مقالة منهجية

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا في فيفو

DOI:

10.3791/52143

⸱

أكتوبر 30, 2014

 , 
1Institute of Neurophysiology and Cellular Biophysics and Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB), University of Göttingen

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا لوضع العلامات في الجسم الحي للخلايا العصبية الحسية الشمية عن طريق التثقيب الكهربائي والمسح بالليزر متحد البؤر اللاحق أو الفحص المجهري متعدد الفوتون لتصور مورفولوجيا الخلايا العصبية وتطورها بمرور الوقت.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتمتع الجهاز الشمي بقدرة غير عادية على توليد خلايا عصبية جديدة طوال عمر الكائن الحي. تؤدي الخلايا الجذعية الشمية في الجزء القاعدي من الظهارة الشمية باستمرار إلى ظهور خلايا عصبية حسية جديدة تمتد محاورها إلى البصلة الشمية ، حيث تواجه التحدي المتمثل في الاندماج في الدوائر الموجودة. بسبب هذه الميزة الخاصة ، يمثل نظام حاسة الشم فرصة فريدة لمراقبة الأسلاك المحورية والتوجيه ، والتحقيق في تكوين المشبك. نصف هنا إجراء لوضع العلامات في الجسم الحي على الخلايا العصبية الحسية والتصور اللاحق للمحاور في الجهاز الشمي ليرقات البرمائيات Xenopus laevis. لتلطيخ الخلايا العصبية الحسية في العضو الشمي نعتمد تقنية التثقيب الكهربائي. التثقيب الكهربائي في الجسم الحي هو تقنية راسخة لتوصيل ديكستران مقترن بالفلوروفور أو الجزيئات الكبيرة الأخرى إلى الخلايا الحية. يمكن بعد ذلك مراقبة الخلايا العصبية الحسية الملطخة وعملياتها المحورية في الحي إما باستخدام المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر أو الفحص المجهري متعدد الفوتونات. من خلال تقليل عدد الخلايا المصنفة إلى عدد قليل أو خلايا مفردة لكل ، يمكن تتبع المحاور المفردة في البصلة الشمية ويمكن مراقبة تغيراتها المورفولوجية على مدار أسابيع عن طريق إجراء سلسلة من تجارب التصوير بفاصل زمني في الجسم الحي. في حين أن البروتوكول الموصوف يجسد وضع العلامات على الخلايا العصبية الحسية الشمية ومراقبتها ، إلا أنه يمكن أيضا اعتماده على أنواع الخلايا الأخرى داخل حاسة الشم والأنظمة الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يميز دوران الخلايا العصبية الحسية مدى الحياة الجهاز الشمي عن العديد من الأنظمة الحسية والعصبيةالأخرى 1،2. يتم إنشاء الخلايا العصبية الحسية المشكلة حديثا باستمرار في الجزء القاعدي من الظهارة الشمية3 وتمتد محاورها إلى البصلة الشمية ، وهي أول محطة ترحيل لنظام حاسة الشم4. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في تكوين وصيانة الخريطة الشمية بعيدة كل البعد عن الفهم الكامل4،5.

هنا ، نصف بروتوكولا لتصنيف الخلايا العصبية الحسية للعضو الشمي لليرقة X. laevis عن طريق التثقيب الكهربائي في الجسم الحي ل dextrans المقترن بالفلوروفور. يسمح البروتوكول المقدم بتصور التشكل المحوري والاتصال ، وتتبع تطور المحور العصبي بمرور الوقت ودراسة الآليات التي تنظم الأسلاك المحورية والتوجيه.

التثقيب الكهربائي هو طريقة راسخة لإدخال الجزيئات الكبيرة المشحونة ، مثل الأصباغ المقترنة بالديكستران والحمض النووي ، في الخلايا6،7. يتم اختراق غشاء الخلية عن طريق تطبيق نبضات الجهد القصير ويتم تسليم الجزيئات كهربائيا إلى العصارة الخلوية8. يسمح التثقيب الكهربائي المقيد مكانيا باستخدام ماصة دقيقة بوضع العلامات الانتقائية للخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية وقد تم تطبيقه في العديد من الأنظمة العصبية بما في ذلك النظام البصري ل X. laevis9،10.

