مقالة منهجية

الاشتقاق وتوصيف خالية من التحوير الإنسان المستحثة متعددة القدرات خط الخلايا الجذعية والتحويل إلى تعريف الحالات السريرية الصف

DOI:

10.3791/52158

⸱

نوفمبر 26, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles (UCLA), 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles (UCLA)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا لاشتقاق الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية القائمة على الفيروسات المعاد برمجتها ووصفها وتحويلها إلى ظروف سريرية مفترضة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تتولد من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) مع منهجيات إعادة برمجة القائم على lentiviral. ومع ذلك، آثار الجينات يحتمل أنكجنيك المتبقية في مناطق كتب بنشاط من الجينوم، والحد من قدرتها على استخدامها في التطبيقات العلاجية الإنسان 1. بالإضافة إلى ذلك، مستضدات غير البشرية المستمدة من إعادة برمجة الخلايا الجذعية أو التمايز في المشتقات ذات الصلة علاجية تمنع هذه hiPSCs من أن تستخدم في سياق السريري الإنسان 2. في هذا الفيديو، نقدم إجراء لإعادة برمجة وتحليل hiPSCs خالية من عامل خال من الجينات المحورة الخارجية. هذه hiPSCs ثم يمكن تحليلها للشذوذ التعبير الجيني في إنترون المتضمنة لالفيروسة البطيئة. يمكن إجراء هذا التحليل باستخدام حساس البلمرة الكمية التفاعل (PCR)، والتي لديها ميزة على أقل التقنيات الحساسة المستخدمة سابقا للكشف عن الخلافات التعبير الجيني 3. تحويل كامل فيالسريرية الصف الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) الشروط، تسمح أهمية سريرية الإنسان. يوفر بروتوكول لدينا أن معايير آمنة-الميناء الحالية سوف توسع وتشمل السمات التي تميزت المشتقات المالية القائمة hiPSC خالية من عامل للتطبيقات العلاجية لالبشرية الناجمة hiPSCs GMP الصف، والتي ينبغي القضاء على أي خطر المناعية نتيجة لمستضدات غير البشرية المقدمة منهجية أخرى. هذا البروتوكول هو الواجب التطبيق على نطاق واسع لlentiviral برمجتها خلايا من أي نوع، ويوفر طريقة استنساخه لتحويل الخلايا المعاد برمجتها في الظروف GMP الصف.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثبت أن الخلايا البشرية البالغة قادرة على الخضوع لإعادة التشكيل اللاجيني وإعادة البرمجة ، نتيجة للتعبير القائم على الفيروسات العدسية لأربعة عوامل نسخ رئيسية4،5. كان التقدم المهم في مجال إعادة البرمجة هو استخدام كاسيت الخلايا الجذعية الفيروسية العصبية القابل للاستئصال (STEMCCA) ، والذي يضم جميع عوامل إعادة البرمجة الأربعة للنسخ التي سمحت بنسبة متكافئ دقيقة لتعبير البروتين6. بالإضافة إلى ذلك ، عند تحويلها إلى تعدد محدد من نطاقات العدوى ، يمكن أن يؤدي STEMCCA إلى أحداث تكامل جينومي فردية في الغالب أثناء عملية إعادةالبرمجة 7. إن إدخال نسخة قابلة للضريبة من STEMCCA ، والتي تستخدم تقنية Cre / loxP متبوعة باستئصال ناقل إعادة البرمجة بعد اشتقاق خط الخلايا الجذعية ، مكن من اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC) المستحثة البشرية الخالية من العوامل8. بالإضافة إلى ذلك ، من أجل تعزيز التطبيقات العلاجية لمركبات hiPSCs ، يجب تنفيذ منهجية جديدة وسريعة وقابلة للتطبيق بسهولة لتحويل خط الخلايا من فئة ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ، من الظروف المحتوية على xeno إلى الظروف الخالية من xeno. هنا ، نناقش منهجية ذات صلة تقيم بدقة أكبر اختلافات التعبير الجيني المتكامل ، خاصة عند دمجها في إنترون ، وتحويل الخلايا السريرية إلى ظروف GMP المفترضة.

