مقالة منهجية

Regioselective Biolistic استهداف عضوي في الدماغ شرائح باستخدام بندقية الجينات المعدلة

DOI:

10.3791/52148

⸱

أكتوبر 24, 2014

 ,  ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 2MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سمحت التحسينات الحديثة في مستحضرات شرائح الدماغ العضوية باستغلالها لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية. تحافظ الشرائح العضوية على الخصائص الهيكلية المحلية لعلم الأحياء في الجسم الحي ، بما في ذلك الوصلات المشبكية الوظيفية. نقدم هنا طريقة تسليم بيولوجية انتقائية لتسمية هذه الشرائح ومعالجتها وراثيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان ترنسفكأيشن من الحمض النووي لا تقدر بثمن للعلوم البيولوجية ومع التطورات الحديثة لعضوي النمط الاستعدادات شريحة الدماغ، وتأثير الجينات المختلفة مغاير وبالتالي يمكن تحقيق بسهولة مع الحفاظ على جوانب كثيرة من الجسم الحي في علم الأحياء. كان هناك اهتمام متزايد لبالنقل الخلايا العصبية متباينة عضال التي كانت طرائق نقل التقليدية محفوف بالصعوبات مثل عوائد منخفضة وخسائر كبيرة في قدرتها على البقاء. ترنسفكأيشن Biolistic يمكن الالتفاف العديد من هذه الصعوبات فقد تم تعديل هذه التقنية حتى الآن إلا في الآونة الأخيرة بحيث تكون قابلة للاستخدام في أنسجة الثدييات.

وقد عززت التعديلات الجديدة إلى غرفة مسرع دقة اطلاق النار من بندقية الجينات وزيادة أعماقها من التغلغل في الوقت الذي تسمح أيضا استخدام انخفاض ضغط الغاز (50 رطل) دون فقدان الكفاءة ترنسفكأيشن وكذلك السماح للانتشار regioselective تركيزا للسلطة الفلسطينيةrticles في حدود 3 مم. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية هي على التوالي إلى الأمام وأسرع أداء من microinjections مملة. كلا عابرة والتعبير مستقر ممكنة مع جسيمات متناهية الصغر القصف حيث يمكن الكشف عن episomal التعبير خلال 24 ساعة، وتبين بقاء الخلية ليكون أفضل من أو يساوي على الأقل، بالطرق التقليدية. هذا الأسلوب له إلا واحد ميزة حاسمة: فهو يسمح ترنسفكأيشن ليكون موضعيا داخل دائرة نصف قطرها واحد ضبط النفس مما يتيح للمستخدم لعزل تشريحيا تأثيرات الجين مغاير ل. هنا نقدم بروتوكول متعمقة لإعداد الكبار قابلة للحياة شرائح عضوي النمط ورفعها إلى regioselective ترنسفكأيشن باستخدام مدفع الجينات المحسنة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تأسست أصلا تقنية biolistic، عبارة تحول من ل"المقذوفات البيولوجية"، على الجسيمات بوساطة نقل الجينات إلى الخلايا النباتية 1. هذه الطريقة المادي للتحول الخلية يسرع الجزئي أو النانوية في سرعة عالية للتغلب على الحواجز المادية للأغشية الخلايا منيعة من أجل إيصال الشحنات مثل الحمض النووي أو الأصباغ. لأنها لا تعتمد على مستقبلات يجند محددة و / أو الخصائص الكيميائية الحيوية في الأغشية سطح الخلية، بوساطة الجسيمات نقل الجينات يمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية مثل شرائح الدماغ عضوي النمط.

باستخدام شرائح عضوي النمط لها مزايا أكثر من غيرها من منصات في المختبر لأنها الحفاظ على العديد من الخصائص التشريحية والكيميائية الحيوية التي تتصل في الجسم الحي البيولوجيا 2-4. شرائح حفاظ معظمها الخصائص المعمارية المحلية من حيث أنها قد نشأت وبريزرلقد نشاط كيميائي عصبي والتواصل بين نقاط الاشتباك العصبي. استخدام شرائح الدماغ للبحوث الأساسية، والمساعي الأدوية، زادت بصورة متزامنة مع عدد من التلاعب التكنولوجيا الحيوية الممكنة لقياس ورصد السلوكيات العصبية الحيوية في الدماغ في الجسم الحي في مثل السياق 3،5-7. المزايا الرئيسية لاستخدام أنظمة الفحص القائم على شريحة عضوي النمط هو أنه يوفر سيطرة التجريبية سهلة ويتيح التلاعب دقيقة من بيئات خارج الخلية.

مثمر، تم إنشاء أنظمة ثقافة شريحة عضوي النمط من مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ مثل، ولكن لا تقتصر على، القشرة، والحبل الشوكي والمخيخ 8-10. علاوة على ذلك، تظاهر عدد من cocultures، والتي تسمح بتقييم الاتصالات بين الخلايا في مناطق الدماغ البعيدة وكذلك بين الخلايا العصبية والخلايا المرضية 11،12. وقد تم إنشاء العديد من البروتوكولات لقuccessfully شرائح ثقافة عضوي النمط ويمكن الحفاظ على الاستمرار في الأجل الطويل والعديد من الدراسات الحديثة الآن تستخدم أساليب واجهة الغشاء ومختلف التعديلات عليها 13. يحافظ هذا المبدأ شرائح عضوي النمط في واجهة بين المتوسطة وجو الحاضنة ترطيب عن طريق وضع شرائح على فلتر غشاء مسامي. وبالتالي يمكن للمتوسطة توفير المواد الغذائية الكافية لإطعام شرائح عضوي النمط عبر الحركة الشعرية. عادة تم إعداد شرائح من الحيوانات في وقت مبكر بعد الولادة (3-9 أيام القديمة، P3 - 9). ومع ذلك، أنسجة المخ من هذه الشرائح عرض على مستوى عال من اللدونة الخلوية ولها المقاومة المتأصلة للضغوط الميكانيكية، وهو أمر مفيد للحصول على الثقافات قابلة للحياة، بعد أن نقاط الاشتباك العصبي ناضجة والدوائر تشريحي عصبي لم تتطور بشكل كامل في الجسم الحي حتى 2 إلى 3 أسابيع من العمر 14. على سبيل المثال، كانت الملاحظات السابقة أظهرت أن شرائح قرن آمون تم الحصول عليها من P0 - 1 حديثي الولادة، على الرغم من درجة عالية viabلو بعد إعداد، فقدت تدريجيا بعض الخصائص المورفولوجية. في الأساس، وعرضت عليهم أن يكونوا غير صالحة للثقافات على المدى الطويل مما يدل على خلايا غير ناضجة كانوا أكثر عرضة للإزالة يفرق مقارنة الثقافات عضوي النمط من الحيوانات القديمة 15،16. لهذا السبب فقد تم تحسين أسلوبنا لشرائح الدماغ الكبار عضوي النمط الذي النضج والتطور العمراني وصلت إلى المراحل النهائية من 13،17-21. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لحديثي الولادة وشرائح عضوي النمط الأحداث.

