مقالة منهجية

استنساخ فرعي زائد الإدراج (SPI) - رواية الطريقة Recombineering عن البناء السريع للجين استهداف ناقلات

DOI:

10.3791/52155

⸱

يناير 8, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Leicester, 2Center for Fisheries, Environment and Aquaculture Sciences, 3ES Cell Facility, Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يمكن استخدام منهجيات استهداف الجينات

لتوليد الفئران المعدلة وراثيا مع الأليلات بالضربة القاضية والضربة القاضية والموسومة. هنا ، نصف طريقة محسنة لإعادة التركيب في بكتريا قولونية ، والتي نسميها "الاستنساخ الفرعي بالإضافة إلى الإدخال" ، والتي يمكن استخدامها لإنشاء نواقل مخصصة لاستهداف الجينات بسرعة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يشير استهداف

إلى التعديل الدقيق للموضع الجيني باستخدام إعادة التركيب المتماثل. يتطلب إنشاء خطوط خلايا جديدة ونماذج فئران معدلة وراثيا باستخدام هذه الطريقة بناء ناقل "استهداف" ، والذي يحتوي على تسلسلات DNA متجانسة للجين المستهدف ، وكان لسنوات عديدة خطوة مقيدة في هذه العملية. يمكن إجراء بناء النواقل في الجسم الحي في خلايا الإشريكية القولونية باستخدام إعادة التركيب المتماثل بوساطة إعادة تركيب العاثيات باستخدام تقنية تسمى إعادة التلفك. إعادة التركيب هي التقنية المفضلة لاستنساخ تسلسلات التماثل الطويلة (>4 كيلو بايت) وعناصر الاستهداف المختلفة بما في ذلك علامات الاختيار المطلوبة للتوسط في التبادل الأليلي الفعال بين ناقل الاستهداف وموضعه الجيني المشابه. تتبع بروتوكولات إعادة التركيب النموذجية مخططا تكراريا للتكامل التدريجي لعناصر الاستهداف وتتطلب خطوات تنقية وتحويل وسيطة. هنا ، نقدم منهجية جديدة لإعادة التركيب لتجميع المتجهات باستخدام نهج تعدد الإرسال. يتم إصلاح فجوة البلازميد عن طريق التقاط التسلسل الجيني المتزامن من مكتبات الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية للفأر وإدخال علامات اختيار البكتيرية والثدييات المزدوجة. طريقة الاستنساخ الفرعي بالإضافة إلى الإدراج هذه عالية الكفاءة وتنتج غالبية المؤتلفات الصحيحة. نقدم بيانات لبناء أنواع مختلفة من النواقل الجينات الشرطية ، أو ضربة قاضية ، ونواقل مراسل BAC التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطريقة. يوسع بناء متجه SPI بشكل كبير ذخيرة صندوق أدوات إعادة التركيب ويوفر طريقة بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لبناء هذه المتجهات المعقدة للغاية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد مكن تطوير تقنيات استهداف الجين بناء خطوط الخلايا ونماذج الماوس للتحقيق في الأنظمة البيولوجية المختلفة 1-3. والمرحلة الأولى الأساسية في تعديل تسلسل الجيني هو تصميم وبناء الجينات التي تستهدف ناقلات 4. النواقل التي تستهدف هي يبني البلازميد التي تحمل أليل من الفائدة التي تحتوي على التعديلات المرغوبة (ق) يحيط بها علامة الاختيار (على سبيل المثال، النيومايسين)، والمناطق الجينومية الطويلة اللازمة لكفاءة إعادة التركيب مثلي في خلايا الثدييات 5. ويتحقق الدقيق تعديل الجينات من خلال إدخال متجه إلى استهداف الجذعية الجنينية (ES) خلايا 6 أو 7 الخلايا الجسدية، حيث إعادة التركيب مثلي بين مساحات مماثلة من تسلسل الحمض النووي على ناقلات الاستهداف والنتائج موضع الجينومية في نقل تعديل المقصود إلى الجينوم عن طريق تحويل الجينات 8. هذا modifiخلايا ES إد يمكن حقنها في الكيسات الأريمية الماوس لإنتاج نسل (chimaeras) التي يمكن بعد ذلك نقل هذه الأليلات المعدلة عبر الجرثومية 9. طرق بديلة لإنتاج الفئران المعدلة وراثيا ينطوي على Microinjection من متجه التعبير الجيني في واحدة بيضات ملقحة الماوس الخلية، مما يؤدي إلى التكامل عشوائية من متجه في جينوم الفأر 10. وقد اعتمدت الطرق التقليدية في البناء على ناقلات التقليدية "قص ولصق" الاستنساخ باستخدام أنزيمات التقييد وligases DNA لاستنساخ علامة الاختيار مختلفة وشظايا الجينومية في العمود الفقري النواقل. ومع ذلك، عاملا يحد المتأصل في الاستنساخ التقليدي هو تحديد المواقع واختيار مواقع التقييد، وخاصة مع تسلسل الحمض النووي أطول. وغالبا ما يتطلب خطوات استنساخ فرعي متعددة وأيضا يدخل تسلسل الحمض النووي غريبة في ناقلات، الذي غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كفاءة من استهداف الجينات.

Recombineering (ENG recombinogenicineering) هو تقنية الهندسة DNA أن يتغلب على هذه القيود باستخدام إعادة التركيب مثلي (HR) بوساطة البروتينات فج إعادة التركيب في E. خلايا القولونية 11،12. منذ أن أي منطقة من تسلسل مثلي بمثابة ركيزة من recombineering، تتم إزالة القيود من توافر مواقع قيود. تسلسل الحمض النووي كبيرة يمكن تعديلها بسهولة مباشرة في الجسم الحي، وبالتالي الحفاظ على السلامة الهيكلية أيضا على 13. Recombineering فعال جدا مع homologies قصيرة (50 نقطة) ويمكن إدراج 14 وبالتالي الأسلحة التماثل (HA) مريح في تسلسل بنسبة ضئيلة الاصطناعية. في تجربة نموذجية recombineering، وبنسبة ضئيلة أو مزدوج DNA الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA) جزء يحتوي على HA هو electroporated إلى recombineering المختصة E. خلايا القولونية التي تحتوي على الهدف تقع إما على كروموسوم أو على البلازميد 15. تمنح إمكانيات إعادة التركيب من قبل التعبير محرض للتفصيل الأحمرombination البروتينات من فج 16،17 أو البروتينات RecET من طليعة العاثية RAC 18. ونوكلياز خارجية الأحمر / RECE تحويل dsDNA الخطية إلى DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) وسيطة، والتي يتم بعد ذلك ملزمة شريكتها الأحمر / مصحح، وهو بروتين الصلب واحد الذين تقطعت بهم السبل (SSAP) 19. والصلب من ssDNA طويلة أو قصيرة بنسبة ضئيلة لسلسلتها الهدف مكملة يحدث على حبلا متخلفة من شوكة تكرار ويؤدي إلى إدراج تسلسل في الموقع المستهدف. متخلفة حبلا ssDNA إعادة التركيب هو أساس كفاءة عالية من recombineering ويمكن وصفها من قبل 'بيتا' نموذج إعادة التركيب 20،21.

