مقالة منهجية

تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة Chemokine اشارة

DOI:

10.3791/52140

⸱

ديسمبر 12, 2014

 , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, 2Cnrs, UMR8104, 3Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تثير إشارات الكيموكين تغييرات ملحوظة في التشكل الخلوي وبعض عمليات إعادة التوزيع المهمة للبروتينات داخل الخلايا. هنا ، يتم توفير بروتوكول سريع ومفصل لدراسة هذه الأحداث.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا تستجيب لchemokine التحفيز عن طريق فقدان شكلها جولة في عملية تسمى الاستقطاب، وعن طريق تغيير توطين التحت خلوية من العديد من البروتينات. وقد استخدمت تقنيات التصوير الكلاسيكية لدراسة هذه الظواهر. ومع ذلك، أنها تتطلب اكتساب اليدوي من العديد من الخلايا تليها تستغرق وقتا طويلا الكمي من التشكل وشارك في توطين تلطيخ عشرات الخلايا. هنا، يتم وصف طريقة سريعة وقوية لدراسة هذه الظواهر على عينات تتكون من عدة آلاف من الخلايا باستخدام التدفق الخلوي التصوير التكنولوجيا التي تجمع بين مزايا المجهر مع تلك من عداد الكريات. استخدام الخلايا الليمفاوية T حفز مع CCL19 وتلطيخ لجزيئات MHC من الدرجة الأولى والأكتين الخيطية، وتقدم استراتيجية النابضة لقياس في وقت واحد درجة التعديلات شكل ومدى التعاون توطين علامات التي تتأثر CCL19 الإشارات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الاستراتيجية النابضة سمحت لنا observه الفصل بين الأكتين الخيطية (في الجبهة) وفسفرته Ezrin-Radixin-Moesin (الفوسفات-ERM) البروتينات (في العمق) في خلايا T الاستقطاب بعد التحفيز CXCL12. وكانت هذه التقنية مفيدة لمراقبة تأثير حظر على الاستقطاب من عنصرين مختلفين أيضا: تثبيط الأكتين البلمرة التي كتبها مثبط الدوائية والتعبير عن المسوخ من Par6 / شاذة PKC يشير المسار. وهكذا، يظهر دليل على أن هذه التقنية مفيدة لتحليل كل التعديلات الشكلية وإعادة التوزيع البروتين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كيموكينات هي بروتينات قابلة للذوبان الصغيرة التي تجذب الخلايا لمواقع متخصصة 1. ولذلك، فإنها تشارك في الموضع الصحيح من الخلايا في الأنسجة، وهي وظيفة حاسمة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء. الجهاز المناعي ليست استثناء لهذه القاعدة لأنها تعتمد على عمل العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تعمل في تناسق لجبل استجابة مناعية فعالة. من خلال التحكم في موقع معين من نوع واحد الخلايا المناعية في حالة معينة، كيموكينات هي المطلوبة مسبقا قبل أن يتم الكشف عن المستضدات الأجنبية وتحييدها.

