقي الأمامي قليلا لمنصبدبوس وضعت eriorly (الشكل 2C). جعل شق آخر مماثل الخلفي قليلا إلى دبوس وضعت الأمامية (الشكل 2C). يجب أن الشقوق يمر من خلال بشرة.
      ملاحظة: شقوق ثلاثة من خطوات 1.1.7 و 1.1.8 مجتمعة يجب اشبه " figure-protocol-1 "عند اكتماله، أي يجب أن تنتج رفرف اليسارية واليد اليمنى على الجانب الظهري من الجسم اليرقات.
    9. تنظيف بعناية الأعضاء الداخلية مع ملقط. وإضافة بضع قطرات قوية من برنامج تلفزيوني مساعدة تهجير أجهزة خارج الجسم اليرقات، مما يجعل من الاسهل لإزالتها. تجنب بدس الجسم اليرقات لأنها سوف تسبب ضررا على عضلات جدار الجسم.
    10. فض الجسم اليرقات مفتوحة ويعلقون الزوايا أسفل (الشكل 2D). عندما تعلق، وتمتد جدار الجسم أفقيا ورأسيا لتشكيل المستطيل المتأزم بالتساوي (SEالبريد الشكل 2G للشكل)، مع الحرص على عدم المسيل للدموع عضلات جدار الجسم في هذه العملية.
    11. الانتهاء من إزالة أي الأعضاء الداخلية المتبقية (الشكل 2E).
  2. تثبيت وPermeabilization
    1. تزج الجدران الجسم معلقة في عدة قطرات من الحل بوان. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد. بدلا من ذلك، استخدم بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) باعتبارها تثبيتي بديل. احتضان لمدة 30 دقيقة.
    2. شطف ثلاث مرات مع الفوسفات عازلة المالحة مع تريتون (PBT).
    3. باستخدام ملقط غرامة، وإزالة بعناية دبابيس ونقل الجدران الجسم عن طريق أركانها إلى siliconized و0.65 مل أنبوب microcentrifuge.
    4. تخزين الجدران الجسم في PBT في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة لجيش التحرير الشعبى الصينى. لأفضل النتائج، وبدء المناعية الجدران الجسم في خلال يوم أو يومين من تشريح.
      ملاحظة: لانقاذ على الكواشف وضمان أن يتم التعامل مع جميع الجدران الجسم بالتساوي أثناء الفحص، يمكن وضعها الأنماط الجينية المختلفة في واحدأنبوب. الأنماط الجينية يمكن تمييزها عن طريق خفض زوايا الجدران الجسم بطريقة مختلفة (انظر الشكل 2F للحصول على أمثلة).

2. المناعية

تم تنفيذ المناعية من الطور الثالث الجدران جسم اليرقات كما هو موضح سابقا في برنت وآخرون 14 و راماشاندران وBudnik 11، ولكن مع بعض التعديلات 11،14: ملاحظة.
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ومع الإثارة لطيف ما لم ينص على خلاف ذلك.

  1. حجب
    1. غسل الجدران الجسم مع PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    2. منع مع 1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) لمدة 1 ساعة.
  2. المناعية
    1. احتضان الجدران الجسم مع الماوس والأرنب الابتدائي أجسام مضادة ضد اثنين من البروتينات ذات الاهتمام (المخفف في 1٪ BSA) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في هذه الحالة، استخدم 1:10 الماوس مكافحة DLG و 1: 250 أرنب لالمعهد القومي للاتصالات-HtsM 15،16. ويمكن أيضا أن يدرج الأجسام المضادة ضد علامات التي لا تتم في الماوس أو أرنب - على سبيل المثال، استخدم 1: 200 الماعز المضادة للبرنامج الصحة الإنجابية لتحديد أغشية الخلايا العصبية.
    2. يغسل مع PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    3. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية fluorophore مترافق للكشف عن علامات (المخفف في 1٪ BSA) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. وكما هو تصور إشارة PLA في وقت لاحق مع fluorophore أحمر، يجب استخدام fluorophore آخر للكشف عن علامة - على سبيل المثال، استخدم 1: 200 FITC مترافق مكافحة الماعز للكشف عن الماعز المضادة للHRP الأضداد. نظرا لاستخدام الكواشف الحساسة للضوء، والحفاظ على أنابيب في الظلام من هذه النقطة فصاعدا.
      ملاحظة: هذه المجموعة التي تستخدم تسمح لجيش التحرير الشعبى الصينى التي يتعين القيام بها بين الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الماوس والأرانب، مع الإشارة تصور على القناة الحمراء تحت المجهر متحد البؤر. إذا رغبت في ذلك، هي مجموعات الأخرى المتاحة التي تسمح للفحص الذي يتعين القيام به مع الوجاهةالأجسام المضادة راي أثيرت في الأنواع الأخرى، وإشارة تصور على القنوات الأخرى.