وسير العمل recombineering نموذجي لبناء ناقلات استهداف الجين ينطوي على أي من طريقين التالية. واحد الطريق ينطوي على استنساخ فرعي المنطقة الجينومية المرجوة من استنساخ فأر BAC إلى البلازميد يليه الإدراج متتابعة من المواقع إعادة التركيب LoxP، علامة الاختيار 22 الخ، أو الطريق البديل ينطوي على استهداف BAC موضع الجيني مع مختلف عناصر مكافحة ناقلات استهداف من قبل جولات متعددة من recombineering 10،23 ثم استنساخ فرعي موضع المعدلة في البلازميد بواسطة إصلاح الفجوة استنساخ 24،25. وقد استخدمت الاختلافات حول هذا الموضوع في مختلف خطوط أنابيب عالية الإنتاجية recombineering كجزء من برامج إنتاج الماوس كبير 26،27. ومع ذلك، تنطوي هذه الإجراءات مراحل معقدة وطويلة، تتطلب استخدام ناقلات المتخصصة وE. القولونية سلالات (على سبيل المثال، لجنة المساواة العرقية معربا عن الخلايا) والاستفادة من واحد أو أكثر من الخطوات الوسيطة من متجه تنقية الحمض النووي وإعادة التحول (الجدول 1). استنساخ فرعي الإدراج زائد (SPI) هو أسلوب recombineering الرواية التي تجمع بين إعادة التركيب بيتا وإصلاح الفجوة الاستنساخ في عملية واحدة (الشكل 1). SPI التجمع ناقلات بسيط، سريع ومرن ويوفر تحسنا كبيرا على recombi القياسيةنهج neering (الجدول 1). هنا، علينا أن نظهر سهولة وجدوى استخدام SPI لمختلف التطبيقات بناء ناقلات مع التركيز بشكل خاص على بناء تصاميم غير القياسية وتحدي النواقل. وتشمل حالات الاختبار بناء الفلورسنت مراسل knockin ناقلات، مزدوج الموسومة التعبير البروتين ناقلات knockin، وهو BAC الفلورسنت مراسل النواقل وبالضربة القاضية ناقلات مشروط. هذه دراسة بأشكال مختلفة شرط لحصر مستقبلات سطح الخلية، تنقية مجمع البروتين النووي أو يجتذ مشروط التعبير عن الجين.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. استهداف الجينات التصميم

  1. تأمر استنساخ BAC المناسب تغطي المنطقة الجينومية من الفائدة. تأكد من أن هذا هو إسوي إلى نوع من خلايا ES إلى تعديل على سبيل المثال، استنساخ RPCI-23 وRPCI 24 BAC لاستهداف الجينات مع C57BL / 6 ES الخلايا.
  2. تطبيق الجين التقليدي معايير الاستهداف عند تصميم ناقلات الاستهداف. وتشمل المعايير الأساسية ما إذا كان يلزم التعديل لتكون التأسيسي أو مشروطة، وتحديد الإكسونات الحرجة (CE) للحذف في استراتيجية خروج المغلوب الجينات والمباعدة بين الولادات ووضع أشرطة intronic.
    ملاحظة: تم مناقشة كل من هذه بالتفصيل في مكان آخر (10).
  3. اختيار المناطق الجينومية كل من 5-6 كيلو بايت المرافقة الموقع التعديل الهدف.
    ملاحظة: لذلك فإن حجم إدراج subcloned هو عادة 10-12 كيلو بايت، على الرغم من أن الحد الأعلى يمكن أن تصل إلى 80 كيلو بايت مع نسخة منخفضة استنساخ فرعي بلازميد مثل p15A، pBR322 وغيرها، ويصل إلى 200 كيلو بايت مع BACالنواقل.

2. ملتيبليكس Recombineering Oligos

  1. oligos تصميم العمود الفقري البلازميد (استنساخ فرعي بلازميد) وعلامة اختيار (الإدراج كاسيت). تصميم كل جزئية بحيث أنه يحتوي على 180 سنة مضت HA المرافقة الموقع المستهدف الجيني و 20 نقطة أساس تسلسل محدد من فتيلة الكاسيت الإدراج أو البلازميد استنساخ فرعي (الشكل 2).
    ملاحظة: يجب أن لا تحتوي على أسلحة التماثل أي العناصر المتكررة، وجود عناصر المتكررة تؤدي إلى استهداف غير صحيح واستنساخ فرعي. ويمكن الكشف عن العناصر المتكررة باستخدام أدوات على شبكة الإنترنت مثل 'كرر المقنع' '.
  2. تشمل فريدة من نوعها انزيم التقييد (RE) الموقع على واحدة من oligos متجه إلى خطي الجين استهداف ناقلات لخلية ES تستهدف (الشكل 2).
  3. تحقق المعلمات بنسبة ضئيلة باستخدام برنامج محلل بنسبة ضئيلة. الحرص على تجنب هياكل الثانوية في المنطقة فتيلةالصورة.
  4. أقصر HA (50 نقطة) من كاسيت الإدراج والتسامح وينتج انخفاض عدد recombinants ولكن تأكد من أن البلازميد استنساخ فرعي HA دائما أطول (180 بي بي).
  5. تحديد اتجاه إدراج الحمض النووي الجيني لاستنساخ BAC معين باستخدام أدوات على شبكة الإنترنت مثل '' cloneDB ''. إنشاء اتجاه النسخ المتماثل من الفم عن طريق فحص خريطة البلازميد العمود الفقري BAC المستخدمة في بناء مكتبة BAC.
    ملاحظة: الفم هو عادة عكس الاتجاه النسخي من الكلورامفينيكول (كلوروفيل) علامة لجميع البلازميدات BAC شائعة الاستخدام.
  6. إضافة اثنين من محطة phosphorothioate (PTO) سندات ل5 'نهاية بنسبة ضئيلة هذا هو معاكس لاتجاه النسخ المتماثل على استنساخ BAC. إضافة تعديل 5 "الفوسفات إلى بنسبة ضئيلة العكسية (الشكل 2).
    ملاحظة: غير المتماثلة phosphorothioated PCR كاسيت على الهضم الأحمر يولد على ssDNA المتوسطة التي يمكن أن رئيس حبلا متخلفةمن شوكة النسخ المتماثل.
    ويلاحظ القصوى تردد إعادة التركيب متعدد الإرسال مع حبلا متخلفة أشرطة المحمية: ملاحظة. الرائدة حبلا حماية أو أشرطة حماية مزدوجة قد لا ينتج كفاءات إعادة التركيب تعادل في بعض مواضع.
  7. تأمر oligos مع PAGE أو تنقية HPLC.