في الخلايا الليمفاوية T على وجه الخصوص، كيموكينات تربط لمستقبلات محددة السطح والتي، على المشاركة، وانتزاع العديد من الإشارات بين الخلايا (ارتفاع الكالسيوم، ERK الفسفرة، وتفعيل رو GTPases، وزيادة في integrins تقارب وهيكل الخلية التعديلات) التي تفضل T خلية حركية 2،3. على المستوى الخلوي، ويمكن للمرء أن يلاحظ التغيرات المورفولوجية أثار chemokine على التحفيز.هذه التغيرات في الأشكال خلية مثيرة خصوصا في خلايا T: يستريح خلايا T لها مورفولوجيا مستديرة تشبه حبة عند السفر في مجرى الدم. ومع ذلك، فإن الاستشعار عن وجود كيموكينات في مواقع التهابات أو على القرب من الأجهزة اللمفاوية هو الذهاب الى تغيير شكل خلايا T التي تعتمد الآن على "اليد مرآة" مورفولوجيا نموذجية تتكون من شكل ثنائي القطب: حافة الرائدة في الجبهة وميزة زائدة، أو قدم ذنبية، في الجزء الخلفي 4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمكونات داخل الخلايا تفصل في هذه المناطق المعاكس اثنين من خلية T المستقطبة للحفاظ على الهجرة. على سبيل المثال، ويزيد من خيوط الأكتين البلمرة على chemokine التحفيز 5 و الأكتين بلمرة تتراكم في الجزء الأمامي من T خلية الاستقطاب 2. من ناحية أخرى، والعديد من البروتينات، مثل البروتينات فسفرته من Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) الأسرة التي تربط بين غشاء البلازما إلى القشرية الهيكل الخلوي F-الأكتين، وإعادة توطين في قدم ذنبية من الاستقطابخلايا T 6. ومن المثير للاهتمام، نحن وغيرنا قد أظهرت أن هناك حاجة لهذه العملية الاستقطاب T الهجرة الخلية. والواقع أن أي علاج الذي يتداخل مع الاستقطاب تمنع الحركة الخلوية. على سبيل المثال، وتثبيط لنشاط أعضاء من البروتين غير نمطية تحركات C (PKC) أسرة، وكتل PKCζ وPKCι T الاستقطاب الخلية ولها عملية المسح المهاجرة من الخلايا الجذعية 7. وينظم T خلية الاستقطاب أيضا رو GTPases. لقد أظهرنا أن تعديل النشاط RhoA من البروتين Fam65b وصف مؤخرا يتداخل مع التغيرات الخلايا التائية في التشكل وقدرتها على الهجرة في مقايسة Transwell 6. كما الاستقطاب هو خطوة شرط أساسي لحركية الخلوية، وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على تحديد بأنها قراءات الرئيسية من الردود chemokine. تم إجراء تعديلات شكل خلية قياس سابقا يدويا 8. ومع ذلك، هذا النوع من القياس الكمي هو جدا تستغرق وقتا طويلا، بحيث عادة سوى عدد قليلتؤخذ عشرات الخلايا في الاعتبار.

هنا، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس بسرعة درجة التعديلات شكل من الخلايا الليمفاوية T تتعرض لchemokine التحفيز. تدفق التصوير الخلوي التكنولوجيا (انظر الجدول من الكواشف محددة / معدات) يستخدم، والذي يجمع بين مزايا تدفق عداد الكريات والمجهر 9 لقياس كفاءة كمية من الخلايا الاستقطاب في ظروف مختلفة من التحفيز chemokine. بالإضافة إلى تقدير حجم التعديلات الشكلية التي يمكن للمرء أن قياس بقوة مع هذه التكنولوجيا، فمن الممكن أيضا لتقييم التغيرات في توطين التحت خلوية من بعض البروتينات على chemokine الإشارات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الخلايا اللمفاوية T

  1. إعداد الماوس الأساسي أو خلايا T الإنسان كما هو موضح 10،11.
  2. زراعة خلايا T الإنسان في كامل المتوسطة RPMI مع المصل البشري 10٪ AB في مناطق ذات كثافة من 2-3 × 10 6 خلية / مل.
    ملاحظة: استخدام مصل الجنين العجل (FCS) بدلا من المصل البشري يمكن أن تثير الاستقطاب عفوية لجزء كبير من الخلايا T الإنسان في الثقافة. تبقى هذه الخلايا في الثقافة لمدة 4 - 5 ايام وعملية أخرى لهم في أي وقت خلال هذه الفترة.
  3. الحفاظ على خلايا فأر T في كامل المتوسطة RPMI تستكمل مع 10٪ FCS في مناطق ذات كثافة خلية مماثلة. استخدام على الفور أو في اليوم التالي، وبعد O / N الثقافة عند 37 درجة مئوية في ظل وجود 10 نانوغرام / مل IL7.
  4. زراعة T خط الخلية CEM الإنسان في استكمال كامل RPMI مع 10٪ FCS.