3. القرب ربط الفحص

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ومع الإثارة لطيف ما لم ينص على خلاف ذلك.

  1. جيش التحرير الشعبى الصينى المسابر
    1. غسل الجدران الجسم مع PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    2. احتضان مع تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى (1: 5 تمييع كل في 1٪ BSA) لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. في هذه الحالة، استخدم 40 ميكرولتر من جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق المضادة للماوس MINUS، 40 ميكرولتر من جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق المضادة للأرنب PLUS و 120 ميكرولتر من 1٪ BSA لضمان غمر السليم واختلاط 5-10 الجدران الجسم. حتى 1:25 التخفيف من تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى لا يزال يؤدي إلى وجود نسبة كافية إشارة إلى الضوضاء (أي لهذه التجربة).
  2. رباط
    1. غسل الجدران الجسم مع الاحتياطي اغسل A مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    2. احتضان مع الحل ربط (01:40 التخفيف من يغاز العازلة في ربط) لمدة 1 ساعة لر 37 ° C. في هذه الحالة، استخدم 5 ميكرولتر من يغاز، 40 ميكرولتر من العازلة 5 ربط و 155 ميكرولتر من المياه عالية النقاء لضمان غمر السليم واختلاط 5-10 الجدران الجسم.
  3. توسيع
    1. غسل الجدران الجسم مع الاحتياطي اغسل A مرتين لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
    2. احتضان مع التضخيم الحل (1:80 التخفيف من البلمرة في المخزن التضخيم) لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. في هذه الحالة، استخدم 2.5 ميكرولتر من البلمرة، 40 ميكرولتر من 5 التضخيم العازلة و157.5 ميكرولتر من المياه عالية النقاء لضمان غمر السليم واختلاط 5-10 الجدران الجسم.
  4. إعداد للتصوير
    1. غسل الجدران الجسم مع الاحتياطي اغسل B مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    2. يغسل مع 0.01x الاحتياطي اغسل B مرة واحدة لمدة 1 دقيقة.
    3. تتوازن في بضع قطرات من تصاعد الحل لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التركيب، أو تخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    4. باستخدام ملقط غرامة، ونقل بعناية الجدران الجسم على شريحة منصة ثإيث البشرة من أسفل. ضع الجدران الجسم في الصفوف وفي نفس الاتجاه داخل قطرة أو اثنتين من مرس. وضع 22 مم × 40 مم ساترة على إعداد مع الحرص على عدم توليد فقاعات الهواء، ثم ختم الشريحة مع طلاء الأظافر واضحة.
    5. تخزين الشرائح في الظلام في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للتصوير متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في البرية من نوع الطور الثالث لل NMJs اليرقات، وجدت DLG الغالب في الغشاء بعد المشبكي من نوع I حبات glutamatergic، مع مستويات مناعية DLG يجري أكثر وضوحا في نوع حبات إيب من نوع هل حبات (الشكل 3A) 4. HTS موجودة في جميع أنحاء العضلات ولكن يركز على المنطقة بعد المشبكي مع مستويات مناعية HTS التي تظهر متساوية في كل نوع I حبات، ويوجد أيضا presynaptically (الشكل 3A ') 8،17. لاحظ أن توزيع DLG وHTS تتداخل إلى حد كبير في المنطقة بعد المش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوضح هذا التقرير كيف PLA يمكن تطبيقها على ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ. يتم تنفيذ الفحص على اليرقات جدار الجسم الاستعدادات العضلات لغرض الكشف عن الذاتية البروتين البروتين التفاعلات الحاضرة في NMJ. مع هذه التقنية، وتظهر DLG وHTS ليكون على مقربة من بعضها البعض، وبالتالي وجود لها في مجمع، وتحديدا في المنطقة بعد المشبكي 27. ودعما لهذه النتيجة، قدمت دراسة سابقة دليل على ارتباطهم مع البيانات التالية: 1) التوزيعات مناعيا من DLG وHTS تتداخل في المنطقة بعد المشبكي من لل NM...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر ذبابة الفاكهة مركز بلومينغتون المالية لتوفير مخزون الطاير. كما نشكر البنك دراسات الإنمائية هجين والدكتور لين كولي (جامعة ييل) لتوفير الأجسام المضادة. شكر خاص يذهب إلى AhHyun يو لمساعدتها على المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (كريجر)، ويليام وادا إيزابيل صندوق الصلب (كريجر)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (هاردن).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ملقط (ناعم # 5)AlmedicA10-704
Sylgard DiscWorld Precision InstrumentsSYLG184امزج قاعدة المطاط الصناعي وعامل المعالجة بنسبة 10: 1. اضبط لمدة 30 دقيقة. تصب في قالب ( على سبيل المثال < / em> واستخدم لوح زراعة خلية مكون من 12 بئرا). اتركه يشفى لمدة 24 ساعة على الأقل. التمسك بغطاء غطاء طبق بتري مقاس 60 × 15 مم عند التشريح.
دبابيس Minutien (0.0125  قطر طرف مم)أدوات العلوم الدقيقة26002-10
مقص التشريح الدقيق (فائق الدقة)أدوات العلوم الدقيقة15200-00
شرائح المنصةالغراء اثنين 22 × 22 مم < سوب > 2 < / sup> أغطية على شريحة مجهر مع طلاء أظافر شفاف ، تاركا & lt ؛ فجوة 20 مم بينهما لتركيب العينة.
w1118< / sup>Bloomington ذبابة الفاكهة Stock Center3605