3. BAC استنساخ التحول مع pSC101 BADgbaA Recombineering البلازميد.

  1. لجعل E. القولونية سلالة تحمل recombineering BAC يتقن، وتحويل ذلك مع البلازميد pSC101 BADgbaA التي تحتوي على الجينات الأحمر 16.
    ملاحظة: البلازميد pSC101 BADgbaA يحتوي على الأحمر وRECA الجينات تحت سيطرة محرض أراك-P المروج BAD أرابينوز، علامة اختيار التتراسيكلين ودرجة الحرارة حساسة pSC101 ريبليكون.
    1. طعن طرف ماصة معقمة في الثقافة BAC أجار وتطعيم 5.0 مل من استذابة مرق (LB) ودرجة الحموضة 8.0 تحتوي على 12.556؛ ز مل -1 كلوروفيل. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعة تهتز في 200 دورة في الدقيقة.
    2. هدئ 10٪ (V / V) حل الجلسرين، أنابيب microcentrifuge وcuvettes Electroporation للعلى الجليد. تبريد جهاز للطرد المركزي المبردة كبير وميكروسنتريفوج إلى 4 ° C.
    3. تحديد الكثافة الضوئية (OD) من ثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي وقياس الامتصاصية في 600 نانومتر. إعداد خلايا electrocompetent (كما هو موضح أدناه) عندما يتم التوصل الى OD 600 قراءة 0،3-0،8.
    4. تدور باستمرار خلايا في أنبوب 50 مل الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي كبير في 1،216 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    5. غسل الخلايا مع 1 مل من المبرد 10٪ الجلسرين وتدور باستمرار خلايا في 17949 x ج لمدة 20 ثانية في 4 درجات مئوية. إجراء غسل خطوة ما مجموعه 3 مرات.
    6. Resuspend الخلايا في الحجم الكلي لل50 ميكرولتر من 10٪ الجلسرين وإضافة 10-200 نانوغرام من recombineering بلازميد pSC101 BADgbaA. الحصول على تعليق خلية واحدة من قبل pipettingصعودا وهبوطا عدة مرات ومن ثم نقل الخلايا إلى ما قبل المبردة 1 ملم الفجوة كفيت electroporation.
    7. Electroporate الخلايا مع إعداد 1.8 ك.ف، 25 μF و 200 Ω.
      ملاحظة: التحقق من الإعدادات الصحيحة لكل نوع من electroporator. ثابت وقت Electroporation للأقل من 4 يدل على وجود الملح وغيرها من الشوائب.
    8. على الفور استعادة الخلايا في 1 مل من LB ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    9. تنمو ثقافة BAC gbaA في 30 درجة مئوية لمدة 2 ساعة تهتز في 200 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: يتم فقدان البلازميد pSC101 BADgbaA عندما تزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية بسبب تثبيط درجة الحرارة حساسة عامل النسخ RepE. زراعة خلايا gbaA في 30 ° C للحفاظ على وظائف recombineering.
    10. إضافة 9 مل من LB تحتوي على 12.5 ميكروغرام مل -1 كلوروفيل و 4 ميكروغرام مل -1 التتراسيكلين (تيت) لثقافة BAC gbaA استردادها. زراعةBAC gbaA ثقافة O / N في 30   ° C اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: كفاءة تحويل electroporating في gbaA بلازميد supercoiled عالية بما فيه الكفاية للسماح النمو تشبع O / N في وسائل الإعلام السائلة.

4. إعداد الإدراج كاسيتات واستنساخ فرعي البلازميدات

  1. لدمج HA في كاسيت (s) الإدراج والبلازميد استنساخ فرعي، نفذ تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام oligos تعديل فترة طويلة كما هو موضح أدناه.
    1. اختياري: لمنع بلازميد المرحل إلى رد فعل recombineering، استخدم أصل R6K أو قالب ضيق نطاق المضيف بلازميد مماثل لتضخيم كاسيت الإدراج.
    2. بدلا من ذلك، يصبح خطي القالب البلازميد باستخدام RE هضم (الجدول 2). اختيار RE الذي يمر خارج المنطقة التضخيم PCR وهي الحرارة المعطل. الحرارة إبطال نشاط RE على النحو الموصى به من قبل مصنعونacturer.
    3. اقامة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام نظام البلمرة DNA hotstart عالية الدقة. إعداد مزيج الرئيسي PCR كما هو مفصل (الجدول 3). أداء الدراجات الحرارية كما هو مبين (الجدول 3).
  2. تحليل PCR المنتجات التي الاغاروز الكهربائي للهلام. تحميل 1-5 ميكرولتر من كل PCR على 1٪ (ث / ت) agarose هلام يحتوي على 0.5 ملغ مل -1 إيثيديوم بروميد (EtBR).
    ملاحظة: لا تتدخل وجود منتجات التضخيم غير محددة في رد فعل recombineering. لكن في بعض الحالات، قد dimers التمهيدي-يقلل كفاءة recombineering.
  3. تنقية المنتجات PCR باستخدام طقم تنقية PCR.
    1. اختياري: إزالة القالب البلازميد من تقارير إنجاز المشروعات عن طريق العلاج مع DpnI تليها PCR التنظيف. DNA أزل في حجم الحد الأدنى من الماء منزوع الأيونات معقمة (على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة).
      ملاحظة: إضافة DpnI لغير منقى PCR ردود الفعل النتائج إلى انخفاض كفاءة الانقسام من الالبريد قالب DNA البلازميد ميثليته.
  4. تحديد PCR تضخيم الحمض النووي عن طريق التحليل agarose هلام ضد مجموعة معروفة من المعايير DNA على سبيل المثال، λ HindIII هضم أو باستخدام معمل NanoDrop.

5. استنساخ فرعي زائد الإدراج

  1. تمييع O / N BAC gbaA الثقافة 50 أضعاف وذلك بإضافة 200 ميكرولتر في 10 مل LB + كلوروفيل + تيت. ينمو بمعدل 30   ° C اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة 50 دقيقة. تشمل عينة لاستخدامها السيطرة السلبية.
  2. هدئ جميع المواد والمعدات recombineering إلى 4 ° C كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.
  3. صب LB أجار درجة الحموضة 8 لوحات تحتوي على تركيز الصحيح من المضادات الحيوية المناسبة انتقائية (ق) من شأنها أن تسمح اختيار جزء DNA التي يتم إدراجها وكذلك لاختيار من استنساخ فرعي ناقلات (الجدول 4).
    ملاحظة: بعض المضادات الحيوية هي درجة الحموضة الحساسة. استخدام LBأجار درجة الحموضة 8 كقاعدة.
  4. إعداد 10٪ (ث / ت) حل من L-أرابينوز. تصفية تعقيم من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون.
    ملاحظة: أرابينوز الحث على التعبير من البروتينات recombineering من البلازميد gbaA.
  5. تحقق من OD من الثقافة BAC gbaA باستخدام مقياس الطيف الضوئي. مرة واحدة في OD يتم التوصل إلى 600 من ،25-،3، لحث البروتينات recombineering كما هو موضح في الخطوة التالية.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من الحل أرابينوز 10٪ إلى 10 مل من ثقافة BAC لتحقيق تركيز النهائي من أرابينوز 0.2٪. تشمل ثقافة uninduced (بدون أرابينوز) لاستخدامها السيطرة السلبية.
  7. نقل ثقافة BAC إلى 37   ° C تهز الحاضنة ولحث على التعبير الأحمر لمدة 45 دقيقة تهتز في 230 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: التعبير عن البروتينات الحمراء غير فعال عند 30 درجة مئوية.
  8. تدور باستمرار الخلايا وتغسل مع 10٪ الجلسرين 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 3.1.5.
  9. إضافة 600-1،000 نانوغرام لكل من البلازميد استنساخ فرعي والكاسيت الإدراج (ق) إلى رد فعل recombineering. تشمل ناقل فقط وناقلات بالإضافة إلى الضوابط إدراج واحدة للتحقق من كفاءة إعادة التركيب وسلامة ناقلات وأشرطة.
  10. الحصول على تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. أداء Electroporation للكما هو موضح في الخطوة 3.1.7 والانتعاش اللاحق في 1 مل LB عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لالبلازميدات متعددة النسخ أو 10 مل من LB عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات لناقلات BAC.
  11. لوحة التخفيفات مختلفة من عافيته الثقافة على سبيل المثال، 90٪، 10٪، 1٪ على لوحات مختارة أجار المزدوجة وينمو بمعدل 37   ° C لمدة 16 ساعة.