2. تحفيز Chemokine

  1. غسل 5 × 10 5 خلايا لكل حالة تجريبية في المتوسط ​​الدافئة HBSS تستكمل مع 10 ملي Hepeالصورة. وبالنسبة لبعض التجارب، وشارك في بالنقل خلايا T الإنسان الأساسي في اليوم السابق مع 2 ميكروغرام pmaxGFP و 8 ميكروغرام pcDNA3.1 + (ناقلات الفارغة، والسيطرة)، PKCζ كيناز الميتة، أو البلازميدات Par6 N-الطرفية.
  2. resuspend الكرية خلية في المتوسط ​​الدافئة HBSS-HEPES (استخدام 0.3 مل × عدد الظروف التجريبية).
  3. توزيع الخلايا في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
    ملاحظة: ولذلك، فإن أنبوب واحد المقابلة لحالة تجريبية واحدة تحتوي على 5 × 10 5 الخلايا في 0.3 مل HBSS-HEPES المتوسطة. وبالنسبة لبعض التجارب، وإضافة 500 نانومتر Latrunculin A أو السيارة (DMSO)، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة قبل التحفيز chemokine.
  4. إضافة 10-500 نانوغرام / مل CCL19 أو CXCL12 chemokine في كل أنبوب.
    ملاحظة: نحن عادة استخدام 10-200 نانوغرام chemokine مل / للخلايا T الإنسان. خلايا CEM لا تعبر عن مستقبلات CCR7 التي تربط CCL19. ولذلك، فإن خلايا CEM تكون قادرة على الاستجابة لتحفيز CXCL12 فقط. وعلاوة على ذلك، استخدام تركيزات أعلى chemokine (300-500 نز / مل) إلى استقطاب خلايا فأر T.
  5. الوجه الأنابيب عدة مرات، واحتضان لهم في 37 ° C حمام الماء لمدة 8 أو 10 دقيقة للخلايا T الابتدائية أو CEM، على التوالي.
  6. إيقاف عملية الاستقطاب عن طريق إضافة إلى كل أنبوب 0.3 مل من محلول دافئ يحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) و10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. الوجه الأنابيب واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

3. Stainings

  1. نقل الخلايا من أنابيب microcentrifuge في التدفق الخلوي الأنابيب.
  2. ملء أنابيب تماما مع حل RT تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني.
  3. أنابيب الطرد المركزي في 460 x ج لمدة 4 دقائق.
  4. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من حل RT تحتوي على 5٪ FCS في برنامج تلفزيوني.
  5. إضافة 5 ميكرولتر من FITC المضادة للHLA-ABC في كل أنبوب، دوامة لهم، واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT، بعيدا عن الضوء.
  6. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ FCS، وهوND مرة واحدة مع PBS فقط.
  7. في RT: إضافة 500 ميكرولتر 1٪ PFA، واحتضان لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل الخلايا مع محلول يحتوي على 1٪ BSA، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني.
  8. تجاهل طاف، وملء أنابيب تماما بمحلول PBS تحتوي على 0.2٪ BSA، 0.1٪ سابونين، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES (العازلة permeabilization).
  9. غسل الخلايا مرتين في هذه الوسيلة.
  10. الوجه الأنابيب لإزالة المتوسطة ودوامة لهم لفصل بيليه الخلية.
  11. إضافة 0.25 ميكروغرام / مل TRITC-Phalloidin و / أو 1: 100 التخفيف من مكافحة P-ERM الأجسام المضادة لكل أنبوب، دوامة لهم واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
  12. غسل الخلايا مع المخزن المؤقت permeabilization. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري إذا لزم الأمر.
  13. resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر PBS ونقلها إلى أنابيب microcentrifuge.
    ملاحظة: خلايا جاهزة للشراء. بدلا من ذلك، مع الحفاظ على حجم الحد الأقصى لمجموع 200 ميكرولتر في الأنبوب، إضافة المركزة PFA إلى النهائي 1٪تركيز من أجل الحفاظ على stainings إذا لم يتم استخدام خلايا في نفس اليوم لمزيد من المعالجة.