مرة واحدة وقد تم إنتاج شرائح عضوي النمط قابلة للحياة لوحة كاملة تحتوي على شرائح يمكن جلبها إلى جبل biolistic وتقديمها إلى regioselective التسليم وترنسفكأيشن. التركيب الصحيح للبندقية الجينات (كما هو موضح في الشكل 1)، موجهة 90 ° على مسافة 10 ملم مباشرة على شرائح (من الفتحة إلى الأنسجة)، يسمح تسليم biolistic السريع ل40 نانومتر يذهبدينار الجسيمات مغلفة الشحنات. هذه الشحنات مثل الأصباغ وناقلات DNA الفلورسنت، وكذلك أي جين من الفائدة، يتم تسليم بسهولة في شرائح قابلة للحياة بكل سهولة. وبالتالي هذه الطريقة يصف بروتوكول الضرورة أن يسلم، بطريقة regioselective والبضائع المغلفة جزيئات الذهب إلى شرائح عضوي النمط الدماغ قابلة للحياة. يمكن أن ينظر إلى برميل بندقية الجينات والتركيب الأمثل في الشكل 1. لمزيد من المعلومات حول تحسين برميل جسيمات متناهية الصغر والمقذوفات، يرجى الاطلاع اوبراين، وآخرون 17.

يشار إلى التحسينات اللاحقة أيضا للمستخدم لتحسين ظروف مثل كمية مناسبة من الذهب تسليمها في المنطقة المستهدفة، الذي يعرف بأنه Microcarrier تحميل الكمية (MLQ)، وتحديد كمية الحمض النووي تحميل لكل ملغ من الذهب، الذي يعرف بأنه نسبة DNA تحميل (DLR). قبل ترسيب الحمض النووي على جزيئات الذهب وتحميلها في أنابيب Tefzel التي تضم خراطيش بندقية الجينات الفعلي "9؛، فمن الضروري حساب كمية الحمض النووي والذهب المطلوبة لكل ترنسفكأيشن التي يمكن أن تختلف قليلا بين الأنسجة والشروط (ينبغي الحفاظ على النسبة بين الذهب 1 ملغ و 1 ميكروغرام DNA إلى 1: 5). فمن الأهمية بمكان أن تعد نسبة مناسبة من MLQ إلى DLR وإلا DNA المغلفة جزيئات الذهب يمكن أن تلتزم معا تشكيل التكتل أكبر من المتوقع، والتي يمكن أن تقلل من التجانس العام للانتشار biolistic فضلا عن الأضرار زيادة الأنسجة وسمية الخلايا.

يظهر هذا الأسلوب التحسينات الأخيرة في تسليم biolistic، التي تم اختبارها وعازمة على أن تكون قابلة للشرائح الدماغ عضوي النمط حديثي الولادة، الأحداث والبالغين. وعلاوة على ذلك، من خلال استغلال انخفاض انتشار الجين بندقية برميل في biolistic، المستخدم هو الآن قادرة على بالنقل انتقائي منطقة المنضبطة في الدماغ. بعد فترة حضانة مناسبة، والتعبير عن البروتينات الفلورية، والتي تصل إلى أقصى معدلاتها بين 24 و 48ساعة، يمكن تصور بواسطة epifluorescence والفحص المجهري متحد البؤر. تسمح هذه fluorophores التحليل الصرفي وتوطين الخلايا الفردية داخل الهياكل ذات الصلة من الناحية البيولوجية. ومع ذلك، فإن تعديل regioselective من شرائح عضوي النمط من الجينات مغاير أخرى يمكن أيضا أن تراقب من قبل أي اختبارات أخرى قابلة لهذه الاستعدادات. يتم عرض استراتيجيات العمل الممكنة لتوصيل الجينات محلية في الشكل 2.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام الحيوانات والأنسجة الحيوانية يجب أن تلتزم بصرامة لموافقة اللجنة الأخلاقية وفقا لقواعد واللوائح المحلية. كل الأنسجة التي تم الحصول عليها خلال هذه الدراسة تلتزم المبادئ التوجيهية التجارب على الحيوانات في MRC-LMB ل.

1. إعداد المواد والثقافة وسائل الإعلام

  1. إعداد جميع الحلول باستخدام الماء ميليبور. استخدام الكواشف التحليلية الصف فقط. إعداد وتخزين كل الكواشف في RT (ما لم يذكر خلاف ذلك).
  2. جعل 500 مل من المياه المالحة HEPES مخزنة (10 ملي HEPES، 120 مم كلوريد الصوديوم 7.2 درجة الحموضة). تصفية من خلال 0.2 ميكرون وحدة تصفية العقيمة. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  3. جعل 500 مل من المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS و 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 مم KH 2 PO 4، 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، ودرجة الحموضة 7.4). تعقيم بواسطة التعقيم.
  4. إعداد المتوسطة الخلايا العصبية من خلال استكمال DMEM (متوسطة النسر Dulbecco لتعديل و) مع 25 ملي HEPES، و 10٪ مصل العجل الجنين، 30 ملي الجلوكوز، 1: 100 N2 سوpplement، البنسلين، الستربتومايسين 1،100 U / مل. الرقم الهيدروجيني 7.2. تصفية مع 0.2 ميكرون وحدة تصفية العقيمة. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  5. جعل حل بوفيدون (PVP) الأسهم مع 20 ملغ PVP في 1 مل 100٪ إيثانول. قسامة ذلك في 1 مل المبالغ تجميد وتخزينها في -20 درجة مئوية. الحل العمل هو 0.05 ملغ / مل، لذلك إضافة 10 ميكرولتر من محلول المخزون PVP لكل 4 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
  6. إعداد محلول المخزون 0.05 M إنتاج الأسبرميدين في الماء ميليبور. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2.
  7. جعل حل الاغاروز 2٪ في DMEM (2 ز الكهربائي الصف الاغاروز في 100 مل DMEM في المسمار غطاء زجاجة معقمة). هذا الميكروويف حتى يذوب الاغاروز. تخزين في الثلاجة 4 درجة مئوية لعدة أسابيع، إذا لزم الأمر.