6. تحليل Recombinants

  1. اختياري: اختر من 6 إلى 12 المستعمرات وتنفيذ مستعمرة PCR باستخدام المرافقة التمهيدي HA والتمهيدي محددة ملحقة. تشمل البلازميد استنساخ فرعي والاكاديمية الإدراجالعقار مؤخرا بلازميد فضلا عن استنساخ BAC الأم والضوابط السلبية.
    1. لتحليل agarose هلام من تقارير إتمام المشروعات مستعمرة. تحديد الحيوانات المستنسخة إيجابية من خلال وجود الفرقة مشرق في الحجم المتوقع.
      ملاحظة: الكفاءة العالية لعملية الاستنساخ SPI يولد recombinants الصحيحة في أغلبها.
  2. اختيار المستعمرات في 5 مل LB درجة الحموضة التي تحتوي على 8 انتقائية المضادات الحيوية والنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
  3. إعداد minipreps DNA باستخدام طقم تنقية العمود وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. إعداد BAC miniprep DNA باستخدام معيار العزلة الفينول كلوروفورم أو بروتوكول مماثل.
  5. أداء هضم RE على DNA miniprep. DNA منفصل الاغاروز الكهربائي للهلام. تحليل أنماط RE التعرف على الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على شظايا الأحجام المتوقعة لاستهداف ناقلات الصحيح. اختيار RE التي تميز بوضوح بين ناقلات تفتقر إلى إدراج (ق) ومتجه تحتوي على إدراج (ق).
  6. n الخيارنال: للحصول على الخلايا التي تخلو من BAC، التي لا تزال موجودة في E. القولونية بعد recombineering، استخدم DNA البلازميد miniprep لتحويل DH5alpha أو DH10B E. خلايا القولونية.
  7. أداء تسلسل الحمض النووي عبر HA والإدراج كاسيت للتحقق أخطاء التوليف بنسبة ضئيلة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المتجهات Knockin

تعكس النواقل التي تستهدف Knockin الحاجة إلى إدخال ميزة تسلسل جديدة في الجينوم بما في ذلك واحد استبدال زوج قاعدة في منطقة ترميز البروتين، والانصهار من علامة فلوري أو علامة تقارب على بروتين أو إدماج كاسيت التعبير الجيني. لاختبار تطبيق SPI في استراتيجيات بناء ناقلات knockin، تم فحص حالتين اختبار مختلفة. Dnttip1 بترميز deoxynucleotidyltransferase، محطة، والتفاعل البروتين 1A (TDIF1) الذي جنبا إلى جنب مع الصف الأول deacetylase هيستون (HDAC) تشكيل مجمع deacetylase الإنقسامية (MiDAC) 28. للتحقيق في دور Dnttip1 في انقسام الخلايا، واتخذ نهجا وضع علامات جنبا إلى جنب تقارب لعزل TDIF1 التفاعل البروتينات. وأسفرت محاولات سابقة لsubclone جزء من الجين Dnttip1 باستخدام ناقلات p15A تحتوي على مناطق تناظر طويلة في الفجوة انخفاض كفاءة إصلاح لالثانية متكررة منتجات إعادة التركيب الشاذة (لا تظهر البيانات). وهكذا، قدم بناء ناقلات knockin في موضع Dnttip1 ممارسة recombineering الصعبة. وقد تم تصميم استراتيجية SPI لsubclone قسم 12 كيلوبايت من الجين Dnttip1 تغطي اكسون الماضي (اكسون 13) في نسخة منخفضة p15A النواقل وإدراج في وقت واحد مزدوج بطاقة تقارب اختيار الكاسيت إلى اكسون 13، ليحل محل رامزة توقف (الشكل 3A ). البروتين 2X FLAG-كالمودولين ملزمة (CBP) ربط FRT-PGK-em7-نيومايسين (الجدد) -BGhpA-FRT كاسيت (2.0 كيلوبايت) تم تضخيمها من RE خطي البلازميد باستخدام PTO مزدوج oligos المعدلة التي وردت 120 بي بي HA المرافقة Dnttip1 وقف كودون. تم انشاء وحدة p15A زيو Dnttip1 استنساخ فرعي ناقلات (1.7 كيلوبايت) التي تحتوي على 200 المناطق بي بي متماثلة إلى أقاصي تسلسل Dnttip1 أن subcloned. أعيد استنساخ فرعي لبلازميد Dnttip1 خطي وتضخيم PCR باستخدام 20 بي بي تعديل oligosالتي ولدت الشركة الرائدة في مجال حبلا ناقلات المحمية. المنتجات PCR تم DpnI المعالجة، وتنقيته و electroporated المشارك في recombineering المختصة Dnttip1 BAC E. خلايا القولونية وكذلك الخلايا السيطرة uninduced. تم مطلي ردود الفعل SPI على Zeocin (زيو) والكانامايسين (كانساس) التي تحتوي على لوحات أجار (الشكل 3B). أنتجت SPI للتعديل بشكل صحيح Dnttip1 knockin ناقلات الأمراض في جميع ال 12 recombinants تحليلها (الشكل 3C). تسلسل الحمض النووي التحقق من عدم وجود أي أخطاء الناجمة عن تركيب جزئية أو PCR التضخيم.