استخدمت الأبحاث السابقة فقط تحليل نسخ المصفوفات الدقيقة غير الحساس نسبيا لتحليل اختلافات التعبير الجيني في الجينات المتكاملة بعد نقل STEMCCA3،9. هنا ، نقدم منهجية تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الحساس (PCR) ، لفحص الاختلافات في التعبير الجيني المتكامل. الأهم من ذلك ، أن معايير الملاذ الآمن الحالية تتجاهل hiPSCs التي تحتوي على جينات ذات تكامل فيروسي ، مما يحد من قابلية تطبيق هذه الخلايا للعلاجات الخلوية البشريةالنهائية 9. نقترح أن الوضع الراهن قد يتغير باستخدام hiPSCs المعاد برمجتها داخليا المميزة بالكامل والخالية من الجينات المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم بروتوكول تحويل خلية قوي من فئة GMP يمكن تطبيقه بسهولة على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة ، والتي تم اشتقاقها في الأصل في ظل ظروف تحتوي على xeno10. يوفر هذا فرصا كبيرة لتطوير تجارب إعادة برمجة الخلايا المستقبلية ، والتي تتطلب ظروفا سريرية للحفاظ على الأهمية العلاجية البشرية.

توفر هذه المنهجيات أساسا يمكن من خلاله توسيع معايير الملاذ الآمن الحالية لتشمل خطوط hiPSC المعاد برمجتها STEMCCA المميزة والتي تحافظ على ملف تعريف التعبير الجيني الطبيعي بعد استئصال STEMCCA من الإنترون المتكامل. أيضا ، سيساعد التحويل الكامل إلى ظروف سريرية ، خالية من المستضدات الحيوانية غير البشرية ، على دمج العديد من أنواع الخلايا ، والتي تم إعادة برمجتها سابقا وتمييزها فقط في الظروف المحتوية على xeno. هذه المنهجيات مجتمعة ، هي أسباب مقنعة لإدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) للنظر في توسيع موافقتها المحدودة من العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC) إلى العلاجات القائمة على hiPSC11.

لقد قمنا مؤخرا بتفصيل اشتقاق خط hiPSC الخالي من العوامل الذي تم توصيفه بالكامل وتحويله إلى ظروف سريرية مفترضة10. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول اشتقاق hiPSC باستخدام فيروس العدسات الوعيرة STEMCCA. ثم تخضع هذه الخلايا الجذعية لعملية استئصال متبوعة بتوصيف التعبير الجيني. أخيرا ، يتم تحويل hiPSCs إلى ظروف من الدرجة GMP من خلال منهجية تحويل بطيئة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في الرهبة وآخرون 10.

1. إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية الكبار الإنسان مع STEMCCA