2. إعداد عضوي النمط شرائح

  1. الموت ببطء C57 أسود 6 الفئران من العمر المطلوب من CO 2 الخنق تليها قطع الرأس. إزالة المخ باستخدام تخفيضات الجمجمة الجانبية ابتداء من الساعة ماغنوم الثقبة وتنتهي فيالفصوص الشمية. رفع بلطف الجمجمة من الخلف لفضح الدماغ.
  2. قطع بين فصوص الشم والقشرة الأمامية، ومنقاري إلى المخيخ. رفع بلطف جزء منقاري من الدماغ وقطع الأعصاب البصرية. أخيرا، وإزالة الدماغ ووضعه في طبق بتري مليئة مخزنة المالحة HEPES الجليد الباردة على الجليد.
  3. باستخدام مجهر تشريح، قشر بعيدا الحنون باستخدام ملقط غرامة. إزالة بعناية الأوعية الدموية والسحايا حول الدماغ.
  4. وضع الدماغ الطازجة في قالب المتلقي صغيرة وتغطية ذلك مع الحل الاغاروز تبريده الى أعلى قليلا RT. ثم تبرد بسرعة القالب إلى 4 درجة مئوية عن طريق وضعه على الجليد.
    ملاحظة: العملية شرائح بأسرع وقت ممكن لتجنب فقدان قدرتها على البقاء.
  5. وعندما وضعت الاغاروز (5-10 دقيقة)، وإزالة الدماغ agarose جزءا لا يتجزأ من العفن (تقليم إذا لزم الأمر)، ثم الغراء إلى منصة vibroslicer. وضع هذا في غرفة vibroslicer تحتوي على برنامج تلفزيوني الجليد الباردة العقيمة. ديsinfect الغرفة vibroslicer قبل استخدامها مع الايثانول 70٪ للحد من التلوث اللاحقة.
  6. قطع الدماغ باستخدام vibroslicer عرف بني أو ما يعادلها التجاري. كان مفهوم نموذج لتصميم تقطيع الأنسجة التي يمكن أن تولد السعة وارتفاع وتيرة تحركات كبيرة الأفقية إلى حافة النصل مع تقليل الاهتزازات العمودية.
  7. استخدام تردد التذبذب من 90 هرتز، في اتساع 1،5-2،0 مم، وشفرة القطع المتمركزة على زاوية 15 درجة على المستوى الأفقي. تعيين كتلة تصاعد الضغط على الدماغ جزءا لا يتجزأ من الاغاروز للتحرك في 1.7 مم / دقيقة نحو النصل. جمع أقسام (150 ميكرون) في غرفة تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة الباردة الجليد (DMEM القلم / بكتيريا + 10٪ FCS). عرض القطع والتلاعب في شرائح الأنسجة وفيديو تكميلي في أرسينو واوبراين (13).
  8. ضع بلطف الشرائح في إدراج ثقافة الخلية (0.4 ميكرون، 30 مم) في علبة 6 متعددة جيدا مع ميد ثقافةIA في الخارج من إدراج، واحتضان في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    ملاحظة: للحصول على قابلية الأنسجة السليمة، ويكون لطيف للغاية أثناء نقل والتلاعب الشرائح. أيضا، فإن الكثير من السوائل يمنع شرائح عضوي النمط من الانضمام إلى غشاء من إدراج التصفية. إذا حدث هذا، إزالة السوائل الزائدة أو لوحة مرة أخرى.
  9. على الرغم من شرائح عضوي النمط يمكن أن يكون مثقف لبضعة أسابيع، انتقل إلى ترنسفكأيشن في موعد أقصاه 4 أيام بعد الطلاء لأفضل العوائد ترنسفكأيشن.
    ملاحظة: لتجنب فرط الدبقية في ظروف الثقافة المدى الطويل، واستخدام أراك أو مصل المتوسطة مجانا 2.

3. إعداد المغلفة DNA مايكرو ونانو مقذوفات

  1. إعداد النانو مقذوفات باستخدام 40 نانومتر جزيئات الذهب قطر. لفترة وجيزة، إضافة 50 ميكرولتر من 0.05 M إنتاج الأسبرميدين و 10 ميكرولتر DNA في 1 ملغ / مل (pEYFP-N1) إلى 10 ملغ من جزيئات الذهب.
    1. إضافة الكالسيوم وإنتاج الأسبرميدين في مزيج الحلالبنية خلال DNA الذهب الجسيمات الصغيرة من أجل التحضير للمساعدة في ربط جزيئات DNA للجزيئات الذهب.
      ملاحظة: كمية من الحمض النووي المستخدمة لكل ملغ من ناقلات الذهب (DLR)، أن يتراوح بين 1 و 5 ميكروغرام الحمض النووي لكل 1 ملغ من الذهب. وعلاوة على ذلك، فإن كمية الجسيمات حاملة الذهبية التي سيتم تصويره في خرطوشة (MLQ)، ينبغي نفسها تتراوح 0،1-0،5 ملغ من الذهب. وDLR وMLQ يجب أن يحاكم والأمثل لكل مستخدم وفقا لنظام معين قيد التحقيق، فضلا عن نوع من الجزيئات والجينات بندقية المستخدمة.
  2. مزيج باستخدام الدوامة مع إضافة ببطء 50 ميكرولتر من 1 M CaCl 2 في أجزاء من 10-15 ميكرولتر. بعد 5 دقائق من vortexing لفي بعض الأحيان، الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 30 ثانية ثم إزالة طاف. resuspend الكرية الجسيمات الذهب في 3.5 مل من 0.075 M PVP.
  3. رسم هذا تعليق في أنابيب (قطر 2.36 مم داخلي) باستخدام حقنة. وضع الأنابيب في محطة إعداد الأنابيب. السماح للجزيئات الذهب ليستقر وإزالة طاف بواسطة الطموح مع حقنة. تدوير أنابيب لنشر بالتساوي جزيئات الذهب، والتي تم تجفيفها بعد ذلك تحت تدفق النيتروجين ثابتا عند 5 L لكل دقيقة.
  4. لخلق الحمض النووي الرصاص، وقطع الأنابيب باستخدام قطع الأنابيب إلى 1 سم أطوال. إما إدراج مباشرة في الجين خرطوشة بندقية أو الاحتفاظ المجفف (4 درجة مئوية) حتى المطلوبة.