4. الصور اقتناء وتحليل

  1. التبديل على جهاز (انظر الجدول من الكواشف محددة / المعدات) والسماح لها معايرة نفسه وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: تم استخدام البرنامج INSPIRE مع الهدف 40X (0.75 NA). تم استخدام IDEAS 3.0 برامج لجميع quantifications المبلغ عنها.
  2. إعداد سلسلة من النوافذ الاستحواذ والتي يمكن حفظها في قالب للتجارب المستقبلية. رسم رسوم بيانية أن تحديد القيم التدرج RMS. من "تحت المجهر" السكان، واختيارهم على الرسم البياني RMS التدرج، delimitate "خلية واحدة" السكان على الرسم البياني للمنطقة. مرة واحدة وقد تم إدخال أنبوب microcentrifuge في الجهاز، وضبط قوة الليزر، بوابة على الخلايا الفردية واكتساب 5،000 اللمفاويات التائية.
  3. في الأفكار الناعمةوير، فتح ملف اقتناء وإنشاء الرسم البياني التي سوف تظهر قيمة قيمة RMS التدرج للصور المجال مشرق (القناة 1) التي تم الحصول عليها لكل خلية على حدة. رسم بوابة على الرسم البياني التدرج RMS التي تعتبر الخلايا العارضة RMS قيمة التدرج فوق 57.
    ملاحظة: التدرج RMS يسمح مع الأخذ بعين الاعتبار في التحليل فقط الخلايا الليمفاوية T التي هي في المستوى البؤري. لقد تحدد تجريبيا أن الخلايا الفردية واظهار قيمة التدرج RMS متفوقة على 57 هي في المستوى البؤري، ويمكن اعتبارها بشكل دقيق.
  4. في / القائمة أقنعة تحليل، وخلق قناع جديد، ودعا تآكل (M01،2) من قناع التشكل على الصور brightfield M01، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة للمنطقة، وتحسب على تآكل (M01،2) قناع. من الخلايا المحددة في البوابة السابقة، فتح الرسم البياني يبين مجال الخلايا باستخدام هذا القناع تم إنشاؤه حديثا.
    أقنعة والتشكل التي تتوفر حسب: ملاحظةالافتراضية هي أكبر بكثير من الحجم الفعلي للخلية. وبالتالي، فمن أكثر دقة لتآكل ليصل إلى 2 بكسل.
  5. رسم بوابة على خلايا T الفردية، باستثناء الخرز المعايرة والحطام (المنطقة الصغيرة) والحلل (المنطقة الكبيرة). ضبط هذه البوابة في كل الاستحواذ.
    ملاحظة: سوف الاختلافات في حجم الخلية يؤثر على موقف البوابة. كما خلايا فأر T هي أصغر من خلايا T الإنسان التي هي نفسها أصغر من خلايا CEM، فإن مساحة كل نوع من الخلايا تكون متناسبة مع حجمها.
  6. النظر في واحدة، في تركيز الخلايا التي تم بوابات في الخطوات السابقة، فتح مؤامرة نقطة تتكون من الخام ماكس بكسل على تلطيخ HLA-ABC (القناة 2، محور س) بوصفها وظيفة من الخام ماكس بكسل على phalloidin تلطيخ (قناة 4، محور Y). إنشاء بوابة لاستبعاد الأحداث فلوري غير ملوثين أو المشبعة. فتح اثنين من رسوم بيانية تبين الخام ماكس بكسل لHLA-ABC (قناة 2) وphalloidin (قناة 4) stainings.
  7. في تحليل / القائمة أقنعة، يخلقعصام قناع جديد، ودعا تآكل (M02،2) من قناع مورفولوجيا الخلايا HLA-ABC الملون (قناة 2)، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة تتألف من المعلمة الاستدارة، وتحسب على تآكل (M02،2).
    ملاحظة: يقيس هذا المعامل انحراف شكل خلية من دائرة. ولذلك، فإن خلية T مستديرة تماما يكون لها قيمة عالية دائرية في حين أن الخلايا الاستقطاب ممدود سوف يحمل الرقم القياسي دائرية منخفضة.
  8. وفي وقت لاحق، وخلق الرسم البياني آخر من شأنه أن يقدم تقريرا قيم ميزة الاستدارة من الخلايا المغلقة سابقا. استخدام هذا الرسم البياني لرسم مباشرة توزيع الفرد والسكان خلية في التركيز وفقا لقيمة الاستدارة لكل خلية على حدة.
  9. وعند النظر إلى شكل الرسم البياني للخلايا غير حفز، رسم بوابة للخلايا الاستقطاب، ابتداء من الساعة قيمة أدنى دائرية يصل إلى قيمة الحد دائرية، حيث ان معظم الخلايا غير حفزيتم رسم. نظرة على عرض إحصاءات عن النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب بين السكان بوابات (٪ بوابات).
    ملاحظة: لقد حددت هذه البوابة للقيم مؤشر الاستدارة أقل من 13.
  10. من أجل أن ننظر إلى الاستقطاب من تلطيخ الأكتين في الخلايا، رسم بياني لتفاصيل مشرق قيمة التشابه R3، مقارنة تلطيخ HLA-ABC (قناة 2) وتلطيخ phalloidin (قناة 4).
    ملاحظة: أكبر قيمة من هذه الميزة، وأكثر فرضه stainings هما.
  11. باستخدام استراتيجية النابضة نفسها كما كان من قبل، رسم بوابة على الخلايا غير حفز لتلطيخ فصل يبين النسبة المئوية للخلايا مع المستقطب الأكتين تلطيخ.