نوضح كيف يمكن استخدام المثقبة بالكهرباء لدراسة أنماط النمو المحوري والتشكل في الحية باستخدام المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر أو الفحص المجهري متعدد الفوتونات. يسمح الإجراء الموصوف بتحديد الطوبولوجيا الخشنة للإسقاطات المحورية للخلايا العصبية الحسية للنظام الشمي الرئيسي والملحق11،12. باستخدام التصوير بفاصل زمني في الجسم الحي ، فهو مناسب أيضا للإشراف على الوصلات الكبيبية للخلايا العصبية الحسية الناضجة المفردة ، ومراقبة تطور أنماط الإسقاط المحوري للخلايا العصبية الحسية غير الناضجة12. يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف للتحقيق في بنية وتكوين الدوائر الشمية في السليم ويمكن تكييفه مع أنواع الخلايا الأخرى داخل حاسة الشم والأنظمة العصبية الأخرى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت التعامل مع الحيوانات والتجارب التي وافقت عليها لجنة جامعة غوتنغن لأخلاقيات التجارب على الحيوانات: ملاحظة.

1. إعداد أدوات وماصة تلفيق

  1. تأكد من أن الإعداد Electroporation لليتكون من stereomicroscope مع المسافة العمل كبيرة ومجهزة الإضاءة الفلورسنت وتصفية مجموعات للصبغة المستخدمة.
  2. ل electroporation استخدام إما electroporator خلية واحدة مخصصة أو عام مولد النبض مربع تعلق على الذبذبات. ربط مخرجات electroporator إلى حامل ماصة والقطب حمام. توصيل الطرف الموجب للمولد النبض لصاحب ممص مكروى والسالب إلى القطب حمام. ضمان كلا من حامل ماصة والقطب حمام يحتوي الأسلاك الفضة المطلية بطبقة رقيقة من كلوريد الفضة.
  3. جبل حامل ماصة على micromanipulator للسماح تحديد المواقع بدقة.
  4. افتعال بال micropipettes Electroporation للمن الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط الداخلي.
  5. استخدام مجتذب micropipette الأفقي وتطبيق البروتوكول المعدل لتصنيع الماصات للتجارب المشبك التصحيح كما وصفها Bestman وآخرون 13.
  6. التكيف مع المعلمات لإنتاج ساق طويلة وفتحة طرف أصغر مما أدى إلى مقاومة ماصة ارتفاع حوالي 15-20 MOHM ل electroporation خلية واحدة. يجب أن تكون المقاومة ماصة أقل من ذلك، على سبيل المثال، 3-4 MOHM، لوضع العلامات على مجموعات من الخلايا.
  7. قياس المقاومة ماصة إما مباشرة مع electroporator وحيدة الخلية مخصص أو حساب مع قانون أوم بعد قياس تدفق التيار مع الذبذبات بعد تطبيق نبضة الجهد المحددة.

2. إعداد Electroporation للحلول

  1. حل ديكستران يقترن fluorophore في المسابقة ضفدع (98 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 1 ملم CaCl 2، 2 مم MGCL 2، 5 ملي الجلوكوز، 5 ملي نا البيروفات، 10 ملي HEPES، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.8، وكانت الأسمولية 230 mOsmol / لتر) بتركيز 3 مم. الخلايا قد لا تكون كذلك وصفت الزاهية إذا تم استخدام تركيزات أقل الصبغة. إعداد محلول المخزون الحجم الكبير وتقسيمه إلى مأخوذة الصغيرة. تجميدها للتخزين (مستقر لعدة أشهر).
    هي Dextrans المتاحة في مختلف الأحجام ومجموعة متنوعة من الانبعاثات / الإثارة أطياف (على سبيل المثال، اليكسا 488 ديكستران 10kD، اليكسا 546-ديكستران 10kD، اليكسا 568 ديكستران 10kD، اليكسا 594-ديكستران 10kD، TMR-ديكستران 3kD.): ملاحظة.
  2. الردم على ممص مكروى مع تلميح ماصة ممدود مع كمية صغيرة من محلول ديكستران (1-5 ميكرولتر). نفض الغبار بعناية ممص مكروى مع إصبع لإزالة فقاعات الهواء المتبقية من طرف ماصة.
  3. تركيب ممص مكروى في حامل ماصة. تأكد من أن أسلاك الفضة داخل ماصة على اتصال مع محلول الصبغة.