  1. الخلايا الليفية الجلدية ذوبان الجليد الكبار الإنسان (HUFs)، مرور 4 أو أقل، في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة، مع الحرص على عدم غمر رأس القنينة بالماء.
  2. وضع الطين 1 مل من الخلايا الليفية الإنسان في قارورة 15 مل المخروطية ومكان ببطء 4 مل من معيار وسائل الإعلام HUF، تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية، بطريقة الإفلات من الحكمة، لتخفيف من سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) و إعادة تعليق الخلايا.
  3. أجهزة الطرد المركزي القارورة في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف واعادة تعليق الخلايا في حجم كاف من وسائل الاعلام لخلق تعليق 100،000 خلية / مل ثم قم بإضافة 2 مل في بئر واحدة من لوحة ستة جيدا، قبل المغلفة لمدة 20 دقيقة مع 0.2٪ الجيلاتين.
    ملاحظة: أخت جيدا مع عدد متساو من الخلايا في كل سطر وحالة تحتاج إلى المصنف FOص عد خلية / وافر من العدوى (وزارة الداخلية) الحساب.
  4. صخرة الجانب لوحة إلى جنب وذهابا وإيابا لتوزيعها بالتساوي الخلايا. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
  5. في يوم تنبيغ، الحصول على عدد خلايا (ق) من شقيقة جيدا (ق) ما يقرب من 24 ساعة بعد الطلاء HUF الأولي.
  6. ذوبان الجليد من 2 × 10 8 TU، أو ما يعادلها، والتركيز lentiviral (STEMCCA) وتمييع إلى 1 × 10 8 TU / مل في HUF سائل الإعلام.
  7. تنبيغ الخلايا في نسبة 10-MOI في HUF سائل الإعلام تستكمل مع 8 ميكروغرام / مل وكيل ترنسفكأيشن. مزيج الآبار transduced بالتساوي واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
  8. ما يقرب من 24 ساعة بعد تنبيغ lentiviral، والتبديل وسائل الإعلام HUF لمعيار الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (PSC) متوسطة.
  9. في أيام من 2 إلى 6، وتغيير وسائل الاعلام يوميا مع المتوسطة PSC البشري.
  10. في يوم 6، لوحة اثنين من 0.2٪ الجيلاتين المغلفة لوحات 10 سم، من1،5 حتي 1،75 × 10 6 MEFS المستمدة من CF1 الفئران في HUF سائل الإعلام 12.
  11. في يوم 7، والحرص على عدم الطرد المركزي أكثر من 100 x ج، واستخدام درجة حرارة الغرفة التربسين لرفع قبالة يوم 7 الليفية برمجتها من بئر واحدة من لوحة ستة جيدا والمرور بنسبة 01:16، عن طريق الطلاء بالتساوي بين جميع الخلايا كل منهما 10 سم لوحات، مع وسائل الإعلام PSC البشري الطازج، والتي تم مطلي مع MEFS في اليوم السابق. توزيع المجاميع خلية في حركة لولبية في اتجاه عقارب الساعة والمكان في 37 ° C، 5٪ CO 2 مرطب حاضنة بين عشية وضحاها.
  12. ما يقرب من 48 ساعة بعد البذر الخلايا المعاد برمجتها على MEFS وكل يوم بعد ذلك، تغير من وسائل الإعلام PSC الإنسان الذي يقضيه مع وسائل الإعلام الجديدة.
  13. بعد 3 إلى 4 أسابيع، واختيار المستعمرات الفردية مع نموذجي ESC مثل التشكل مع إبرة عيار 21 وsubclone للخروج الى لوحة 24-جيدا من خلال وضع ما يقرب من 8 إلى 10 القطع الفردية من المستعمرات محددة في الآبار الفردية في 0.2٪ الجيلاتين المغلفة 24 لوحة جيدا قبل البذورإد مع MEFS المستمدة من الفئران CF1 في المتوسط ​​PSC البشري.
    ملاحظة: بعد توسيع المستعمرات اختار، المستعمرات لا بد من وصفها بأنها المحفزة من قبل تشكيل هيئة مضغي الشكل وتحليل التعبير عن علامات تعدد القدرات على مستوى البروتين.