4. Biolistic ترنسفكأيشن على شرائح عضوي

  1. تنفيذ الخطوات التالية ضمن معقم غطاء تدفق الصفحي.
  2. إدراج 9 V البطارية وحامل خرطوشة فارغة في بندقية الجينات هيليوس.
  3. إرفاق بندقية الجينات إلى خزان الهيليوم مع خرطوم الهيليوم. النار 2 - 3 الفراغات (فتحات فارغة) في 50 رطل للضغط خرطوم الهيليوم والخزانات في البندقية.
  4. تحميل الخراطيش تحتوي على الذهب المغلفة الحمض النووي في أصحاب خرطوشة وتحميل حامل في بندقية الجينات.
  5. فك الجينات بندقية هل وإرفاقلتعديل الجينات لماسورة البندقية بندقية الجينات.
  6. باستخدام ملقط معقم، وضع إدراج مرشح تحتوي على شريحة عضوي النمط في طبق بلاستيكية معقمة.
  7. إزالة وسائل الاعلام من شرائح عضوي النمط.
  8. ضبط ضغط الغاز في 50 رطل.
    ملاحظة: حماية العين أمر ضروري وحماية الأذن من المستحسن.
  9. وضع بندقية الجينات على مسافات مناسبة باستخدام تركيب قياس 10 ملم. الهدف بعناية وسط برميل على المنطقة المطلوب للتسليم الجيني.
  10. بعد اطلاق النار، استبدل تدرج مرة أخرى في طبق مع وسائل الإعلام الجديدة وإعادتها إلى ظروف النمو الطبيعية، أي 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الحاضنة.
  11. وبمجرد الانتهاء، إغلاق خزان الهيليوم، والإفراج عن الضغط من بندقية الجينات وفصل الجينات المدفع من خزان الهيليوم.
  12. إزالة حامل خرطوشة والتخلص من الخراطيش وتنظيف بندقية الجينات.
  13. فحص الأنسجة لمورفولوجيا واختراق ناجح من قبل visuaLIZING شرائح باستخدام مجهر مقلوب. إذا باستخدام المجهرية الدقيقة، تفريق بالتساوي الذهب. يجب أن تكون هناك مناطق كثيفة من جزيئات الذهب رأيت على شريحة. النانوية بسبب صغر حجمها لا يمكن أن ينظر إليها على أنها وحدة واحدة بواسطة تقنيات المجهر التقليدية.
  14. بعد الفاصل الزمني المناسب (عادة 1-2 أيام)، وتحديد الشرائح في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) للمراقبة المجهري.
    ملاحظة: تحديد في PFA ليس هو المطلوب دائما. لتصوير الخلايا الحية تجنب هذه الخطوة.

5. إصلاح والتخيل من شرائح الدماغ

  1. بعد ترنسفكأيشن biolistic، وتغسل شرائح مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة.
  2. إصلاح شرائح التي تفرخ في الطازجة، الجليد الباردة PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
  3. تغسل شرائح مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة.
  4. خفض بلطف الجولة الغشاء يدعم باستخدام مشرط، من دون إزعاج شرائح شنت عليها. استخدام الملقط لوضع كل غشاء دعم / شريحة على شريحة المجهر. ضع organotypشرائح جيم على رأس الغشاء على شريحة زجاجية.
  5. إضافة قطرة واحدة من وسائل الاعلام المتزايدة على أعلى شريحة وإضافة ساترة بلطف دون أي قوة على اتصال مباشر مع شريحة عضوي النمط.
  6. تأمين ساترة مع طبقة رقيقة من طلاء الأظافر.
  7. عرض شرائح على مجهر المناسب.