3. اختيار اليرقية اكس. المورق </ EM>

  1. استخدام اليرقات البيضاء من X. المورق للتجارب. الحيوانات البرية نوع تمتلك melanophores مليئة الصباغ التي تظهر انبعاث تألق ذاتي خلال متحد البؤر / التصوير multiphoton وبالتالي فهي لا تصلح لوصف التجارب.
  2. تنظيم الضفادع الصغيرة premetamorphotic بعد Nieuwkoop وفابر 14. اختيار الضفادع الصغيرة من مراحل 45-53 للتجارب.

4. Electroporation للمن جانب Dextrans Fluorophore-

  1. ضع قطعة صغيرة من الأنسجة في طبق بتري وتغطية ذلك مع كمية صغيرة من المياه التي تحتوي على 0.02٪ تريكين (الأثيل methanesulfonate 3-أمينوبنزوات، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7).
  2. تخدير الضفادع في المياه التي تحتوي على 0.02٪ تريكين. بعد بعض دقائق من الحيوانات تتوقف عن التحرك. تأكيد التخدير المناسبة من خلال لمس الضفادع الصغيرة. ينبغي أن تكون غير مستجيبة.
  3. نقل بعناية الشرغوف من مخدر إلى الأنسجة مغطاة طبق بتري.
  4. تأكد من إلكترونيات حمامقصيدة إغلاق الدائرة Electroporation لل. تأكد من أن القطب هو في اتصال مع النسيج الرطب. على اتصال مباشر مع الشرغوف ليست ضرورية.
  5. وضع وثيقة ممص مكروى تلميح إلى الجهاز باستخدام حاسة الشم مياداة مجهرية.
  6. اختراق الجلد تغطي الجهاز الشمي مع طرف ماصة والتقدم بحذر طرف في طبقة الخلايا العصبية الحسية في موقع مركزي من الظهارة الشمية الرئيسية أو ظهارة الميكعي.
  7. يؤدي البقول الإيجابية الجهد مربع لنقل الصبغة في الخلايا العصبية الحسية. تطبيق الجهد نبض واحد (على سبيل المثال، 25 V، طول النبض 25 ميللي ثانية) أو القطارات من البقول متعددة (على سبيل المثال، 50 V، طول النبض μsec 300، 400 ميللي ثانية مدتها القطار بسرعة 200 هرتز).
    ملاحظة: تحديد المعايير المثلى نبض الجهد المطلوب للتمديد لوضع العلامات. تقليل الجهد نبض السعة والمدة وعدد من حالات التكرار إلى خفض عدد الخلايا المسمى. تطبيق أعلى الجهد نبض السعة والمدة وعدد من صulses لوضع العلامات أكثر انتشارا.
  8. تصور ناجح قذف الصبغة و electroporation بواسطة نبضات أثار استخدام إضاءة الفلورسنت من stereomicroscope. الصبغة ينتشر بسرعة في جسم الخلية والتغصنات بعد Electroporation للنجاح.
  9. كرر الخطوات من 4،5-4،9 عن الجهاز الشمي الثاني من الشرغوف.
  10. نقل الشرغوف في كوب مملوء بالماء النقي لتحقيق الانتعاش. بعد حوالي 5 دقائق الشراغيف يستيقظ من التخدير وتبدأ حركات السباحة العادية.
  11. بعد 24 ساعة ينتشر الصبغة electroporated في الخلايا العصبية الحسية وتصل إلى البصلة الشمية عبر نقل محور عصبي في نهاية المطاف.