مثال آخر على SPI شمل الإدراج في إطار معزز الأصفر البروتين الفلوري (EYFP) مرتبطة اختيار الكاسيت في الجين P2rx1. الجين P2rx1 يشفر مستقبلات جانب G-البروتين الذي يعمل كقناة أيون ATP بوابات-29. الربط YFP مضان يسمح تتبع مستقبلات P2x1 على سطح الخلية في فاالمقايسات الفنية rious زارة. P2rx1 هو موضع آخر من الصعب أن قدمت مشاكل كبيرة مع منهجيات recombineering التقليدية (لا تظهر البيانات). باستخدام SPI، شريحة 12 كيلوبايت من الجين P2rx1 تشمل اكسون محطة (اكسون 12) تم subcloned في ناقلات p15A زيو وتعديلها مع الإدراج متضافرة من الكاسيت الجدد EYFP -LoxP يحيط استبدال رامزة توقف في اكسون 12 لبناء P2rx1-EYFP ناقلات knockin (الشكل 3D). في هذا المثال، متخلفة حبلا ناقلات p15A المحمية (1.7 كيلوبايت) يحتوي على 230 سنة مضت HA ويتضمن الكاسيت EYFP 50 نقطة HA وتركت أيضا معدلة. تم تجميعها الكاسيت EYFP الإدراج (2.7 كيلوبايت) من خلال الربط تداخل PCR من الجين EYFP، PCR تضخيمها من pEYFP-C1، والكاسيت LoxP- PGK-em7-النيو BGhpA-LoxP، PCR تضخيمها من pL452 (NCI، فريدريك) . أنتج رد فعل SPI مئات المستعمرات (لا تظهر البيانات). RE تحليل DNAأظهر minipreps المحضرة من 11 استنساخ احتوت على الأغلبية تجميعها بشكل صحيح P2rx1-EYFP ناقلات knockin (الشكل 3E). أظهر التحقق من صحة إضافي من تسلسل الحمض النووي الإدراج خالية من الأخطاء من الكاسيت EYFP. ومع ذلك، بعض من الحيوانات المستنسخة أظهرت لمحات من الفجوة لازال إصلاح والفجوة إصلاح البلازميدات الموسومة في نفس الخلية (الممرات 6-9). كما يرد بعض العينات بشكل غير صحيح الفجوة إصلاح (حارة 2) أو البلازميدات mistargeted (الممرات 4 و 5). فشل استنساخ فرعي المتزامنة واستهداف في بعض recombinants SPI يسلط الضوء على حدود كفاءة الاستنساخ SPI عند استخدام أشرطة كبيرة (> 3 كيلو بايت)، والتي تنشأ من القيود المفروضة على processivity الأحمر من شظايا الحمض النووي طويلة 30، أو في حالة استخدام HA القصير. في الواقع، وزيادة HA من الكاسيت EYFP إلى 200 نقطة أساس زيادة الكفاءة SPI واستهداف الصحيح للكاسيت (لا تظهر البيانات). استهداف الجينات مع P2rx1 - EYFP knockin ناقلات في JM8.N4خلايا فأر ES (C57BL / 6 سلالة) ولدت 6 استنساخ الإيجابية من أصل 96، والتي تحتوي على المستهدفة بشكل صحيح تسلسل P2rx1-EYFP (الشكل 3F).

BAC مراسل المتجهات

استنساخ BAC من الجينات المستهدفة غالبا ما يحتوي على جميع العناصر المطلوبة المنبع والمصب التنظيمية على سبيل المثال، والقدرة، UTRs الخ وكذلك المروج الذاتية لدفع التعبير الجيني في المستويات الطبيعية 31. ولهذا فإن ناقلات مراسل BAC هو الوسيلة المفضلة لألخص نمط التعبير الذاتية لجين 32. ومع ذلك، فإن حجم كبير من البلازميد BAC (تصل إلى 200 كيلو بايت) ويعرض المشاكل العملية كبيرة مع transfecting وBAC سليمة إلى خلايا 33. تقليص حجم إدراج الجيني من خلال BAC BAC تقليم 34،35، مع الإبقاء على العناصر التنظيمية اللازمة من الجين، وتمكن من الأسهل التعامل مع BAC والنتائج في transfecti أكثر كفاءةعلى. ينطوي الحالية تكنولوجيا الهندسة BAC جولات متعددة من recombineering لتحقيق هذا الهدف (35). للتدليل على فائدة SPI في BAC التشذيب، تم استخدام ناقلات pBeloBAC11 BAC إلى subclone 30 كيلوبايت التسلسل الجيني الكامل بما في ذلك الجين طول P2rx1 من 168 كيلو بايت P2rx1 BAC جنبا إلى جنب مع الإدراج في وقت واحد من الكاسيت EYFP في جين P2rx1 (الشكل 4A). وpBeloBAC11 ناقلات زيو العمود الفقري (6.5 كيلوبايت) التي تحتوي على 180 بي بي HA كان PCR تضخيم مع oligos المعدلة التي ولدت حبلا متخلفة ناقلات المحمية. نفس EYFP الجدد كاسيت (3 كيلو بايت)، وتستخدم في P2rx1 سابقة بناء ناقلات knockin، كان تضخيم PCR باستخدام حبلا متخلفة oligos محمية تحتوي على 180 بي بي HA واستهدفت اكسون P2rx1 12 استبدال رامزة توقف. وبعد Electroporation للالمشترك لكاسيت EYFP وpBeloBAC11 زيو متجه إلى P2rx1 BAC خلايا EXPRessing البروتينات recombineering gbaA، تم انتشال الثقافة في 10 مل LB درجة الحموضة 8 لمدة 3 ساعة على 37C لعزل البلازميدات BAC. تم اختيار recombinants الصرفة على زيو واساسه أجار لوحات ووحظت على تردد 2 × 10 -6. كشفت مستعمرة PCR تحليل التنميط الجيني BAC ناجحة وتقليم في 3 من أصل 6 الحيوانات المستنسخة التي تم تحليلها (الشكل 4B). بعيدة المدى PCR التضخيم عبر الموقع الإدراج EYFP أكد التأسيس كاسيت الصحيح في استنساخ الإيجابية الثلاثة (الشكل 4B). وكانت الحيوانات المستنسخة ثلاثة تفتقر إلى إدراج EYFP أيضا بشكل غير صحيح الفجوة إصلاح في نهاية 5 '، على الرغم من أن سبب mistargeting من الكاسيت EYFP في هذه الحيوانات المستنسخة قد تكون منفصلة إلى إغلاق الصحيح لل5 "نهاية BAC. تم تحليل ثلاثة استنساخ EYFP BAC الإيجابي مع مزيد من النبذ ​​RE وأظهر النمط المتوقع للقلص بشكل صحيح EYFP المؤتلف BAC (الشكل 4C </ قوي>). وكشف تحليل تسلسل غياب الأخطاء في كاسيت EYFP في 1 فقط استنساخ من 3 ايجابيات.