2. ناقل التكامل تحليل الموقع وSTEMCCA الختان

  1. تحليل الموقع التكامل STEMCCA من قبل غير المقيدة التضخيم الخطية PCR كما هو موضح 10.
  2. بعد معايرة لضمان التكامل واحد في المنطقة المرغوب فيه من الجينوم، المكوس STEMCCA بواسطة الشفط من العمر المتوسط ​​ESC البشري. ثم، والجمع بين 45 ميكرولتر من المركز فيروس الغدة-لجنة المساواة العرقية-PuroR مع 8 ميكروغرام / مل وكيل ترنسفكأيشن في 3 مل من وسائل الإعلام PSC القياسية لمدة 24 ساعة.
  3. بعد فترة حضانة المرض على مدار 24 ساعة، ونضح قبالة طاف الفيروسي المختلط وغسل الخلايا مرتين مع وسائل الإعلام PSC الإنسان. وضع وسائل الإعلام PSC الإنسان الطازجة مع 2 ميكروغرام / مل بوروميسين لمدة 5 أيام، وتغيير وسائل الإعلام الطرافة اليوميةح وسائل الإعلام الجديدة والمضادات الحيوية.
  4. بعد 5 أيام، subclone المتبقية المستعمرات مع إبرة عيار 21 على 0.2٪ الآبار المغلفة الجيلاتين، في لوحة 12-جيدا قبل المغلفة مع MEFS المستمدة من CF1mice وتوسيع كما هو مفصل أعلاه.
    ملاحظة: بعد التوسع كافيا للحصول على الأسهم المجمدة، مطلوب تحويلها إلى ظروف خالية من وحدة التغذية. نتوقع 95٪ على الأقل الموت مستعمرة الخلايا الجذعية حيث أن معظم خلايا لن transduced بنجاح وسوف تستسلم للمضادات الحيوية خلال فترة 5 أيام من الحضانة. على الرغم من أن الغدة-لجنة المساواة العرقية-PuroR يدمج في كفاءة ،001-1٪ في الكروموسومات مجموعة من الخلايا المصابة، reexposing عينة من المستعمرات خالية من عامل إلى بوروميسين لضمان موت الخلايا 100٪ سيؤكد لم يحدث أي دمج 13.
  5. ذوبان الجليد من قنينة واحدة من قبل aliquoted مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد، على مدى فترة من حوالي 2 ساعة (توصيات الشركة الصانعة) حتى المصفوفة هي السائلة وتمييع إلى تركيز النهائي 1:30 في وسائل الإعلام القاعدية البارد. شركةفي العدد المرغوب فيه من الآبار في لوحة ستة جيدا مع 1 مل لكل بئر. ترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  6. عبر الفتحة (باستخدام إبرة عيار 18 أو الزجاج أو البلاستيك "طرف") لا يقل عن 20 إلى 30 المستعمرات من بئر المغلفة سابقا مع MEFS. كن حذرا للحد من MEF رفع ونقل من لوحة.
    1. توليد الجهاز عبر الفقس من خلال عدد من الأساليب المختلفة، من التدفئة أكثر تعقيدا، وسحب، والانتهاء من ماصة باستير الزجاج على لهب مكشوف، إلى الاستخدام البسيط للمعقم طرف ماصة بلاستيكية أو، كما في حالتنا، 21- و / أو 18 عيار الإبر.
  7. نضح مصفوفة من المغلفة جيدا بعد الحضانة.
  8. إزالة قطعة من المستعمرات عن طريق كشط لطيف من لوحة قديمة مع pipettor 200 ميكرولتر ووضعها بعناية إلى 3 مل من وسائل الإعلام مجتمعة جديدة 1 في لوحة المغلفة المصفوفة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة مرطب. تغيير وسائل الإعلام 48 ساعة بعد الركض.
  9. استخراج الحمض النووي الجيني من hiPSCs تحويله بعد رفعه وخالية من وحدة التغذية، في أكثر من 80٪ confluency، وذلك باستخدام مجموعات استخراج الحمض النووي التجاري.
  10. تحليل لالختان السليم مع الاشعال محددة لالتكامل الخارجية من الفيروسة البطيئة STEMCCA: gDNA-hendo-MycS إلى الأمام، 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '؛ gDNA-hWPRE للعكس، 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 ". إعادة الاشعال مجفف بالتجميد بالماء PCR الصف إلى حل الأسهم 10 ميكرومتر.
  11. تشغيل PCR مع بروتوكول خمس خطوات التالية: تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 35 دورات من كل مما يلي: تمسخ في 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، والصلب التمهيدي في 62 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، والإرشاد عند 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ تليها دورة التمديد النهائي واحد في 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  12. جعل 3٪ هلام الاغاروز وزنها عن طريق 1.5 غرام من الاغاروز ووضعه في 50 مل 1X تريس، خلات-EDTA العازلة. يذوب الميكروويف حتى الاغاروز ومكان في هلام DNA وصمة عار في صروبر تخفيف المزيج، والاستغناء الحجم المناسب في هلام كاسيت لترسيخ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  13. تحميل 12 ميكرولتر من الناتج PCR مختلطة مع 3 ميكرولتر من صبغ تحميل إلى 3٪ agarose هلام. تشغيل هلام لمدة 30 دقيقة في 80 V.
  14. تصور مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لعدم وجود الفرقة تشير الختان الصحيح.