hts01103< / sup>Bloomington ذبابة الفاكهة Stock Center10989تمت إعادة موازنة الأسهم على موازن GFP بحيث يمكن اختيار الطفرات متماثلة اللواقح بناء على عدم وجود إشارة GFP.
1x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات): 3 & nbsp ؛ mM NaH2PO4, 7  mM Na2HPO4, 130  مللي مولار كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.0هيدروكلوريد الصوديوم < الفرعي > 2 < / فرعي > PO < > 4 < / فرعي > (مختبرات كاليدون - 8180-1) ، Na 2 < / sub > HPO 4 < / sub > (كاليدون - 8120-1) ، كلوريد الصوديوم (كاليدون - 7560-1) محلول
بوينسيجما ألدريتشHT10132
4٪ PFA (بارافورمالدهايد): 4٪ PFA في 1x PBSPFA (علم الحساسية - 66194-300). انظر doi: 10.1101 / pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 للحصول على إرشادات حول كيفية صنع الحل.
[header]
1x PBT (محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع تريتون): 1x PBS مع 0.01٪ TritonTriton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1٪ BSA (ألبومين مصل البقر): 1٪ BSA في 1x PBTBSA (Bioshop Canada - ALB001). يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
الفأر المضاد ل Dlg (أقراص كبيرة)دراسات التنموية بنك الورم الهجين4F3يستخدم عند تخفيف 1:10 في 1٪ BSA.
أرنب مضاد ل HtsM (Hu-li tai shao)مقدمة من الدكتورة لين كولي (جامعة ييل). استخدم عند تخفيف 1: 250 في 1٪ BSA.
أرنب مضاد لباك (كيناز منشط p21)مقدمة من الدكتور نيكولاس هاردن (جامعة سيمون فريزر). استخدم عند تخفيف 1: 500 في 1٪ BSA.
الفأر المضاد ل Wg (بدون جناح)دراسات التنموية بنك الورم الهجين4D4يستخدم عند تخفيف 1: 5 في 1٪ BSA.
الماعز المضاد ل Hrp (بيروكسيداز الفجل)جاكسون & nbsp ؛                         ImmunoResearch123-065-021استخدم عند تخفيف 1: 200 في 1٪ BSA.
حمار مترافق FITC مضاد للماعزجاكسون & nbsp ؛                       ImmunoResearch705-095-003استخدم عند تخفيف 1: 200 في 1٪ BSA.
Duolink في الموقع مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى المضاد للفأر ناقصسيجما ألدريتشDUO92004
Duolink في الموقع مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى المضاد للأرانب PLUSسيجما ألدريتشDUO92002
كواشف الكشف عن الرابط الثنائيسيجما ألدريتشDUO92008
1x عازلة غسيل أ: 0.01   ؛ M Tris, 0.15  M كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ توين 20 ، درجة الحموضة 7.4سيجما ألدريتشDUO82049تريس (مختبرات كاليدون - 8980-1) ، كلوريد الصوديوم (كاليدون - 7560-1) ، توين 20 (فيشر ساينتفيك - BP337)
1x عازلة غسيل ب: 0.2 & nbsp ؛ M Tris, 0.1  M كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5سيجما ألدريتشDUO82049تريس (مختبرات كاليدون - 8980-1) ، كلوريد الصوديوم (كاليدون - 7560-1)
0.01x عازلة الغسيل ب: 2   ؛ mM Tris, 1  ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5سيجما ألدريتشDUO82049تريس (مختبرات كاليدون - 8980-1) ، كلوريد الصوديوم (كاليدون - 7560-1)
Duolink في وسط التركيب في الموقع مع DAPISigma-AldrichDUO82040
الأحمر

المراجع

  1. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
  2. Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
  3. Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
  4. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
  5. Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
  6. Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
  7. Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
  8. Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
  9. Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
  10. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  11. Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
  12. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  13. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
  14. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
  16. Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
  17. Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
  18. Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
  19. Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
  20. Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
  21. Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
  22. Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  23. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
  24. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  25. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
  26. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
  27. Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الوصلات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة (Drosophila)التفاعل بين البروتيناتالمجهر البؤريالتألق المناعيالغشاء بعد التشابكيمعقد Dlg Htsمجسات مقايسة ربط القرب (PLA)تضخيم الدائرة المتدحرجةتحضير جدار الجسم
الكشف عن في الموقع مجمعات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.