خروج المغلوب الشرطي (CKO) المتجهات

الاجتثاث الشرطي التعبير الجيني هو أداة مهمة للتحقيق في العمليات التنموية أو لدراسة النظم البيولوجية في نقطة زمنية معينة. استراتيجية خروج المغلوب الجينات مشروطة عادة ما ينطوي على وضع المواقع إعادة التركيب LoxP المحيطة اكسون الحرج (CE). حذف من CE على لجنة المساواة العرقية التعبير أو تفعيل تنتج انزياح الإطار ووقف كودون سابقة لأوانها، مما أدى إلى تدهور مرنا بسبب هراء تسوس بوساطة (NMD). بناء مشروط ناقلات استهداف الجين هو مهمة معقدة وينطوي على عدة خطوات من استنساخ فرعي، واستهداف والتحول 22. تقدم SPI طريقا مريحة لتبسيط هذه العملية. كحالة اختبار، تم بناء أليل مشروط من الجين Zrsr2باستخدام منهجية SPI (الشكل 5A). الجين Zrsr2 بترميز عامل الربط وتوجد نسخة واحدة على الصبغي X. وضع المشروط للحذف الجينات أهمية خاصة في هذه الحالة للسيطرة على إمكانية خلايا التكيف مع عدم وجود Zrsr2 خلال ES اختيار خلية في استراتيجية التأسيسية التي تستهدف حذف الجينات. تم تنفيذ SPI لsubclone جزء 10 كيلو بايت من الجين ZrSr2 مع الإدراج المتزامن لاثنين من أشرطة مختلفة اختيار LoxP يحيط. وFRT-PGK-em7 النيو-FRT-LoxP كاسيت (2 كيلوبايت) كان PCR تضخيمها من RE pL451 باستخدام متخلفة حبلا محمية oligos التي تحتوي على 180 بي بي HA استهداف ZrSr2 إنترون 2. كاسيت الثاني يحتوي على روكس-PGK-em7- هضمها Blasticidin (BSD) -Rox-LoxP (2 كيلوبايت) كان PCR تضخيمها من البلازميد R6K مع حبلا متخلفة oligos محمية تحتوي على 180 بي بي HA متطابقة إلى منطقة المصب في إنترون 3. مواقع LoxP اثنين يحيط اكسون 3، CE الذين دeletion على الشرطية النتائج تفعيل لجنة المساواة العرقية في انزياح الإطار ويدخل وقف كودون سابقة لأوانها. واستنساخ فرعي بلازميد Zrsr2 (1.6 كيلوبايت) كان PCR تضخيمها من RE linearised p15A زيو البلازميد باستخدام متخلفة oligos حبلا محمية تحتوي على 180 بي بي HA مطابقة نهايات تسلسل Zrsr2 10 كيلوبايت. وأجريت ردود الفعل SPI كما هو موضح من قبل ومطلية على لوحات زيو + الجدد + بي إس دي. تم تجميع ZrSr2 استهداف ناقلات مشروط بنجاح في أكثر من 12 recombinants فحص (الشكل 5B). وأظهر مزيد من التحليل تسلسل الحمض النووي الإدراج الصحيح من كل من علامات التحديد في ناقلات ZrSr2 CKO.

figure-results-1
الشكل (1). SPI الاستنساخ لمحة عامة عن عملية الاستنساخ SPI الجمع بين الإدراج الكاسيت واستنساخ فرعي في خطوة واحدة. (A) واستنساخ BAC هو ترانsformed مع البلازميد pSC101 BADgbaA ونمت في 30C. (B) بعد تحريض أرابينوز للتعبير عن البروتينات الحمراء، وعرض غير المتماثلة تعديل كاسيت الإدراج وبلازميد استنساخ فرعي في استنساخ BAC واختيار مع كل من الإدراج واستنساخ فرعي علامات لتوليد ناقلات النهائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. تخطيطي يوضح تصميم SPI oligos recombineering. على حد سواء ولدت البلازميد استنساخ فرعي والإدراج الكاسيت التي كتبها PCR باستخدام مزيج من PTO محطة والفوسفات oligos تعديل. جزء PCR على الهضم الأحمر في الجسم الحي، ينتج ssDNA وسيطة، التي anneals إلى حبلا متخلفة من شوكة النسخ المتماثل. الجنرالأدرج ه HA محدد من 50-180 نقطة أساس في كل جزئية كما هو مبين. السهم يشير إلى اتجاه تكرار الحمض النووي عبر الجينات مرشح. خط متقطع يمثل استنساخ فرعي تسلسل بلازميد لم تدرج في المنتج PCR. الموقع RE، الموقع انزيم تقييد الخطية من ناقلات النهائي؛ F، تسلسل إلى الأمام (20 بي بي) محددة لالبلازميد استنساخ فرعي أو الإدراج الكاسيت. R، تسلسل تكملة العكسي (20 بي بي) من البلازميد أو الكاسيت. SM، واختيار علامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. SPI يتيح بناء ناقلات knockin الصعبة. (A) تخطيطي لاستراتيجية SPI المستخدمة في بناء Dnttip1 المزدوج الموسومة النواقل. السهم ومؤشراتكيتس اتجاه النسخ المتماثل على استنساخ BAC. النتائج (B) الطلاء من العينات uninduced والتي يسببها التجربة Dnttip1 SPI. (C) EcoRI هضم من الحيوانات المستنسخة Dnttip1 SPI. M، 1 كيلو بايت سلم (NEB)؛ C، الفجوة p15A Dnttip1 أصلحت بلازميد تفتقر العلامة المزدوجة كاسيت. أحجام جزء هي: الموسومة، 9.2 + 4.4 + 2.2 كيلوبايت، السيطرة؛ 9.2 + 4.6 كيلوبايت. (D) SPI مقرها P2rx1-EYFP knockin بناء ناقلات. (E) EcoRI هضم من الحيوانات المستنسخة P2rx1-EYFP SPI. M، 1 كيلو بايت + سلم (إينفيتروجن)؛ C، الفجوة p15A P2rx1 أصلحت بلازميد تفتقر إلى الكاسيت EYFP. أحجام جزء هي: الموسومة، 8.3 + 4.4 + 3.1 + 0.03 كيلو بايت. السيطرة؛ 8.3 + 3.1 + 1.8 + 0.03 كيلو بايت (F) تحليل لطخة الجنوبي من P2rx1 - الجينات EYFP تستهدف في الخلايا خلية JM8.N4 ES. أعلى لوحة، واللطخة الجنوبية مع التحقيق نهاية 3 'باستخدام PshAI هضم. أظهرت هو الفرز نتيجة من 5 الحيوانات المستنسخة. اللوحة السفلية، وصمة عار الجنوبية باستخدامو"التحقيق النهائي وSpeI هضم من ايجابيات التي تم تحديدها من 3 '5 نهاية الفرز. الموقع PshAI RE. S، الموقع SpeI RE. خط متقطع يمثل نهاية HA النواقل. الصندوق الأسود يدل على التحقيق الجنوبي. شظايا تقييد المتوقعة، PshAI: WT، 8.9 كيلوبايت، EYFP الجدد، 11.5 كيلو بايت. SpeI: WT، 6.9 كيلوبايت، EYFP الجدد، 7.6 كيلوبايت الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل (4). BAC المبسطة التشذيب باستخدام SPI. (A) تخطيطي يوضح مفهوم BAC التشذيب باستخدام SPI. يوصف مفتاح الرموز في الشكل (1). (ب) PCR التضخيم عبر 5 'و 3' ينتهي من إدراج subcloned وعبر مغرز P2rx1-EYFPن الموقع. يظهر فحص استراتيجية لكل نوع من أنواع PCR. M (اللوحة العلوية)، Hyperladder 25 نقطة، (لوحات أسفل)، 1KB +. P، P2rx1 BAC. . S، pBeloBAC11 زيو استنساخ فرعي بلازميد (C) HindIII هضم من ثلاثة EYFP إيجابية استنساخ SPI BAC من (B)؛ E، يتوقع نمط تقييد HindIII من EYFP BAC قلصت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5. الشرطي الجيل ناقلات بالضربة القاضية باستخدام SPI الاستنساخ. (A) تخطيطي لالإدراج المتزامن لاثنين LoxP يحيط مختلفة أشرطة الاختيار خلال استنساخ فرعي من أليل Zrsr2. يوصف مفتاح الرموز في الشكل 1. (B) </ هضم قوي> EcoRI من الحيوانات المستنسخة Zrsr2 SPI. L، 1 كيلو بايت سلم (NEB)؛ C1، p15A ZrSr2 الفجوة إصلاح البلازميد، C2، الفجوة p15A ZrSr2 أصلحت البلازميد التي تحتوي على إدراج الجدد. C3، الفجوة p15A ZrSr2 أصلحت البلازميد التي تحتوي على إدراج BSD. أحجام جزء هي: CKO، 7.7 + 2.9 + 2.6 + 1.6 كيلوبايت، C1، 7.7 + 4.0 كيلوبايت، C2، 7.7 + 4.3 + 1.6 كيلوبايت، C3، 7.7 + 2.9 + 2.3 كيلو بايت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