6. تطبيقات متحد البؤر

  1. تصور شرائح باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر تستقيم مع 60X / 1.4 الفتحة العددية (NA) الغمر النفط عدسة الهدف.
    ملاحظة: ميزة الأكثر إشكالية من المجهر متحد البؤر هو حجم الثقب (وضعت في 1 AU) وهو قادر على عزل وجمع طائرة من التركيز، وبالتالي القضاء على من التركيز "الضباب" ينظر عادة مع عينة الفلورسنت. وغالبا ما تحجب التفاصيل الدقيقة لهذا الضباب ولا يمكن الكشف في المجهر nonconfocal.
  2. تعيين ليزر الأرجون إلى الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر والأمثل لجمع مضوء itted في نانومتر الفرقة 500-520. عادة، وجمع الصور في 1،024 X 1،024 بكسل ومع رزمة من أقسام Z-0.5 ميكرون في فترات ليشمل العرض الكامل من كل الخلايا العصبية التي تم تحليلها.
    1. لمراقبة التشكل من نواة، ومكافحة وصمة عار هذه الخلايا مع دابي (الطول الموجي الإثارة التي حددت في 405 نانومتر وانبعاث ضوء جمعت بين 420-4 40 نانومتر). أخيرا، لفحص مضان أحمر، تعيين الليزر على 561 نانومتر للإثارة و565-620 نانومتر لالانبعاثات.
  3. عادة، والحصول على الصور باستخدام التكبير 4X المسح التي غطت مساحة 57.6 ميكرون 2. وكانت أحجام الصور في المنطقة من 1،024 خ 1،024 بكسل. مداخن سجل ض المقاطع في 0.5 ميكرون فترات والتوقعات من 5-8 إطارات مجتمعة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن رصدها الجدوى شريحة عضوي النمط مع النشاط نازعة اكتات، propidium يوديد وضع العلامات، وتلطيخ dUTP كما ذكرت سابقا 13،22. من الواضح، سلامة ونزاهة شرائح مهمة للتعبير المستدام على المدى الطويل من البضائع الوراثية تسليمها. بعد الولادة biolistic إلى شرائح عضوي النمط، تم رصد التعبير عن الجينات مغاير الفلورسنت بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويمكن رؤية ضيق من انتشار biolistic باستخدام برميل تعديل في الشكل 3A. الشكل 3B يظهر صورة ممثل منطقة الحصين transfected باستخدام الحمض النووي المغلفة جزيئات الذهب. ويبين الشكل 4 صور تمثيلية من transfected شرائح عضوي النمط الماوس الكبار. كما يمكن أن يرى في الشكل 4A، عصبون العصبية مع الميناء شجيري ملحوظا وجدت في واجهة الطبقة العصبية وطبقة الجزيئية من الحاخامينمعارض ebellum وضع العلامات وضوحا التالية ترنسفكأيشن biolistic عابرة مع pEGFP-N1. يبين الشكل 4B التكبير أعلى من هذه التشعبات حيث يمكن ملاحظة العمود الفقري. يبين الشكل 4C خلية الهرمية الموجودة في المنطقة CA1 من الحصين بعد الولادة biolistic من جزيئات الذهب pDSredFP المغلفة .

ويمكن أيضا الأصباغ بدلا من الفلورسنت المشفرة الشحنات الحمض النووي أن تستخدم بطريقة مماثلة لتصور الخصائص المورفولوجية في شرائح عضوي النمط. ديو، التي تصف أغشية البلازما، يمكن أن تحدد بسرعة أكبر الأشكال التضاريسية خلية فردية أو يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع biolistic DNA المغلفة تسليمها إلى نفس المنطقة لتأكيد regioselection. كما يمكن أن يرى في الشكل 5A الخلايا العصبية ملطخة ديو في قرن آمون يظهر أيضا التشعبات طويلة مع العديد من العمود الفقري. سهم يشير إلى محور عصبي التي حددها وجود حبات متشابك بالمقارنة مع dentritجيم العمود الفقري على neurites التي أخرى. يبين الشكل 5B مثال آخر على CA1، الذي يسلط الضوء على العديد من التوقعات الحصين مع وصمة عار دابي مضادة لتسمية النواة. يبين الشكل 5C التكبير أعلى من هذه الأنواع من التشعبات متوازية مع العديد من العمود الفقري.

من الواضح، هذه الصور توضح الخصائص المورفولوجية التالية وضع العلامات الخلوية. لا شيء يمنع نفس المنهجية من يتم تطبيقها لتقديم أي عدد من الجينات الخارجية المغلفة على جزيئات الذهب. للسماح تأكيدا البصرية ترنسفكأيشن ناجحة، البلازميد واحد يمكن بناؤها للمشاركة في التعبير عن كل من الجينات في المصالح والبروتين مراسل الفلورسنت على نفس النواقل.