3. الكميات من الاختلافات التعبير الجيني باستخدام PCR الكمي من قبل وhiPSCs المشاركة رفعه-

  1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من hiPSCs تحويله بعد رفعه وخالية من وحدة التغذية باستخدام مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية.
  2. عكس نسخ تصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مجموعات التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام الراسية-بنسبة ضئيلة (DT) 18 والاشعال مسدوس عشوائية.
    ملاحظة: تأكد من أن بروتوكول PCR تم تصميم لنسخ الجينات في أكثر من أو أقل من 4 كيلو بايت. سوف تحتاج إلى أن تكون لأنني أيهما الجين STEMCCA متكاملة أصلا الاشعال محددةn ل.
  3. إعادة تشكيل التمهيدي مجفف بالتجميد بالماء PCR الصف إلى حل الأسهم 20 ميكرومتر.
  4. استخدام 5 نانوغرام من عينة في 20 ميكرولتر من رد الفعل الذي يتكون من 10 ميكرومتر UPL التحقيق، 2X LightCycler 480 المسابر ماستر، و 20 ميكرومتر إلى الأمام وعكس الاشعال.

4. شروط التحويل إلى GMP الصف

  1. في اليوم الأول من الانتقال للhiPSCs بعد رفعه لأكثر من الشروط GMP الصف، وجعل مزيج من وسائل الاعلام التي تتكون من PSC الإنسان جنبا إلى جنب وسائل الإعلام 1 (وسائل الإعلام مجتمعة 1) والصف السريرية الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) وسائل الاعلام المتوافقة (وسائل الإعلام مجتمعة 2 ) في نسبة 80:20.
  2. نضح قبالة وسائل الإعلام مجتمعة القديمة (1) ووضع 3 مل من وسائل الإعلام مجتمعة الجديدة 1 و 2، قبل تحسنت، في نسبة 80:20. تغيير وسائل الإعلام يوميا لمدة 3 أيام مع هذه النسبة محددة. خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
  3. في يوم 4، وجعل وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في نسبة 50:50. نضح قبالة المتوسطة من العمر وreplacالبريد مع وسائل الإعلام استعد مسبقا، مع وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في نسبة 50:50. تغيير وسائل الإعلام لمدة 3 أيام مع هذه النسبة محددة. خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
  4. في يوم 7، وجعل وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في نسبة 20:80. نضح قبالة المتوسطة القديمة واستبدالها مع وسائل الاعلام قبل تحسنت، مع وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في نسبة 20:80. تغيير وسائل الإعلام لمدة 3 أيام مع هذه النسبة محددة. خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