برنامج خروج المغلوب الماوس (KOMP) خط أنابيب البناء ناقلات إنتاجية عالية. متوسط ​​الوقت من 3 أسابيع إلى التحقق من استنساخ 26.
لا من الخطوات recombineering التقليدية خط أنابيب متعددة recombineering ب
الخطوة 1 تحويل recombineering البلازميد إلى المضيف BAC تحويل recombineering البلازميد إلى المضيف BAC. إعداد استهداف أشرطة واستنساخ فرعي ناقلات.
خطوة2 ادراج R1 / R2 بوابة كاسيت الفجوة متعددة إصلاح الاستنساخ
الخطوة 3 ادراج floxed اساسه كاسيت O / N الثقافة من المستعمرات واحد
الخطوة 4 إصلاح ثغرة في R3 / R4 بلازميد إعداد البلازميد والتحقق
الخطوة 5 التحول إلى لجنة المساواة العرقية + E. القولونية
خطوة 6 إعداد البلازميد والتحقق
خطوة 7 O / N الثلاثية رد فعل بوابة
الخطوة 8 التحول من ثلاثي بوابة التفاعل إلى DH10B E. خلايا القولونية
الخطوة 9 الثقافة بين عشية وضحاها من المستعمرات واحد
الخطوة 10 إعداد البلازميد والتحقق تسلسل
(ب) متوسط ​​الوقت من 4 أيام إلى استنساخ التحقق

الجدول 1: مقارنة recombineering التقليدية مع SPI في بناء ناقلات خروج المغلوب المشروطة.

عازلة RE 5 ميكرولتر
DNA 1 ميكروغرام البلازميد أو المنتجات PCR المنقى
RE 1 ميكرولتر (5 وحدات أو أكثر)
TE ما يصل إلى 50 ميكرولتر
احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. تسخين inacitvate وفقا لتعليمات الشركات المصنعة

الجدول 2: RE هضم.

المواد PCR التركيز النهائي
عازلة PCR 1X
dNTP 200 نانومتر
MgSO 4 1.5 ملم
البيتين 1.3 M
DMSO 1٪
التمهيدي إلى الأمام 200 نانومتر
التمهيدي العكسي 200 نانومتر
DNA بوليميريز 1 U
قالب 10 نانوغرام من البلازميدات multicopy أو 2.5 ميكرولتر من DNA miniprep لإتمام المشروعات التنميط الجيني
ماء ما يصل إلى 50 ميكرولتر من
وبالنسبة للمعيار 50 ميكرولتر PCR رد فعل مع البلازميدات multicopy. وضعت تقارير إنجاز المشروعات التنميط الجيني بعيدة المدى تصل في 25 ردود الفعل PCR ميكرولتر.
شروط PCR
95 ° C 2 دقيقة
92 ° C 10 ثانية
55 ° C 30 ثانية
72 ° C 30 ثانية
30 دورات ب
ب دورة لا يجوز تمديدها إلى 35 لBAC PCR التنميط الجيني

الجدول 3: PCR مجموعة المتابعة والأحكام.

المضادات الحيوية تركيز على (ميكروغرام مل -1)
Ampicllin 50
Blasticidin ب 40
الكلورامفينيكول 12.5
جنتاميسين 2
هيغروميسين ج سوب> 30
كانامايسين ب 15
التتراسيكلين 4
ميثوبريم ج 10
Zeocin 5
اقتراحات للاستخدام مع باكس والبلازميدات multicopy عند استخدامها في تركيبات في recombineering تعدد الإرسال
ب Blasticidin (35 ميكروغرام مل -1) والكانامايسين (6 ميكروغرام مل -1) عندما تستخدم معا في مزيج
لا ينصح ج هيغروميسين وميثوبريم لاختيار مع باكس نسخة واحدة.

الجدول 4. الموصى بها تركيزات المضادات الحيوية لاستخدامها في التجارب SPI.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بناء خطوط الخلايا ES ونماذج الماوس وشمل تاريخيا استهداف الجينات باستخدام يبني البلازميد التي تحتوي على أليل تعديل 4. ومع ذلك، فقد ثبت أن بناء هذه النواقل التي تستهدف الجينات المعقدة ليكون عنق الزجاجة كبير في إنتاج مثل هذه النماذج في الوقت المناسب. وقد سمح وضع استراتيجيات بناء ناقلات recombineering أساس تصاميم ناقلات تحسين والتجمع ناقلات أكثر كفاءة. ومع ذلك، بروتوكولات recombineering الحالية لا تزال تنطوي على خطوات متعددة، تتطلب تنقية البلازميد المتوسطة واستخدام سلالات بكتيرية مختلفة. استنساخ فرعي الإدراج زائد يقدم نهجا جديدا لبناء ناقلات التي يمكن القيام بها في حالة Electroporation للواحد في سلالة المضيف BAC المقيمين. تم اختبار فائدة SPI في استهداف الجين هنا في مجموعة متنوعة من التطبيقات بناء ناقلات الأمراض. في جميع الحالات درست هنا، وثبت SPI لتكون فعالة وتم إنتاج البلازميد المؤتلف الصحيح.في الغالبية العظمى من الحالات، تم إدراج أشرطة مختلفة متعددة بشكل صحيح في ناقلات الاستهداف. أشرطة DNA الكبيرة وناقلات تم استيعابها بسهولة في بروتوكول SPI وأظهرت مرونة هذا النظام.

يعتمد SPI على استخدام تسلسل تناظر طويلة وphosphorothioate (PTO) حماية أشرطة DNA الخطية. تعديل PTO يمنح حماية ضد exonucleases على الحمض النووي الخطي 20،21 وHA طويلة يزيد من كفاءة إعادة التركيب للسماح المتنوعة. ومع ذلك، والتوليف من تسلسل بنسبة ضئيلة أطول يزيد من فرص تراكم الأخطاء خصوصا الحذف. الطفرات في جزئية يمكن أن يكون ضارا ولا سيما إذا كانوا تغطية المناطق البروتين الترميز. ينصح بشدة تسلسل الحمض النووي عبر HA وتغطية طول كامل من الكاسيت إدراجها للقضاء على الحيوانات المستنسخة مع أي تعديلات التسلسل. ويقترح استخدام نظام البلمرة DNA عالية الدقة أيضا لتجنب إدخالأخطاء ذ PCR. طول وتكوين HA من البلازميد استنساخ فرعي هو أكثر أهمية بالنسبة لتلك التي الكاسيت الإدراج (لا تظهر البيانات). وبالنسبة للتطبيقات ذات حساسية خاصة مثل بناء ناقلات knockin، حيث لا يتم التسامح مع أي طفرات في المناطق اكسون، وHA من الكاسيت الإدراج يمكن اختصارها (50-120 بي بي) لتفادي المشاكل المرتبطة oligos طويلة. ويمكن أيضا الكاسيت الإدراج أن تترك phosphorothioated معدلة أو المزدوجة (حيث معرفة اتجاه تكرار غير متوفرة). ولكن مضاعفة في هذه الحالات لا يزال يتطلب محمية لفترة طويلة HA البلازميدات استنساخ فرعي. والتحذير من هذه الاستراتيجية معينة هو خفض كفاءة المتنوعة التي يمكن أن تؤثر SPI الاستنساخ في مواضع مختلفة.