5. الحيوانات تركيب لفي فيفو التصور من الخلايا والعمليات محور عصبي

  1. تخدير الضفادع في المياه التي تحتوي على 0.02٪ تريكين.
  2. نقل بعناية الضفادع الصغيرة إلى غرفة التصوير، على سبيل المثال، تغطي المطاط السيليكون صغير طبق بتري مع توقف دام الشرغوف الحجم.
  3. قطع مستطيل صغير في شريط من بارافيلم. تغطية الشرغوف مع بارافيلم، وترك الدماغ الانتهائي الأمامي يتعرض من خلال النافذة خفض التدريجي. إصلاح بارافيلم مع الإبر على طبق دون إصابة الشرغوف.
  4. تأكد من الشرغوف مغمورة في الماء كافية تحتوي على 0.02٪ تريكين.
  5. جبل غرفة التصوير على مسرح المجهر multiphoton تستقيم أو متحد البؤر المجهر.
  6. الحصول على كومة ثلاثي الأبعاد من الصور من البصلة الشمية. ضمان إجراء التصوير هو قصيرة قدر الإمكان و لا تتجاوز 10-15 دقيقة.
  7. العودة الشرغوف في الماء العادي في خزان منفصل ومنع التعرض للضوء. بعد 5 دقائق، الشرغوف يستيقظ من التخدير.
  8. كرر الخطوات من 5،1-5،7 بعد فترات زمنية محددة، على سبيل المثال، كل يوم.

6. الحيوانات تركيب لفيفو السابقين التصور من الخلايا والعمليات محور عصبي

  1. بدلا من ذلك إلى القسم 5من البروتوكول، استخدم إعداد الدماغ رفعه لتصور الخلايا العصبية الحسية المسمى.
  2. تخدير وقتل الشرغوف من قبل transection من الدماغ في الانتقال إلى الحبل الشوكي. استئصال كتلة من الأنسجة التي تحتوي على أجهزة الشم وحاسة الشم الأعصاب والدماغ الانتهائي الأمامي.
  3. نقل كتلة الأنسجة لضفدع حل المسابقة وإزالة النسيج الضام مع مقص غرامة لفضح الجانب البطني من الدماغ.
  4. نقل كتلة الأنسجة إلى غرفة التصوير واصلاحها مع إطار البلاتين الوترية بخيوط النايلون.
  5. جبل غرفة التصوير على مسرح المجهر متحد البؤر / multiphoton.
  6. الحصول على كومة ثلاثي الأبعاد من الصور من البصلة الشمية.

7. معالجة الصور وتقييم البيانات

  1. 15 تحسين وتطبيق الوسائل غير الحكومية المحلية من الترشيح لتحسين جودة الصورة والتصور الهياكل العصبية كما وصفها كوبيه، P. وآخرون..
    وغالبا ما تكون صاخبة بيانات من تجارب التصوير في طبقات الأنسجة العميقة من العينات الحية: ملاحظة.
  2. خلق توقعات كثافة القصوى للمداخن صورة لمحة عامة.
  3. عن الوقت الفاصل بين شاشة تجارب التصوير مجموعات البيانات لاحد محاور تحديدها بشكل لا لبس فيه من الخلايا العصبية الحسية.
  4. إعادة التشكل الخلوي عن طريق تتبع بمساعدة برنامج العمليات العصبية كما وصفها بنغ وآخرون 16.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن تطبيق بروتوكول صفها بنجاح ول electroporation في الجسم الحي التصور العمليات محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية للنظام حاسة الشم من اكس تخدير المورق، وذلك باستخدام ليزر متحد البؤر المسح المجهري أو multiphoton (الشكل 1).