  5. في يوم 10، وجعل وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في 0: نسبة 100. نضح قبالة المتوسطة القديمة واستبدالها مع وسائل الإعلام استعد مسبقا، مع وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في 0: نسبة 100. تغيير وسائل الاعلام كل يوم في هذه النسبة محددة. الخلايا هي الآن في تعريف تماما خالية من كره وسائل الإعلام. خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
    ملاحظة: أثناء هذه العملية تحويل بأكملها، وهناك حاجة الركض روتيني مع إبرة عيار 18 للحفاظ على حجم مستعمرة السليم والكثافة. الخطة على صassaging خلايا كل 4 إلى 5 أيام على أساس حجم مستعمرة، confluency، والتمايز.
  6. طبقة واحدة بشكل جيد في لوحة ستة جيدا مع خالية من كره الركيزة محددة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
  7. مرور ميكانيكيا ومتموجة بشكل جيد، وتحويلها بالفعل إلى خالية من كره الظروف وسائل الإعلام، من لوحة ستة جيدا مع إبرة عيار 18. الأهم من ذلك، وضع وسائل الإعلام الجديدة (وسائل الإعلام مجتمعة 2) على الخلايا مع 1X ROCK المانع لمدة 1 ساعة، قبل الركض إلى ما قبل حالة وسائل الإعلام.
  8. نضح الركيزة حل الاصطناعية قبالة لوحة جديدة أن الخلايا يتم نقله إلى. إزالة كافة وسائل الإعلام التي تحتوي على كتل الخلايا الجذعية من لوحة قديمة ونقلها إلى لوحة جديدة.
  9. خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة لأيام 2 مع الحد الأدنى من اضطراب البدني (مثالي لوحات، ومرة واحدة داخل الحاضنة، لا يتم لمسها بشكل مباشر في أي وسيلة) للسماح أقصى المرفق.
    ملاحظة: سوف الخلايا تتطلب تغييرات وسائل الإعلام اليومية. passagin المستمرغرام كل 4 أيام ستكون مهمة. باستخدام إبرة عيار 21، والمرور فقط أجزاء من المستعمرات مع الأمثل ESC مثل التشكل (نسبة نووي هيولي عالية). وهذا يضمن اختيار المستعمرات hiPSC المناسبة التي سوف تنمو بشكل جيد وتسفر في نهاية المطاف المستعمرات متجانسة. الوقت الكلي لاشتقاق ESC مثل المستعمرات ما بين 15-20 يوما بعد التغيير سائل الإعلام الموحد الأولي.
  10. تجميد أسفل-رفعه آخر hiPSCs GMP من الدرجة الأولى من قبل عبر فتحة كل من المستعمرات باستخدام إبرة عيار 18. رفع جميع القطع قبالة باستخدام 200 ميكرولتر pipettor ونقل جميع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا إلى 15 مل قارورة المخروطية والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  11. في حين أن الخلايا الطرد المركزي، وجعل وسائل الإعلام تجميد تتكون من أحجام متساوية من وسائل الإعلام مجتمعة الباردة 2 وتجميد المتوسطة مع تركيز DMSO النهائية من 7.5٪.
  12. بعد أن يتم مكعبات الخلايا، ونضح قبالة المتوسطة من العمر وإسقاط الحكيم إعادة تعليق بيليه مع وسائل الإعلام التجميد. TR فوراansfer إلى قارورة تجميد وضعت في الفريزر -80 درجة مئوية.