figure-results-1
الرقم 1. جين بندقية برميل والمتزايدة. (A) وتحسين التي وضعها الدكتور أوبراين في MRC-LMB التي لديها انتشار biolistic المقيدة التي تقلل من تلف الأنسجة عن طريق خفض الضغط المطلوب لتسريع الجسيمات د برميل. (B) وعرض الجانب من بندقية الجينات الأمثل تصاعد وضعها الدكتور هندرسون والدكتور اندراس ناجي في جامعة تورونتو. وتصاعد يحمل بندقية الجينات في تمام 90˚ عمودي على شرائح عضوي النمط في حين تسمح للمستخدم التحكم بدقة المسافة التسليم biolistic. لشروط biolistic المثلى ينبغي أن توضع في فتحة برميل مباشرة على المنطقة من الفائدة على مسافة 10 مم من شرائح عضوي النمط (C) عرض مرة أخرى من بندقية الجينات المتزايدة. المنطقة ذات الاهتمام أن transfected تحتاج إلى وضعها مباشرة تحت فتحة برميل. يمكن استهداف أكد مع صبغة (diolistic) أو الفلورسنت tranfection البروتين (biolistic).عنخ "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. عضوي النمط إعداد شريحة واستهداف regioselective. (A) وDMEM جزءا لا يتجزأ من الكبار الماوس الدماغ جاهزة للتشريح. (B) تم لصقه القالب على vibroslicer تصاعد مع شفرة مستعدة لخفض شريحة. (C) Regioselective مغاير التعبير الجيني استراتيجيات لتسليم biolistic في الاكليلية شرائح الدماغ عضوي النمط. الصور المحضرة من الصور تم الحصول عليها من ألين المخ أطلس أطلس إشارة التشريحية 23. وتظهر لوحة مقتل اثنين من مناطق الدماغ المختلفة المستهدفة كمثال. لتقييد التعبير الجيني (1) إلى المنطقة القشرية من نصف الكرة المخية الأيسر. لتقييد التعبير الجيني مغاير (2) إلى منطقة ما تحت المهاد في الدماغ. وتظهر لوحة المتوسطة ثار التعبير عن اثنين من الجينات مغاير (3 و 4) يمكن أن تكون معزولة ويقارن الحصين اثنين من نصفي الكرة الأرضية في نفس شريحة عضوي النمط، والقضاء على أي تحيز أساسا من استخدام أقسام مختلفة و / أو منح إمكانية لمعالجة تداخل الإشارات البعيدة من آثار تلك الجينات. وتظهر اللوحة اليمنى التداخل المحتمل للتسليم المعدلة وراثيا للتعبير الجين الأول (5) في المنطقة القشرية دقيقة في حين معربا عن جين آخر (6) في المتباينة منطقة القشرية بعد متداخلة. هذا يسمح لتحليل تأثير التشكيل الجيني للكل جين مغاير وحده، وأيضا في تركيبة داخل نفس شريحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الرقم 3. نمط مبعثر Biolistic ينظر على FILTإيه الورق ومنخفضة تكبير الصورة. أطلق (أ) تحسين برميل على ورق الترشيح إلى تحديد مدى انتشار جزيئات الذهب. يظهر الجانب الأيسر توزيع تحسن برميل في حين تظهر اللوحة اليمنى برميل العادي. أسود شريط: 1 سم. صورة مأخوذة من اوبراين، وآخرون 17. (B) منخفضة تكبير الصورة تظهر طقطق ترنسفكأيشن ستوكاستيك داخل 3 ملم انتشار biolistic داخل المنطقة الحصين من 6 أسابيع الفئران القديمة. شريط أبيض: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الرقم 4. Biolistic تسليم الفلورسنت البروتين المشفرة DNA إلى شرائح عضوي النمط من 6 أسابيع الفئران القديمة. (A) Inverteد الصور مبائر من شريحة عضوي النمط الثابت من المخيخ خلية العصبية pEGFP-N1 جزيئات الذهب المطلي transfected. أخذت الصورة في 40X التكبير. أسود شريط: 30 ميكرومتر (B) يظهر 60X التكبير من ميناء تغصنية الخلايا العصبية أخرى لتسليط الضوء على العمود الفقري. أسود شريط: 5 ميكرون (C) يظهر صورة مبائر من شرائح ثابتة مأخوذة من منطقة قرن آمون في 60X التكبير من أربعة DSredFP transfected الخلايا الهرمية. أسود شريط: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
ويبين الشكل 5. التسليم Diolistic من وضع العلامات غشاء الأصباغ الفلورية إلى شرائح عضوي النمط (A) التصوير حية من الخلايا العصبية الحصين لabeled مع ديو تحت 20X التكبير. يمكن ملاحظتها بوضوح في العمود الفقري تغصنية فضلا عن محور عصبي كما حددها غياب العمود الفقري تغصنية وجود حبات متشابك المشار إليها بواسطة السهم الأبيض. شريط أبيض: 30 ميكرومتر (B) تلطيخ منطوقة المنطقة الحصين المسمى مع ديو و counterstained مع دابي. شريط أبيض: 30 ميكرون (C) التكبير العالي (60X) من العمود الفقري تغصنية وجدت في المنطقة CA1 من الحصين. شريط أبيض: 5 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف بروتوكول النهج لتقديم الأصباغ والمواد الوراثية إلى شرائح عضوي النمط الكبار باستخدام مدفع الجينات المحسنة. أساسا، وأنواع الأصباغ ومتنوعة من الجينات المحتملة تجعل هذه الطريقة متعددة الأوجه وقابلة للرد على مجموعة واسعة من المسائل البيولوجية. طريقة التسليم regioselective المستخدمة، في هذه الحالة لمنطقة محددة في الدماغ، ويفتح آفاقا جديدة للتجريب وتعديل الجينات مغاير من مناطق محددة داخل بنية ذات الصلة بيولوجيا لم يكن ممكنا بسهولة من قبل. فقد قررنا سابقا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في شرائح عضوي النمط الكبار، حيث تتشكل نقاط الاشتباك العصبي ناضجة تماما، حيث أظهرت تحسن بقاء الخلية ومغاير التعبير الجيني لعدة أسابيع 13. مع ظهور ظروف ثقافة جديدة ومحسنة لأدمغة الثدييات، فضلا عن الأنسجة الأخرى، فإن استخدام التحويرات الوراثية regioselective تصبح مفيدة بشكل متزايد لطائفة واسعة من biocheيحلل mical.

كما يجب علينا تسليط الضوء هنا وسابقا من قبل الآخرين 24 أعلاه، يمكن أن تؤثر العديد من العوامل المختلفة بسهولة ودقة وموثوقية تسليم biolistic. أولا، إعداد الجسيمات الذهب مرتبطة الأصباغ أو الحمض النووي يجب أن تكون متوازنة بشكل كاف لمنع تجميع وتسهيل طرد البضائع خرطوشة. الكالسيوم وإنتاج الأسبرميدين في جسيمات متناهية الصغر حل DNA الذهب يمكن أن تساعد على ربط جزيئات DNA للجزيئات الذهب. القدرة على الجسيمات النانوية لاختراق الخلايا تحت ضغط منخفض تم تحديد سابقا 17. ثانيا، وبندقية الجينات يجب أن يتم تنظيمها ثابت ممكن مع الزاوية الصحيحة والمسافة. مقياس الضغط موثوقة أيضا أمر ضروري للاستنساخ، للحفاظ على سلامة الأنسجة، والإسراع بشكل صحيح جزيئات الذهب إلى أهدافهم المحددة. في الواقع، والمسافة، والتوجه، والاستقرار من المعدات أيضا على العوامل الحاسمة للرargeting ودقة التسليم regioselective. وهذه الهياكل الدماغ هي صغيرة جدا، يمكن أن الاختلافات الطفيفة في زاوية اطلاق تجعل بسهولة الإجراء بأكمله أقل موثوقية. وأخيرا، تم محفوفة إعداد وصيانة شرائح عضوي النمط قابلة للحياة مع الصعوبات لعدة عقود بعد بروتوكولات وفيرة وموثوقة لحيوانات مختلفة، مناطق الدماغ والأعمار وcocultures تتوفر 2،4،25،26 حاليا. وينبغي أن تكون هذه الإجراءات قبل تقديم الأنسجة إلى إجراءات biolistic الأمثل الاستعمال. هذا سوف يسمح بسهولة أكبر للمستخدم للتأكد unbiasedly تأثير الجسيمات biolistic وتأثير الجين مغاير على ثقافتهم. لهذه الغاية، واستخدام الجينات الفلورية مثل EYFP وEGFP على حد سواء يمكن أن تسمح للمستخدم رواية لاختبار دقة الاستهداف وأيضا اتباع جدوى الخلوية من خلال مغاير التعبير الجيني على مدى فترة طويلة من الزمن 13. العديد من الخطوات الحاسمة لموثوقيةواستنساخه استخدام هذا البروتوكول يتم تسليط الضوء في الفقرات الثلاث التالية.