Electroporation للتسمح dextrans يقترن fluorophore للدخول وانتشرت بسرعة داخل خلايا الجهاز الشمي. فإنه من المفيد أن تطبيق إضاءة الفلورسنت للتحقق من وضع العلامات ناجحة بعد مما اثار نبضات الجهد. اعتمادا على المعلمات Electroporation لل، على سبيل المثال، المقاومة ماصة، وصفت مجموعات من الخلايا (الشكل 2A، B) أو الخلايا واحد (الشكل 2C) من جهاز حاسة الشم. محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية وصفت يمكن تصور في العصب الشمي (الشكل 2D) وعمليات محور عصبي يمكن ملاحظتها أيضا في البصلة الشمية، عادة 24 ساعة بعد Electroporation للنجاح(الشكل 3). Electroporation للمن مجموعات من الخلايا العصبية الحسية يسمح تصور أنماط الأسلاك الخشنة في البصلة الشمية (الشكل 3A). يمكن تطبيقها Electroporation للخلية واحدة للتحقيق في أنماط الفردية محور عصبي إسقاط، التشعبات محور عصبي والربط مع الهياكل الكبيبي في البصلة الشمية (الشكل 3C-E).

الضفادع الصغيرة البيضاء الشفافة من X. تصريح المورق في الجسم الحي أو متحد البؤر التصوير multiphoton من الخلايا العصبية الحسية وصفت في الدماغ سليمة من الشرغوف تخدير. يمكن تتبع تطور أنماط النمو محور عصبي على مدى عدة أيام / أسابيع بواسطة المتكررة في التصور المجراة من نفس المسمى الخلايا العصبية الحسية (الشكل 4). اعتمادا على نضج الخلايا العصبية الحسية في نقطة زمنية من Electroporation للنمط محور عصبي في البصلة الشمية يمكن أن تختلف إلى حد كبير. الخلايا العصبية الناضجة تمتلك بالفعل محور عصبي الفروع تفصيلا التي تتميز خصلالمناطق إد متصل الكبيبات. نمط النمو محور عصبي من الخلايا العصبية الناضجة مستقرة نوعا ما، ولكن استطالة فروع محور عصبي والتحسينات من خصلات الكبيبي ملحوظة (الشكل 4A-E). ويمكن ملاحظة الخلايا العصبية الحسية في الجسم الحي لفترات زمنية طويلة، على سبيل المثال، أكثر من ثلاثة أسابيع (الشكل 4F-I). من ناحية أخرى، محاور عصبية من الخلايا العصبية غير الناضجة لا تزال في طور النمو الأولي، لا يملكون arborizations معنقدة ولم إتصال بعد إلى أهدافهم النهائية الكبيبي. بروتوكول تجريبي يسمح تتبع تطور هذه العصبونات أثناء النضج، على سبيل المثال، استطالة المحور، التشعبات وإنشاء arborizations معنقدة (الشكل 4J-L). لمزيد من الأمثلة انظر أيضا Hassenklöver ومانزيني 12.

figure-results-1 الشكل 1. نظرة تخطيطية للبروتوكول تجريبي. (A) الخلايا العصبية الحسية في الظهارة الشمية الرئيسية (وزارة التربية) أو الجهاز الميكعي الأنفي (VNO) من جهاز حاسة الشم من اكس تخدير وصفت المورق اليرقات عبر Electroporation للباستخدام ماصة زجاجية مملوءة بمحلول ديكستران الفلورسنت. يمكن أن يتبع من محاور الخلايا العصبية المسماة عبر العصب الشمي (ON) وتصل في نهاية المطاف إلى البصلة الشمية (OB). وتخدير (ب) الشرغوف ويتم التحقيق في الخلايا العصبية وصفت مرارا باستخدام مجهر متحد البؤر أو multiphoton في فترات زمنية محددة. (ج) زيادة تطوير أنماط النمو محور عصبي من الخلايا المسمى يمكن اتباعها على مدى فترات زمنية من أيام إلى أسابيع.

figure-results-2
الشكل 2. كهربائيtroporation من الخلايا العصبية الحسية في الجهاز الشمي. (A) Electroporation للمع الماصات مقاومة منخفضة يؤدي إلى وضع العلامات من عدة خلايا في الجهاز الشمي. في هذا المثال التمثيلي كانت ملطخة متعددة الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORNs، النصال شغل) واثنين من خلايا عمودية على شكل دعم (SCS، العلامات النجمية). الخطوط المتقطعة ترسيم حدود ظهارة الشم (عمر الفاروق). (ب) صقل المعلمات Electroporation لل، على سبيل المثال، زيادة مقاومة ماصة، يحد من عدد من الخلايا المسمى. في هذا المثال، تم صبغ الخلايا العصبية الحسية واحدة (النصال شغل) واحد المجاورة دعم الخلية (النجمة) بعد Electroporation لل. ملاحظة محور عصبي واحد ترك الظهارة الشمية (النصال مفتوحة). (C) الناجح Electroporation للخلية واحدة يؤدي إلى وسم خاص من الخلايا العصبية الحسية الفردية (شغل رأس السهم) ومحور عصبي متصل بها (النصال مفتوحة) في الظهارة الشمية.

figure-results-3
الشكل 3. تصور التوقعات محور عصبي حاسة الشم في البصلة الشمية رفعه. (A) وطوبولوجيا الخشنة من التوقعات محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية في البصلة الشمية يمكن تصور استخدام أقل الماصات Electroporation للمقاومة. وصفت واحدة الشم نصف الكرة مبة وما يرتبط بها من العصب الشمي لها (ON). تم electroporated أربعة dextrans إلى جانب fluorophores مختلفة في أربعة أماكن بعيدة من الجهاز الشمي: الجانبي (الأخضر)، متوسطة (الصفراء)، وسطي زارة التربية والتعليم (أحمر) وVNO (البرتقالي). وهذا يسمح تصور لمبة حاسة الشم التبعي (AOB) وحقول الإسقاط الثلاثة الرئيسية من البصلة الشمية الرئيسية (MOB). (CE) أمثلة على محاور عصبية شمية واحدة توقع في البصلة الشمية وتشكيل arborizations معنقدة / نقاط الاشتباك العصبي في الكبيبات كروية (النصال شغل). لاحظ أنه في اكس المورق محاور عصبية شمية المشعب بانتظام (النصال مفتوحة) قبل الاتصال احدا أو اثنين أو متعددة الكبيبات (النصال شغلها، كما يرى Hassenklöver ومانزيني 12).

figure-results-4
الرقم 4. في الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير احدة من محاور الخلايا العصبية الشمية. (AE)بعد نجاح Electroporation للخلية واحدة محور عصبي وصفت يمكن تصور مرارا في البصلة الشمية (OB). يوضح هذا المثال محور عصبي الفردية التي تم التحقيق لمدة أسبوع واحد. لا يغير مورفولوجيا العام إلى حد كبير ويمكن تحديد نقطتين المتفرعة الكبرى (النصال مفتوحة). لاحظ أنه على مدار الوقت، خصل الكبيبي واحد يخضع تخفيض مستمر (شغل رأس السهم)، في حين لا تزال الأخريين خصلات الكبيبي مستقرة (النجمة). (FI) يوضح هذا المثال التمثيلي جدوى من الملاحظات على المدى الطويل كما تم التحقيق هذا محور عصبي معين لأكثر من ثلاثة أسابيع. ويمكن الكشف عن أي تغيير واضح من نمط نموها. (JL) ويصور مثال على محور عصبي حسي غير ناضجة في عملية النمو. لم ترتبط بعد ذلك إلى الكبيبات وخصلات الكبيبي مميزة مفقودة. بعد 5 أيام وممدود الفروع محور عصبي، منقسمة محور عصبي عدة مرات وarborizations الجميلة هيأنشئت.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراء التجريبي وصفها هنا يسمح وضع العلامات الخلايا العصبية الحسية من الجهاز الشمي من اليرقات X. المورق بواسطة الصعق الكهربائي من dextrans يقترن fluorophore والتصور اللاحق للنمو محور عصبي حسي في الحيوانات الحية. من خلال تغيير معالم Electroporation للفي الجسم الحي من الممكن السيطرة على عدد الخلايا العصبية الحسية المسمى. وبالتالي فمن الممكن لتسمية مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية الحسية من الظهارة، وعدد قليل جدا أو حتى خلايا مفردة.

لضمان تمديد المطلوب لوضع العلامات العصبية من المهم توخي الحذر بشكل خاص حول خصائص ممص مكروى والبقول Electroporation لل. يمكن المقاومات ماصة أعلى والحد من الجهد نبض السعة والمدة وعدد من حالات التكرار تقلل من كمية الخلايا المسمى، في حين خفض المقاومة ماصة وارتفاع الجهد نبض السعة والمدة وعدد النبضات يمكن أن يؤدي إلى وضع العلامات أكثر انتشارا. عشراستخدام البريد من dextrans الفلورسنت ل electroporation يوفر ملاحظات مرئية فورية إذا كان تطبيق الإعدادات المناسبة. يجب الحرص على أن استخدام المعلمات لاتساع ومدة وعدد النبضات التي تتجاوز القيم المنصوص عليها في بروتوكول يمكن أن تؤدي إلى تلف الخلايا أو حتى موت الخلايا 17. انسداد أو مكسورة نصائح من بال micropipettes يمكن أيضا أن تعيق Electroporation للنجاح.

في الجسم الحي Electroporation للفي الجهاز الشمي من X. المورق يقتصر على مراحل اليرقات منذ جلد الضفادع postmetamorphotic هو أكثر صرامة والتي لا يمكن اختراقها بسهولة مع ممص مكروى. التصور في الجسم الحي من العمليات العصبية يمكن أن يعوق تناثر الضوء الإثارة / الانبعاثات في المناطق الأكثر عمقا في الدماغ أو عن طريق الأوعية الدموية. تصبح هذه مشكلة واضحة خاصة في مراحل اليرقات أعلى بسبب الدماغ أكبر ويمكن أن يؤدي إلى إشارات صاخبة جعل تحديد واضح لعمليات محور عصبي غرامة أكثر صعوبة.

تصاريح بروتوكول المعروضة لتصور الخلايا العصبية الحسية في نظام حاسة الشم سليمة دون تشريح الحيوان، وإتلاف الخلايا خلال وضع العلامات، وإعداد شرائح الأنسجة أو إصلاح الأنسجة عند الضرورة لطرق بديلة، مثل وضع العلامات في التصحيح خلية كاملة تجارب -clamp 18. عند الجمع بين العلامات القليلة احدة أو الخلايا العصبية الحسية في الجسم الحي مع مرور وقت التصوير، فمن الممكن تصور الاتصالات الكبيبي واحدة من الخلايا العصبية الحسية الناضجة على مدى فترات زمنية طويلة. بهذه الطريقة فإنه من الممكن أيضا لمراقبة تطور أنماط إسقاط محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية غير الناضجة على مدى عدة أسابيع. هذا الخيار الأخير هو اهتمام بوجه خاص لأنه يتيح مراقبة أنماط نمو محاور عصبية واحدة في الحيوانات الحية. هذا يفتح إمكانية للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في توجيه محور عصبي والاستطلاعية. عدة عوامل، بما في ذلك مستقبلات الرائحة التعبير، ومختلف الذخائر المتروكةوقد تبين أن الجزيئات التوجيه ن والتي يسببها الرائحة / النشاط العفوي من الخلايا العصبية الحسية لتنظيم النتيجة المستهدفة من محاور الخلايا العصبية الحسية 4،5.

ولا يقتصر تطبيق البروتوكول إلى الخلايا العصبية الحسية الشمية، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على دراسة أنواع الخلايا الأخرى، على سبيل المثال، الخلايا الجذعية / السلف من المناطق العصبية من الدماغ النامي أو الخلايا التاجية من البصلة الشمية. بالإضافة إلى تقنية أثبتت ويمكن أيضا أن تستخدم في تركيبة مع dextrans الحساسة الكالسيوم أو حقن الأصباغ الكالسيوم غشاء منفذ للحصول على المعلومات الوظيفية حول الخلايا العصبية المسماة و / أو الدوائر المتصلة 7،19. توفر مجموعة واسعة من fluorophores إلى جانب dextrans يسمح وضع العلامات من الخلايا الفردية متعددة أو السكان مع ألوان مختلفة. البلازميد أيضا حل الحمض النووي، على سبيل المثال لترميز البروتينات الفلورية، هو مناسبة ل electroporation ويمكن زيادة تعزيز versatiliتاي وفائدة هذه التقنية 6. يمكن زيادة تعزيز بروتوكول للسماح للElectroporation للمجتمعة dextrans وDNA أو morpholinos تهمة التلاعب التعبير الجيني 13،17.

الطريقة الموصوفة يمثل بالتأكيد أداة جديدة للتحقيق في مجمع والعمليات لا تزال غير مفهومة تماما أن تنظيم التوجيه محور عصبي في النظام الشمي الفقاريات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل DFG Schwerpunktprogramm 1392 (مشروع MA 4113 / 2-2) ، ومجموعة التميز ومركز أبحاث DFG للفحص المجهري النانوي والفسيولوجيا الجزيئية للدماغ (المشروع B1-9) ، ووزارة البحث والتعليم الألمانية (BMBF ؛ المشروع 1364480).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
SZX16أوليمبوسمجهر مجسم مع إضاءة فلورية
Axon Axoporator 800Aالأجهزة الجزيئية خليةواحدة المثقور الكهربائي
ELP-01Dnpi الإلكترونيةالمثقور
الكهربائي MMJM & auml ؛ rzh ä المستخدم WetzlarManual micromanipulator
P-1000Sutterمجتذب الماصات الدقيقة الأفقي
G150F-4Warner Instrumentsالشعيرات الدموية الزجاجية لتصنيع الماصة الكهربائية ؛ خيوط داخلية تجعل الردم أسهل
Alexa 488-dextran 10 kDLife TechnologiesD22910
Alexa 546-dextaren 10 kDLife TechnologiesD22911
Alexa 568-dextaren 10 kDLife TechnologiesD22912
Alexa 594-dextaren 10 kDLife TechnologiesD22913
TMR-dextaren 3 kD (micro-Ruby)Life TechnologiesD7162
أطراف ماصة MicroloaderEppendorf930001007
Tricaine (إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات)Sigma-AldrichE10521مخدر ؛ استخدم القفازات
A1-MPنيكونمجهر متعدد الفوتون
LSM 780Zeissمجهر متحد البؤر
ImarisBitplaneبرنامج بديل لتتبع الخلايا العصبية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells. J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).
  2. Schwob, J. E. Neural regeneration and the peripheral olfactory system. Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).
  3. Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration. Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).
  4. Lodovichi, C., Belluscio, L. Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry. Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).
  5. Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain). Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).
  6. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
  7. Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits. J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).
  8. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).
  9. Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
  10. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), (2008).
  11. Gliem, S., et al. Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream. Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).
  12. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).
  13. Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).
  14. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
  15. Coupé, P., Munz, M., Manjón, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. A CANDLE for a deeper in vivo insight. Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).
  16. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
  17. Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
  18. Nezlin, L. P., Schild, D. Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).
  19. Nagayama, S., et al. In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits. Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Olfactory SystemAxonal GrowthIn Vivo LabelingElectroporation TechniqueConfocal MicroscopyMultiphoton MicroscopySensory NeuronsXenopus LaevisTime Lapse ImagingAxonal Morphology

مقالات ذات صلة