5. hiPSCs تميز GMP الصف مشاركة ورفعه-

  1. لضمان التعبير السليم للعلامات تعدد القدرات بعد التحويل، استخدم QPCR لقياس التعبير عن علامات تعدد القدرات الرئيسية (SOX2، OCT4، وNANOG) باستخدام الاشعال المدرجة في الجدول 1 مع نفس الخطوات المذكورة في الخطوة 3. منهجيات QPCR اتبع نفس الخطوات كما هو موضح في الخطوة 3.
  2. استخدام تدفق الخلوي للكشف عن حمض غير البشرية اللعابي Neu5Gc (N حمض -glycolylneuraminic) وفقا للشروط القياسية المدرجة في المجموعة كما نشرت سابقا 10.
  3. غسل بلطف لوحات ثقافة الخلية مع الخلايا باستخدام 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  4. فصل المستعمرات باستخدام 1X التفكك كاشف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. خلال فترة حضانة 5 دقائق من الخطوة 5.4، وإعداد عرقلة الحل (المنصوص عليها فيطقم) بجعل 0.5٪ حجب الوكيل في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
  6. تسمية المجموعة التالية من الأنابيب لتحليل التدفق الخلوي: غير ملوثين. 4 "، 6-Diamidino-2-phenylindole (دابي) دابي. السيطرة الضد 1: 200. الأجسام المضادة الأولية 1: 200. الأجسام المضادة الثانوية 1: 200 حمار مكافحة الدجاج مفتش (H + L)؛ عينة MEFS. الخلايا بعد رفعه عينة على مصفوفة. وعينة الخلايا على الركيزة الاصطناعية آخر رفعه.
  7. طرد بلطف المجاميع خلية من الخطوة 5.4 بإضافة 2 مل من حجب محتويات حل، ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 80 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  8. غسل الخلايا مرتين مع عرقلة الحل وأجهزة الطرد المركزي كما جاء في الخطوة 5.7.
  9. بلطف اعادة تعليق حوالي 1 × 10 6 الخلايا في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل مع حجم التخفيف المقابلة من كل الأجسام المضادة. احتضان مع هزاز لطيف في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  10. كرر يغسل ثلاث مرات كما في الخطوة 5.8.
  11. اعادة تعليق بيليه خلية في 400 ميكرولتر من مخفف بوffer (من مجموعة) مع 1: 100 من دابي لأنابيب 2 و 6 و 7 و 8 على النحو الوارد ضمن الخطوة 5.6.
  12. خلايا سلالة من خلال مصفاة 40 ميكرومتر وتعمل من خلال تدفق عداد الكريات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكول لاشتقاق السريري الصف خالية من عامل hiPSCs باستخدام نهج إعادة برمجة تستند lentiviral-STEMCCA. ويبين الشكل 1A صورة تمثيلية من ثلاثة خطوط رفعه قبل مختلف hiPSC، بعد إعادة برمجة مع اقتراب STEMCCA على طبقة من MEFS. والميزة الرئيسية لهذا النهج إعادة برمجة STEMCCA تكمن في نجاح إعادة برمجة يتفق علماء متعددة تحقيقه، في مجموعات بحثية مختلفة ومواقع. 1B الشكل يعرض بعد الختان للعكس النسخ-PCR هلام، والتي تبين subclone معين واحد (2.3) وهو خال تماما ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف منهجية مستمدة hiPSCs خالية من عامل وجعلها ذات الصلة سريريا عن طريق تحويل هذه الخلايا إلى الظروف GMP الصف لتمايز الخلايا المصب في العلاجات البشرية في المستقبل. وعلى الرغم من هذا البروتوكول هو الواجب التطبيق على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، اخترنا لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية الإنسان، وذلك بسبب سهولة استخراج من المريض وانطباقها على العلاجات البشرية شخصية. مرة واحدة يتم علاجها القيود بقدر التمايز كامل في المشتقات خلية ذات الصلة سريريا قلق 14، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتلقى جيمس أ. بيرن (JAB) وأوجستين فيغا كريسبو تمويلا بحثيا من شركة Fibrocell Science، Inc. JAB هو مستشار علمي لشركة Fibrocell Science، Inc. لا يوجد مؤلفون آخرون لديهم أي مصالح متنافسة للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< ص الفئة = 'jove_content'>نود أن نشكر باتريك C. لي, سيريل راماثال, وسارافانان كارومبايارام (SK) لمساعدتهم في إجراء تجارب اشتقاق وتوصيف iPSC; آرون كوبر لإجراء تجارب تحليل iPSC; فيتوريو سيباستيانو ورينيه أ. ريجو بيرا لتوجيه جهود إعادة البرمجة الأولية. SK, وليام E. لوري, جيروم A. زاك, ودونالد B. كوهن لتوجيه إنشاء مرافق GMP جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس السماح بتحويل وتوصيف iPSCs الصف السريري; غوستافو موستوسلافسكي لتزويدنا بناقل إعادة برمجة STEMCCA polycistronic. يعتمد هذا العمل على تعاون بحثي مع Fibrocell Science ومبادرة التحقيقات السريرية للمشتقات الجلدية التي تم الحصول عليها من اللحمة المتوسطة (CIDMOD) لتوليد علاجات خلوية آمنة وشخصية. تم دعم هذا العمل بتمويل من مركز إيلي وإيديث برود للطب التجديدي وأبحاث الخلايا الجذعية في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ، ومؤسسة عائلة فيلبس ، وشركة Fibrocell Science، Inc. ، وجائزة UCLA CTSI Scholar's Award ل JAB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الأساسية < td colspan = "4" > media< / strong>