طول كاسيت الإدراج والبلازميد هو استنساخ فرعي معلمة هامة أخرى في SPI الاستنساخ. جزيئات DNA أكبر electroporate أقل كفاءة وتأثير تراكمي، نظرا لإعادةquirement لتقديم كافة الأشرطة في نفس الخلية (لا تظهر البيانات). مضاعفة هو الأكثر كفاءة مع أشرطة الإدراج أصغر. DNA شظايا أكبر من 3 كيلوبايت أيضا وضع حد على معالجة ssDNA الأحمر بوساطة، والتي هي الأكثر كفاءة تصل إلى 3 كيلو بايت 30. أشرطة الإدراج تتجاوز 3 كيلو بايت هي مزدوجة مقطوعة وتمتزج أقل بكفاءة عن طريق بيتا مسار مستقل 20. لذلك، وفحص المستعمرات كافية لتحديد استنساخ الصحيح يصبح من المهم في هذه الحالات. مدة أطول من إعادة التركيب آخر Electroporation لليزيد أيضا من فرص الشفاء من استنساخ الصحيح في التدريبات SPI الصعبة. ما يصل إلى أربعة أشرطة صغيرة (<1.5 كيلوبايت) يمكن إدراجها في وقت واحد مع عملية SPI، على الرغم من كفاءة مضاعفة تتناقص مع كل كاسيت إضافية (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، وهذا يعكس نتائج تجربة SPI الأمثل ويستحسن النظر في حدود المتنوعة عند استخدام العديد من أشرطة كبيرة.

تطوير أدوات التحرير الجينوم مثل تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) نظام نوكلياز داخلية -cas9 وقد مكن إنشاء التعديلات الجينوم جديدة وأدى إلى زيادة كفاءة الهندسة الجينوم 36. ومع ذلك، فقد استكملت هذه التكنولوجيات الجديدة الجينات التي تستهدف ناقلات بدلا من حلت محل لهم. ومن المتوقع أن النظام كريسبر-CAS يمكن أن تحل محل اختيار المضادات الحيوية وزيادة صقل بروتوكول recombineering متعدد.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.R.R هو مخترع طلب براءة اختراع بريطاني حول تقنية إعادة الدمج المتعدد.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.R.R تصور المشروع وصمم وأجرى التجارب وأعد المخطوطة. أجرى E.J.K و S.E.M تجارب. ساهم جميع المؤلفين فكريا في المخطوطة النهائية. تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة الابتكار من جامعة ليستر في SEM ومن قبل زمالة أبحاث عليا من مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MRC) إلى S.M.C (MR/J009202/1). تم إجراء تسلسل الحمض النووي من قبل مختبرات البروتين والحمض النووي (PNACL) ، مركز خدمات التكنولوجيا الحيوية الأساسية ، جامعة ليستر. نود أن نشكر A. Francis Stewart على توفير بلازميدات Rox و Dre. تم الحصول على بلازميدات pL451 و pL452 من المعهد الوطني للسرطان (NCI) ، فريدريك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المضادات الحيوية باستثناء زيوسينسيجما: http://www.sigmaaldrich.comأمبيسلين ، A9518-5G ؛
كلورامفينيكول ، C1919-5G ؛ بلاستيسيدين ، 15205-25 ملغ ؛ الجنتاميسين ، G1264-50 ملغ ؛ هيغروميسين ، H3274-50 ملغ ؛ كاناميسين ،: K1876-1G ؛
هيدروكلوريد التتراسيكلين ، T7660-5G ؛ Trimethoprim, 92131-1G
ZeocinInvivogen: يتوفر ant-zn-1Zeocin أيضا من Life technologies / Fisher
C57BL / 6 BAC clonesCHORI: https://bacpac.chori.org/ مكتبات RPCI-23 أو RPCI-24 BAC129 / Sv BAC المستنسخة من Invivogen أو Life technologies /
نظام بوليميراز الحمض النووي Fisher KOD hotstartMillipore: https://www.merckmillipore.com71086-3
L-ArabinoseSigma: http://www.sigmaaldrich.comA3256-25G
Long oligosIDT: https://www.idtdna.com; رابط الجينات: https://www.genelink.comIDT Ultramers أو Gene Link طويل oligosPTO و Phosphosphate متاح كتعديلات مخصصة. يوصى بشدة بتنقية PAGE للقليغوس الطويلة.
طقم تنقية MinElute PCRQiagen: http://www.qiagen.com يفضل 28004الأدنى من مجموعات تنقية PCR للشطف.
QIAPrep Spin Mini Prep KitQiagen: http://www.qiagen.com 27104يفضل عمود السيليكا أو مجموعات المصفوفة المماثلة.
إنزيمات التقييدNEB: https://www.neb.comDpnI: R0176Lانظر موقع NEB للحصول على قائمة ب RE.
يمكن الحصول على الحد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).
  2. Harvey, M., et al. Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).
  3. Waterhouse, P., et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270, 985-988 (1995).
  4. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
  5. Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).
  6. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 317, 230-234 (1985).
  7. Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).
  8. Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. The double-strand-break repair model for recombination. Cell. 33, 25-35 (1983).
  9. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984).
  10. Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. Methods Enzymol. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).
  11. Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).
  12. Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  13. Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).
  14. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).
  15. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).
  16. Wang, J., et al. An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination. Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).
  17. Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. Gene. 379, 109-115 (2006).
  18. Fu, J., et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).
  19. Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).
  20. Maresca, M., et al. Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination. BMC Mol. Biol. 11, 54(2010).
  21. Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate. Genetics. 186, 791-799 (2010).
  22. Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res. 13, 476-484 (2003).
  23. Chan, W., et al. A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Res. 35, e64(2007).
  24. Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).
  25. Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73, 56-65 (2001).
  26. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
  27. Valenzuela, D. M., et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).
  28. Bantscheff, M., et al. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes. Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).
  29. Mulryan, K., et al. Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature. 403, 86-89 (2000).
  30. Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).
  31. Antoch, M. P., et al. Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89, 655-667 (1997).
  32. Rostovskaya, M., et al. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res. 40, e150(2012).
  33. Giraldo, P., Montoliu, L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).
  34. Hill, F., et al. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113 (2000).
  35. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).
  36. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BAC

مقالات ذات صلة