  12. عند الانتهاء، وتظهر النسبة المئوية للخلايا واظهار الفصل في توزيع الدرجة الأولى MHC وstainings phalloidin، النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب جنبا إلى جنب مع القيم المتوسطة من الاستدارة والتشابه مؤشرات جميع خلايا ± SD في الموافقوحات إحصاءات onding.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المثال الأول المختار هنا يتعلق باستخدام الخلايا الليمفاوية T الأساسي الإنسان حفز مع CCL19. ومع ذلك، فإن الاستراتيجية ذاتها يمكن استخدامها مع خلايا T الماوس الابتدائي، خطوط الخلايا T أو أي نوع من الخلايا الأخرى استجابة لتحفيز chemokine. استراتيجية النابضة المعروضة هنا تشمل سلسلة من نوافذ يمكن تحديد أحداث مركزة، ثم الخلايا واحدة. وأخيرا تم اتباع مجموعة من كثافة مضان هنا كمثال على اثنين من علامات: وMHC من الدرجة الأولى HLA-ABC والأكتين الخيطية ليستريح (الشكل 1) أو حف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام تقنية حديثة من تدفق التصوير الخلوي، ووضع استراتيجية النابضة سريعة ومفيدة لتحليل الأحداث الخلوية والجزيئية الناجم عن التحفيز chemokine يرد. من تجربة واحدة، يمكن للمرء الحصول على نوعين رئيسيين من المعلومات: التغييرات في مورفولوجية الخلايا الناجم عن التحفيز chemokine وتوزيع التحت خلوية من البروتينات المختلفة أثناء عملية الاستقطاب. ومن المثير للاهتمام، وتقدم الأدلة أيضا على إمكانية تحليل عدد كبير من الخلايا، والذي يسمح متانة الإحصائية والتحليلات ذات الصلة لجزء صغير من السكان ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعترف كثيرا بيير Bourdoncle، توماس غيلبير ولويز Rimbault مرفق كوشين التصوير. وأيد هذا العمل من قبل INSERM، CNRS والدوري الفرنسي الوطني مناهضة جنيه السرطان (إيكيب labellisée).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMIGibco61870-010
مصل بشري ABPAAC11-021تسخين مسبق لتعطيل المكمل.
مصل ربلة الساق الجنينيةPAN BiotechP30-3300تسخين مسبق لتعطيل المكملة.
مجموعة العوامل النووية للخلايا التائية البشريةLonzaVCA-1002
Murine IL7Peprotech217-17
HBSSGibco14025-050دافئ في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام.
HepesGibco15630-056
Murine CCL19Peprotech250-27BAliquots على الجليد قبل إضافة الكيموكين إلى الخلايا.
البشرية CCL19Peprotech300-29Bعلى الجليد قبل إضافة الكيموكين إلى الخلايا.
CXCL12Peprotech300-28AAliquots البشرية على الجليد قبل إضافة الكيموكين إلى الخلايا. يمكن أيضا استخدام هذا الكيموكين على الخلايا التائية للفأر.
علوم المجهر الإلكترونيPFA157-8-100هذا محلول 8٪ PFA في الماء. امزج الحجم إلى الحجم باستخدام 2x PBS للحصول على محلول PFA بنسبة 4٪ في PBS.
BSASigmaA3059
SaponinFluka84510
Alexa Fluor 594 phalloidinInvitrogenA12381
FITC-anti-HLA-ABC الجسم المضادBeckman CoulterIM1838استنساخ B9.12.1
إشارات خلاياالأجسام المضادة المضادةل P-ERM 3149P
ImageStreamx< / sup> Mark IIأمنس
يتم إذابة يتم إذابة Aliquots يتم إذابة تقنية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
  2. Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
  3. Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
  4. Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
  5. Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
  6. Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
  7. Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
  8. Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
  9. Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
  10. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409(2007).
  11. James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
  12. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  13. Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Imaging Flow CytometryT Lymphocyte PolarizationActin SegregationMHC Class I StainingProtein Co localization AnalysisMorphological QuantificationPar6 PKC Pathway InhibitionCCL19 StimulationCXCL12 Stimulation

مقالات ذات صلة