<قوي > وسائل الإعلام والكواشف < / قوي >
DMEM / F12 (الوسائط القاعدية)Invitrogen (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)11330057
مصل الأبقار الجنينيInvitrogen16000044
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 100xInvitrogen11140050
Glutamax ، 100xInvitrogen35050-061
PenStrep ، البنسلين - الستربتومايسين ، 100xInvitrogen15140-122ذوبان الجليد عند 4 درجات ؛ C ، aliquot والتخزين في & ناقص ؛ 20 درجة ؛ C
Knockout مصل بديلInvitrogen10828028ذوبان الجليد عند 4 درجات ؛ C ، aliquot والتخزين في & ناقص ؛ 20 درجة ؛ C
Trypsin / EDTA ، 0.5٪Invitrogen15400-054تخفيف المخزون إلى 0.05٪ في 1x PBS
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسيةGlobalStem (روكفيل ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية)GSR-2001إعادة التكوين إلى 10 & micro ؛ جم / مل من المخزون في 0.1٪ ألبومين مصل البقر المذاب في 1x PBS وتخزينه عند & ناقص ؛ 80 درجة ؛ C
& beta ؛ -mercaptoethanolMillipore (Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)ES-007-E
Matrigel (مصفوفة الغشاء القاعدي) BDBiosciences (سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)356231تمييع قارورة Matrigel مع 10 مل من DMEM / F12 أثناء وجوده على الجليد لتخفيف 1: 2. Aliquot وتخزينها في & ناقص ؛ 20 درجة مئوية.
CELLstart (الركيزة الاصطناعية)InvitrogenA1014201
Stemmolecule Y27632Stemgent (كامبريدج ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)04-0012-02
PuromycinInvitrogenA1113802
LightCycler 480 Probes MasterRoche (بازل ، سويسرا)4707494001
ProFreeze-CDM متوسط / وسط التجميدLonza (بازل ، سويسرا)12-769E
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)D8418
PBSInvitrogen14190-250
100 BP DNA سلمInvitrogen15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10،000xInvitrogenS33102
Agarose Bio-Rad Laboratories، Inc. (هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)161-3101
الجيلاتين ، من جلد الخنازيرSigma-AldrichG1890-100Gاصنع مخزونا بنسبة 0.2٪ في PBS ، الأوتوكلاف وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
mTeSR1StemCell Technologies (فانكوفر ، كولومبيا البريطانية ، كندا)5850الجمع بين الملحق 5x مع الوسط الأساسي ، aliquot وتخزينه عند 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
Stemedia NutriStem XF / FF Culture Medium: Stemgent05-100-1Aذوبان الجليد عند 4 درجات ؛ C O / N ، aliquot وتخزينها في 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
PrimocinInvivoGen (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)ant-pm-1
Accutase (كاشف التفكك)InvitrogenA1110501
الحمار المضاد للدجاج IgG AlexaFluor 488Jackson ImmunoResearch (ويست جروف ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)703-546-155
عامل البوليبرين / التعداءMilliporeTR-1003-G
Plasticware
12 بئراVWR (ويست تشيستر ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)29442-038
ألواح 6 آبارVWR29442-042
ألواح مقاس 10 سمSigma-AldrichZ688819
إبرة قياس 18فيشر Scientific (بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)148265D
إبرة قياس 21فيشر Scientific14-829-10D
<قوي>المعدات
BD LSRII مقياس التدفقالخلوي KSystem من نيكون (طوكيو ، اليابان)
BD FACSDiva الإصدار 6.1.3 برنامجBD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini KitInvitrogenK182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR KitKAPA Biosystems (ويلمنجتون، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)KK2601
طقم عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاءRoche11828665001
Transcriptor First Strand cDNA SynthesisKit Roche4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic PackKit Sialix (نيوتن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)الحزمة
الوسائط المدمجة 1تقنيات الخلايا الجذعية و يتكون Stemgentمن أجزاء متساوية mTeSR1 و Nutristem
Combined media 2تقنيات الخلايا الجذعية ويتكون Stemgentمن أجزاء متساوية TeSR2 و Nutristem
HUF MediaDulbecco ' s النسر المعدل s متوسط / F12 [DMEM / F12] مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ، و 1x أحماض أمينية غير أساسية ، و 1x Glutamax ، و 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell MediaDMEM / F12 مكمل باستبدال مصل بالضربة القاضية بنسبة 20٪ ، 1x Glutamax ، 1x أحماض أمينية غير أساسية ، 1x Primocin، 1x بيتا ؛ ميركابتو إيثانول ، و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية.
DMEM / F12 ، Dulbecco ' s النسر المعدل s متوسط/F12; PBS ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
  2. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
  3. Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
  4. Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
  7. Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
  8. Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
  9. Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
  10. Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
  11. Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
  12. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
  13. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
  14. Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
  15. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  16. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

lentiviral Adeno Cre GMP

مقالات ذات صلة