لترنسفكأيشن كفاءة، يجب أن يكون تركيز الحمض النووي المناسب. أن تركيزات التي هي منخفضة جدا تعيق العائد ترنسفكأيشن في حين أن تركيزات مرتفعة جدا يمكن أن تسبب التكتل من الجسيمات النانوية. يمكن الركام من الذهب الحد بشكل كبير من كفاءة ترنسفكأيشن، يسبب توزيعات متفاوتة، ويمكن أن تؤدي إلى زيادة السمية الخلوية والاكسدة. مشاكل مع كفاءة الطلاء من المحتمل بسبب انتهاء الحل سبيرمدين (يجب أن يتم استبدال كل 2 إلى 3 أشهر). لانتشار biolistic كافية، يجب أن يكون وضع العلامات حتى. قد يكون راجعا إلى حل PVP ووضع العلامات غير متجانس من تعليق جسيمات متناهية الصغر الذهب / DNA. كما ينبغي استبداله كل 2 إلى 3 أشهر. ويمكن رؤية طلاء من الذهب النانوية على الاغاروز الكهربائي للهلام باعتباره أعلى ميغاواط الفرقة 27.

كل SYST البيولوجيم قيد التحقيق وكذلك كل صك المختلفة المستخدمة قد تتطلب تغييرات طفيفة في ضغط الغاز ليصل إلى مستويات الأمثل من ترنسفكأيشن وانتشار biolistic. المعلمة الحرجة هي ضغط نبض الهيليوم المطلوبة لتجريد المتناهية الصغر أو النانو شركات من خرطوشة من البلاستيك ودفعهم إلى الأنسجة. وهناك ضغط الغاز المرتفع يؤثر على بقاء الخلية، لأنه سيخلق موجات صدمة عبر المستهدفة وتعطيل أو فصل الأنسجة من مصفوفة 17. تهدف برميل بندقية الجينات وجود جهاز بالضبط عمودي على الأنسجة المهم للدقيقة تسليم biolistic. يجب وضع المنطقة المحددة في وسط المباشر للبرميل بحلول الساعة بدقة 10 مم من الفتحة الخارجية. هذه النتائج في القطر 3 ملم من تسليم الجسيمات الذهب حول مركز الزلزال. يجب تنظيف بندقية برميل الجينات مع الايثانول 70٪ بعد كل استخدام. لحماية الأنسجة من المجاميع الجسيمات الكبيرة، ويحتوي على برميل أيضا شبكة من النايلون التي SHOالصوفية استبدالها بانتظام للحفاظ على الأداء الأمثل. من أجل استبدال شبكة فك الغطاء ثم إدراج شبكة من النايلون جديدة بين الغطاء ويا الدائري.

Fluorescently الخلايا المسمى يجب أن يكون مرئيا على الأقل 1 - 2 بعد أيام ترنسفكأيشن حول مركز الزلزال. غياب أو اختلال وضع العلامات يمكن أن تنجم عن عدم كفاية الإعداد وعدم الاستقرار من تركيب مدفع الجينات. ملاحظات الخلايا باستخدام متحد البؤر المجهري يعتمد على عدد من العوامل: الطول الموجي للضوء الإثارة / الانبعاثات، وحجم الثقب، NA للعدسة موضوعية، معامل الانكسار من المكونات في مسار الضوء، وعمق الأنسجة، ومحاذاة الصك. ينبغي أن يكون الأمثل لكل هذه العوامل نظام قيد التحقيق.

تم استغلال التطورات الحديثة في biolistics لنجاح هذا الأسلوب. تم تعديل برميل بندقية الجينات المستخدمة في هذه الدراسة من أجل تقليل الضغط اللازم وكذلك قمع وbiolisticنمط مبعثر إلى منطقة أكثر مقيدة ومحددة 17،19. وقد حاول التعديلات برميل أخرى إلى تقييد انتشار biolistic وتخفيف الضغط تدفق 28 بعد هذا الجين مصمم خصيصا بندقية برميل صممه الدكتور أوبراين هو مكون واحد تركيبها على معيار بندقية الجينات هيليوس. بعد ذلك، تم استخدام جزيئات الذهب ميكرومتر الفرعي للحد من الغزو الجسيمات ميكرون أننا قد سبق تحديدها تسبب تلف الخلايا وفي نهاية المطاف، وفقدان متواصل مغاير التعبير الجيني. هذه التغييرات إلى إجراء biolistic تحسنت جدوى الشامل واستنساخ طريقة 13. التحسينات الأخرى على إعداد شريحة مثل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في عمق إجراء تشريح، وذلك باستخدام مصفوفة DMEM-الاغاروز للحفاظ على الدماغ، والعديد من الإنجازات الأخرى المفيدة في إعداد عضوي النمط شريحة الدماغ ذكرت سابقا 13 مكنتنا من استكشاف استخدام شرائح الكبار التي وضعت ناضجةشبكات متشابك.

في دراستنا استخدمنا أساسا الأصباغ الفلورية والجينات مغاير لتصور مورفولوجيا الخلايا وقراءات على كفاءة ترنسفكأيشن وقدرة على صورة الخصائص المورفولوجية من الخلايا العصبية في أنسجة مخ الفأر. إشارة إلى نسبة الضوضاء من تسليم ستوكاستيك داخل دائرة نصف قطرها محدد مكنتنا لعزل تماما الميناء خلية واحدة في تغصنية ضمن سياقها الأصلي. كما تستخدم العديد من الجهود للتحقيق في هذه الخصائص المورفولوجية، ورسم الخرائط "connectomics" أو لتسمية الخلايا واحد للتحليلات مختلفة، يمكن بسهولة الجمع بين هذه الطريقة مع البروتوكولات القائمة مثل الكهربية ومحوار القياسات 29،30. من الواضح، أن مجموعات من الجينات مغاير الفلورسنت تمكن من إجراء ترسيم أكثر قوة بكثير من الخلايا واحد وتوزيع مؤشر ستوكاستيك من البروتينات الفلورية، والجمع بينهما أن تحديد اللون من الخلايا الفردية 31،32. استخدام المروجين خلية معينة مثل synapsin الدبقية البروتين وحمض ييفي المنبع من اكسون جين مغاير يمكن أيضا تقييد التعبير إلى مجموعات سكانية فرعية 33. في الواقع، ويمكن أيضا أن يتم تسليم متنوعة لا تنتهي من المادة الوراثية بطريقة regioselective من الذهب النانوية باستخدام هذا الإجراء نفسه. وبالتالي يمكن تحليلها مجموع transfected المناطق مع الأساليب التقليدية، مثل تشريح وتقديم تلك المنطقة إلى immunoblotting الغربي لتحليل تأثير المترجمة من الجين مغاير.

والتحسينات في إجراءات شريحة عضوي النمط تسمح أيضا التوسع في استخدام أنسجة المخ لإجراء التجارب على المدى الطويل وكذلك تصريح استخدام الأنسجة وcocultures الأخرى وسيسهل الإجراءات ترنسفكأيشن. الدهون والبوليمر ترنسفكأيشن وقد ذكر سابقا أن تؤثر على توازن الغشاء، استيعاب، نفاذية البروتين 34 و كثيرا ما تظهر كفاءة منخفضة جدا لبالنقل الشركة المصرية للاتصالاتrminally متباينة الخلايا العصبية. خلية استهداف البضائع المحدد هو أيضا قابلة فقط إلى الخلايا التي تعبر عن مستقبلات سطح الخلية اللازمة لاستيعاب، وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تكون انتقائية للغاية، ويمكن أن تفتقر regioselectivity 35 المستهدفة. ناقلات فيروسية وغير ذلك غالبا ما تكون صعبة ومكلفة لإنتاج، تتطلب أنظمة صارمة ويكون في بعض الأحيان أظهرت مخاوف تتعلق بالسلامة. وبالتالي تسليم Biolistic لديه قدرة لا مثيل لها لبالنقل regioselectively الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى داخل أنسجة قابلة للحياة. والذهب هو غير سامة، المزيد من التقدم في استخدام biolistics يمكن أن يمهد الطريق للاستخدامات الطبية الحيوية مثل تسليم الأدوية عبر الجلد، موسع في الجسم الحي توصيل الجينات، وكذلك العلاجات الموضعية الجين nonviral.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحمل الدكتور جون أ. أوبراين براءات اختراع لبرميل بندقية الجينات المحسن. رقم براءة الاختراع الأمريكية 10/380,452 وبراءة الاختراع الأوروبية رقم 01974517.3.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر ورشة العمل MRC-LMB لإنتاج المعززة برميل مدفع الجينات. ونود أيضا أن نشكر الدكتور ديفيد ر هامبسون في جامعة تورونتو لاستخدام المعدات والموارد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام مسدس الجينات هيليوسBio Rad165-2431بندقية الجينات ومحطة إعداد الأنبوب
HEPES & nbsp ؛سيجما83264-100ML-F
كلوريد الصوديومسيجماS7653-250G
KClسيجماP9333-500G
Na2< / sub>HPO4< / sub>SigmaS7907-100G
KH2PO4SigmaP9791-100G
0.2 & micro; وحدة الفلتر المعقمةm MilliporeSCGPU05REلتصفية الوسائط
DMEMGibco21885-025
مصل ربلة الساق الجنينيةGibco10270-098
D-GlucoseSigmaG8270-100G
N2Life Technologies17502-048
البنسلين / الستربتومايسينسيجماp4333
PolyvinylpyrrolidoneSigma856568-100G
Ethanol  Sigma277649-100ML
SpermidineSigmaS2626
AgaroseBio Rad161-3100EDU
VibroslicerLaicaVT1200استخدمنا تصميم مخصص
حامل مسدسالمبني في المنزل في حاضنة
ثقافة الخلايا المرطبة
الجسيمات النانوية الذهبيةالتشخيص الخلويG-40-20
pEYFP-N1Clontech
الأنابيب القاطعBio Rad165-2422
Tefzel tubingBio Rad165-2441
برميلمخصص مصنوع من LMB
Cell Cell TransportMilliporePICM0RG50
ParaformaldehydeSigma76240 Fluka
تشريح المجهرللراحة
المجهرالمحدد المستخدم للاستخدام
الشريحة الزجاجيةVWR2588-CA48323-185
زجاج MicrocoverVWR2448-CA48366-067-1
Vectashield تصاعد الوسائطمختبرات ناقلاتH-1400 & nbsp ؛  
الجينات U of T متحد البؤر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Biotechnology. 24, 384-386 (1987).
  2. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  3. Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11(2013).
  4. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).
  5. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).
  6. Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2013).
  7. Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments. Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).
  8. Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors. J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).
  9. Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections. Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).
  10. Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors. Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).
  11. Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex. Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).
  12. Mingorance, A., et al. Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions. Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).
  13. Arsenault, J., O'Brien, J. A. Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun. BMC Research Notes. 6, 544(2013).
  14. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
  15. Laywell, E. D., et al. Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres. J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).
  16. Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord. Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).
  17. Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
  18. Brien, J., Unwin, N. Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).
  19. Brien, J. A., Lummis, S. C. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).
  20. Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun. Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).
  21. Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).
  22. Han, X., et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 287, 99-104 (2011).
  23. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  24. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).
  25. Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection. Brain Research. 1385, 68-76 (2011).
  26. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PloS One. 7, 45017(2012).
  27. Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate. Journal of Drug Delivery. 2011, 647631(2011).
  28. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Appl Phys Lett. 87, 014103(2005).
  29. Meijering, E. Neuron tracing in perspective. Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).
  30. Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices. Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).
  31. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  32. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  33. Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice. Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).
  34. Arsenault, J., et al. Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells. Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).
  35. Arsenault, J., et al. Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells. Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة