Method Article

نمذجة الأغشية المخاطية المبيضات في اليرقات الزرد عن طريق الحقن Swimbladder

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الجسم الحي ، لا يمكن تصوير التفاعلات المكانية والزمانية لمسببات الأمراض والدفاعات المناعية على مستوى الغشاء المخاطي بسهولة في مضيفات الفقاريات الحالية. تصف الطريقة المعروضة هنا منصة متعددة الاستخدامات لدراسة داء المبيضات المخاطية في الفقاريات الحية باستخدام مثانة السباحة لأسماك الزرد الصغيرة كموقع للعدوى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون دفاع مبكر ضد مسببات الأمراض المخاطية لكل من حاجز الظهارية والخلايا المناعية الفطرية. وimmunocompetency على حد سواء، والاتصال الداخلي، ولها أهمية قصوى لحماية ضد الالتهابات. من الأفضل أن التحقيق تفاعلات الخلايا المناعية الفطرية الظهارية ومع الممرض في الجسم الحي، حيث تتكشف سلوك معقد عبر الزمان والمكان. ومع ذلك، النماذج الحالية لا تسمح لسهولة التصوير المكانية والزمانية للمعركة مع مسببات الأمراض على مستوى الغشاء المخاطي.

النموذج المطور هنا يخلق إصابة الغشاء المخاطي عن طريق الحقن المباشر للممرض فطري، المبيضات البيض، في swimbladder من الزرد الأحداث. العدوى الناجمة تمكن عالية الدقة التصوير السلوك الخلايا المناعية الظهارية والفطري في جميع أنحاء تطور مرض الغشاء المخاطي. براعة هذا الأسلوب يسمح للاستجواب من المضيف للتحقيق في تسلسل مفصل للأحداث المناعة مما يؤدي إلى فتاهالتوظيف agocyte وللنظر في أدوار معينة أنواع الخلايا والمسارات الجزيئية في مجال الحماية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير سلوك الممرض بوصفها وظيفة من الهجوم المناعي في وقت واحد باستخدام الفلورسنت، معربا عن بروتين C. البيض. زيادة القرار المكانية للتفاعل المضيف الممرض هو ممكن أيضا باستخدام تقنية swimbladder تشريح السريعة وصفها.

نموذج إصابة الغشاء المخاطي الموصوفة هنا واضح وصريح وتكرار للغاية، مما يجعلها أداة قيمة لدراسة داء المبيضات المخاطية. هذا النظام قد يكون أيضا للترجمة على نطاق واسع لمسببات الأمراض المخاطية الأخرى مثل الميكروبات المتفطرات، البكتيرية أو الفيروسية التي تصيب عادة من خلال الأسطح الظهارية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تؤدي الالتهابات المخاطية إلى التهابات مجرى الدم التي تهدد الحياة بسبب تلف الحاجز الظهاري ، مما يسمح لمسببات الأمراض بالوصول إلى البيئة الجهازية1،2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تسبب الالتهابات المخاطية أيضا أمراض مناعية كبيرة حتى عند احتوائها خارجيا3-5. الفطريات أحادية الخلية المتعايشة المبيضات البيضاء موجودة في غالبية السكان في تجويف الفم والمواقع المخاطية الأخرى6-9. على الرغم من احتواء الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية عادة ، إلا أن العيوب المناعية الفطرية والتدخلات الطبية يمكن أن تؤدي إلى داء الغشاء المخاطي الشديد. يؤدي الاعتداء على الحاجز الظهاري إلى زيادة خطر الإصابة بأمراض منتشرة تهدد الحياة وكذلك علم الأمراض المناعية ، كما هو الحال في داء المبيضات الفرجي المهبلي ، بالإضافة إلى ذلك C. albicans تم ربط استعمار الاستعمار مع التوازن المناعي للرئة10،11. يعد داء المبيضات المنتشر الآن رابع أكثر أنواع العدوى شيوعا في مجرى الدم في وحدات العناية المركزة12 ، ومعدل الوفيات الذي يصل إلى 40٪ يجعله مصدر قلق كبير. نظرا لزيادة العلاجات المناعية للمرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية أو السرطان أو زرع الأعضاء ، من الضروري فهم التفاعل بين هذا العامل الممرض وحجرة المناعة المخاطية.

< p class = 'jove_content'>غالبية التطورات البيولوجية للخلية فيما يتعلق بالمطثية البيضاء وتفاعلات الخلايا على مستوى الغشاء المخاطي تأتي من نماذج المختبر13-15 ونماذج الفئران16-18. كلا النهجين لهما مزايا مميزة ، لكن القدرة على تصوير الخلايا الحية بدقة عالية في مضيف سليم حدت من التوصيف الزمني والمكاني للعدوى. بالنسبة لهذه الدراسات ، هناك حاجة إلى نموذج في الجسم الحي حيث يمكن تصور تفاعل الخلايا المسببة للأمراض والخلايا المناعية الفطرية والظهارية في مضيف فقاري سليم.

برزت أسماك الزرد كأداة لا تقدر بثمن لفهم الأمراض التي تصيب الإنسان ، ويرجع ذلك أساسا إلى شفافيتها وقابليتها للتلاعب الجيني. تم تصوير تطور الخلايا والأعضاء بتفاصيل رائعة ، مما أدى إلى وصف سلوكيات الخلايا المناعية الجديدة ، مثل سلوك الخلايا التائية في الغدة الصعتريةالنامية 19 أو المعركة بين البكتيريا الفطرية داخل الخلايا والخلايا البلعمية20-22. وصفت الأعمال الحديثة تفاعلات المضيف بين الميكروبات المعوية في أسماك الزرد وأظهر أن الاستعمار الميكروبي للأمعاء يؤثر على فسيولوجيا الأمعاء المضيفة ومقاومة الالتهابات الأخرى23،24. علاوة على ذلك ، تم وصف العدوى من خلال ظهارة الأمعاء للعديد من مسببات الأمراض.

على عكس الأمعاء ، تمثل مثانة السباحة نموذجا مخاطيا أكثر عزلة وتكاملا. هذا العضو هو امتداد لأنبوب الأمعاء النامية ويتشكل في الأمام إلى الكبد والبنكرياس25،26. ينتج ببتيدات خافضة للتوتر السطحي والمخاط ومضاد للميكروبات27،28 ومن الناحية التشريحية ، وكذلك من الناحية الوراثية ، يعتبر هذا العضو متماثلا لرئة الثدييات29،30. نظرا لأن القناة الهوائية تظل متصلة بالأمعاء في سمك الزرد ، فإن هذا يسمح بحدوث عدوى الغمر بشكل طبيعي. من اللافت للنظر أن العدوى الوحيدة المعروفة التي تحدث بشكل طبيعي للأسماك بأنواع المبيضات هي C. albicans عدوى في مثانةالسباحة 31. وصفنا مؤخرا نموذجا تجريبيا لعدوى الغمر حيث تصيب المطثية البيضاء المثانة ، ووجدنا أن هذه العدوى تلخص بعض السمات المميزة للتفاعل الظهاري المطثية البيضاء في المختبر32،33.

في الطريقة المعروضة هنا ، تم تحسين نموذج عدوى الغمر الأصلي عن طريق حقن C. albicans مباشرة في مثانة السباحة لمدة 4 أيام بعد الإخصاب (dpf). هذا يسمح بالتحكم الزمني الدقيق في العدوى بالإضافة إلى لقاح قابل للتكرار بدرجة كبيرة. يسمح بالتصوير المفصل داخل الحيوية ، إلى جانب تعدد استخدامات نموذج الزرد. كمثال على ما يمكن القيام به بهذه الطريقة ، نقدم الديناميكيات المكانية والزمانية لنمو المطثية البيضاء جنبا إلى جنب مع تجنيد العدلات في موقع الإصابة. نظرا لأن أنسجة مثانة السباحة من الصعب تصويرها داخل الحياة ، فإننا نقدم أيضا تقنية تشريح مثانة السباحة السريع التي تعمل على تحسين إشارة التألق والدقة المجهرية. تعمل هذه الأساليب على توسيع مجموعة الأدوات للأبحاث الفطرية والمناعية وتربية الأحياء المائية بالإضافة إلى وصف مسار عدوى جديد يمكن ترجمته لنمذجة الالتهابات الفطرية أو البكتيرية أو الفيروسية الأخرى للأسطح المخاطية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تنفيذ كافة بروتوكولات الرعاية الزرد والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة تحت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC) بروتوكول A2012-11-03.

1. الزرد تربية إلى 4 أيام بعد الإخصاب

  1. جمع AB الزرد، أو أي خطوط المعدلة وراثيا أخرى، في أول الإخصاب آخر 3 ساعة، كما هو مبين في فيديو آخر 34.
  2. احتضان البيض 120 في 15 سم أطباق بتري تحتوي على 150 مل من وسائل الاعلام E3 (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgCl 2، 2 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 6.8) مع الميثيلين الأزرق (0.3 ميكروغرام / مل النهائي تركيز) في 33 ° C حاضنة مع 12/12 ضوء / الإضاءة المظلمة.
  3. استبدال وسائل الاعلام بعد 6 ساعات مع E3 + PTU (1-فينيل-2-ثيوريا، 10 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) وإزالة البيض الميت.
  4. احتضان لمدة 4 أيام في 33 ° C، وتبادل وسائل الإعلام مع E3 الطازجة + PTU بعد 2 أيام.

2. فيjection مايكرو إبرة إعداد

  1. سحب الشعرية البورسليكات (OD 1.2 مم؛ ID 0.69 مم) في إبرة الجزئي باستخدام إبرة مجتذب مع الإعدادات التالية (550 الحرارة، 0 سحب، سرعة 130، 110 مرة).
    ملاحظة: تختلف الإعدادات من خيوط لخيوط للحصول على شكل وبالمثل الإبر الصغيرة (انظر الشكل 1)، وسوف تحتاج إلى إعادة تعديل كلما تم تثبيت خيوط جديدة.
  2. ملء إبرة الجزئي مع 3 ميكرولتر من 0.4 ميكرون تصفية المياه المالحة عازلة الفوسفات (PBS، 137 مم كلوريد الصوديوم؛ 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4؛ 1.8 ملي KH 2 PO 4؛ ودرجة الحموضة 7.4) باستخدام 20 ميكرولتر microloader ماصة معلومات سرية.
  3. إعداد إبرة صغيرة على حامل ممص مكروى على micromanipulator تعلق على نظام حقن الضغط. ضبط ضغط الحقن إلى 30 PSI ومدة النبضة في 30 ميللي ثانية.
  4. استخدام طبق بتري مع الماء المقطر، وانخفاض الإبرة الدقيقة حتى 1/5 من الإبرة هو في الماء. مقطع واي الدقيقة إبرةث ملاقط غرامة أقل بقليل من مستوى المياه. جلب الإبرة الصغيرة من الماء، ودفع دواسة عدة مرات حتى تظهر بلعة.
  5. قياس قطر البلعة عن طريق خفض إبرة صغيرة على عدادة الكريات الطبقات مع قطرة واحدة من نوع الزيت الغمر. ضبط مدة النبضة للحصول على حجم المطلوب (انظر الجدول 1).
  6. تعيين احداهما لالبلعة أن تبقى مستقرة في الزيت (خفض ضغط إذا كان البلعة يزيد حجم وزيادة الضغط الخلفي إذا يقلل من حجم البلعة). تسجيل مدة النبضة لكل الإبرة الدقيقة.
  7. إزالة PBS من الإبرة الدقيقة بواسطة الشفط باستخدام ماصة طرف microloader وطرد اليسار الإفراط في برنامج تلفزيوني عن طريق وضعها مرة أخرى على حاقن والتقليب التحول النبض المستمر. حجز كل إبرة صغيرة.

3. إعداد المبيضات

  1. خط المبيضات البيض تحولت مع الأمثل كودون dTomato، GFP، BFP، EOS أو الأقصىالأحمر من الأسهم المجمدة (-80 ° C الأسهم في 25٪ الجلسرين) باستخدام وتد خشبي عقيمة في الصعود إلى سكر العنب الخميرة peptine (YPD) لوحة أجار (10 ز / L خلاصة الخميرة، و 20 غرام / L ببتون، 20 ز / L سكر العنب ، 20 ز / L أجار، تعقيمها وسكب 25 مل في أطباق بتري) واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  2. اختيار مستعمرة واحدة باستخدام وتد خشبي معقمة وتلقيح إلى 5 مل من YPD السائل (10 غ / L خلاصة الخميرة، و 20 غرام / L ببتون، 20 ز / L سكر العنب، تعقيمها وaliquotted جو معقم و مطهر في 5 مل في 16 × 150 مم الثقافة الزجاج أنابيب).
  3. احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في طبل الأسطوانة على 60 دورة في الدقيقة.
  4. جمع 1 مل من C. ثقافة البيض ونقل إلى 1.7 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 5،000 x ج لمدة بضع ثوان. إفراغ طاف وإضافة 1 مل من العقيمة PBS، دوامة بدقة. كرر ذلك مرتين.
  6. عدد المستعمرات باستخدام عدادة الكريات عن طريق تمييع 1 مل الأسهم 1: 1،000 في برنامج تلفزيوني العقيمة.

4. عن طريق الحقن اسماك الزرد فيوSwimbladder

  1. تدفئة طبق الحقن (2٪ الاغاروز) لمدة 30 دقيقة في 33 ° C الحاضنة.
  2. في الوقت المطلوب، وإزالة 100 من 150 مل من E3 + PTU من 15 سم طبق بتري تحتوي على الأسماك لحقن باستخدام ماصة 25 مل من دون أي الشفط الزرد.
  3. تخدير 4 DPF الزرد بإضافة 2 مل من 4 ملغ / مل التخزين المؤقت تريكين الميثان سلفونات الأسهم (TR) إلى 50 مل سائل الإعلام المتبقية (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل) والانتظار لمدة 15 دقيقة.
  4. تحت المجهر تشريح، حدد السمك مع swimbladder تضخم. كما يمكن فحص الأسماك في ذلك الوقت عن النمط الظاهري متجانسة، مثل توزيع العدلات في الخطة الرئيسية للعمليات: خط GFP تستخدم لتشريح epifluorescence المجهر.
  5. تمييع C. الأسهم البيض من التركيز الأصلي (الخطوة 3.8) إلى 1.5 × 10 7 مستعمرة لكل مل (وت م / مل) في برنامج تلفزيوني.
  6. نقل 30 الزرد على طبق الحقن باستخدام أنابيب نقل البلاستيكTTE وإزالة وسائل الإعلام الزائد.
  7. باستخدام أداة الصيد سلك (لصقها فائقة 0.012 بوصة خط الصيد قطرها إلى الشعرية البورسليكات)، وجعل 3 خطوط من 10 الأسماك، من خلال عقد طبق حقن عموديا وتوجيه الأسماك عموديا.
  8. إزالة وسائل الإعلام الزائد.
  9. تماما دوامة أنبوب مع 1.5 × 10 7 وت م / مل C. البيض.
  10. ملء واحدة إبرة الصغيرة مع 3 ميكرولتر من C. البيض باستخدام microloader ماصة جديدة طرف وتعيين مدة النبضة إلى الإعداد المناسب (راجع الخطوة 2.9).
  11. وتناوب على طبق حقن لجعل بزاوية 20 درجة بين الإبرة الدقيقة ورئيس الأسماك، وتهدف نحو الجزء الخلفي من swimbladder (الشكل 3A).
  12. دفع الإبرة الدقيقة في swimbladder، والتأكد من تحمل الإبرة في التجويف، ثم اضغط على دواسة مرة واحدة.
  13. كرر لكل الأسماك ونقل إلى طبق الاسترداد (25 مل E3 + PTU) من الفيضانات الطبق مع E3 لد تفريغها في طبق الانتعاش.
  14. نقل 30 سمكة أخرى إلى الطبق الحقن.
  15. كرر حقن بإبرة صغيرة جديدة مليئة تماما vortexed C. البيض.
  16. النهاية عن طريق حقن السيطرة PBS، إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام طبق حقن مختلفة لتجنب التلوث ونقل إلى طبق الانتعاش منفصل (الخطوة 4.10).

5. فحص الأسماك للالمرغوب اللقاح

  1. إعداد 40 مل من 0.4٪ المنخفضة للذوبان الحل الاغاروز (LMA) وذلك بإضافة 160 ملغ من انخفاض ذوبان الاغاروز إلى 40 مل من E3، عن طريق الميكروويف حتى يذوب، والتبريد إلى 37 درجة مئوية المغلي. إضافة 400 ميكرولتر من TR (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل) مرة واحدة تبرد.
  2. بعد 30 دقيقة الانتعاش، وتخدير الأسماك كما هو موضح (الخطوة 4.3 باستخدام 1 فقط مل من TR إلى 25 مل E3 + PTU، وتركيز النهائي 200 ميكروغرام / مل).
  3. نقل 30 السمك (مع وسائل الإعلام أقل قدر ممكن) إلى 2 مل من LMA في قارب وزنه.
  4. نضح الأسماك الفردية مع ماصة نقل وصفيحة السمك مع 1 قطرات من LMA في لوحة التصوير 96-جيدا، فقط باستخدام الآبار المركزية 10 × 6.
  5. كرر حتى يتم تحميل جميع الأسماك إلى الشاشة على لوحة التصوير.
  6. دع وسائل الإعلام يصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  7. ضع السمك في صفهم، والتأكد من أنها على اتصال مع الجزء السفلي من الزجاج.
  8. باستخدام الهدف 20X على epifluorescence مقلوب / المجهر متحد البؤر والمرشح المناسب، تسجيل عدد من C. خلايا الخميرة البيض في swimbladder كل السمكة.
  9. حدد السمك مع 15-25 خلايا الخميرة في swimbladder (أو اللقاح المطلوب)، الموت ببطء الأسماك غير المحدد (800 ميكروغرام / مل من TR في E3) والعودة الأسماك المحدد إلى طبق بتري العميق مع 50 مل من E3 + PTU من قبل مضيفا 3 قطرات من E3 إلى لوحة التصوير آبار مختارة والشفط السمك مع ماصة نقل البلاستيكية.
  10. احتضان عند 33 ° C لمدة المرجوة.

6. التصوير الأسماك بعد الفحص

  1. في الوقت المطلوب، وإزالة 25 من 50 مل من وسائل الاعلام E3 + PTU من طبق بتري العميق التي تحتوي على الأسماك إلى الصورة.
  2. تخدير الأسماك كما هو موضح (الخطوة 4.3 باستخدام 1 فقط مل من TR إلى 25 مل E3 + PTU المتبقية، نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل).
  3. لوحة السمك في لوحة التصوير 96-جيدا والموقف بشكل مناسب (الخطوات 5،3-5،7).
  4. الصورة عن طريق المجهر متحد البؤر باستخدام أشعة الليزر المناسبة والمرشحات الانبعاثات. التركيز الأول على الأسماك باستخدام الهدف 4X تحت تدخل الفرق النقيض (DIC) والحصول على صور من المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الهدف 20X مع الليزر مبائر في وضع المسح الضوئي مع 2 سرعة μsec / بكسل و 1024 × 600 بكسل نسبة الجانب. اكتساب Z-مداخن مع 1 ميكرومتر خطوة حجم، وتطبيق وضع مرشح كالمان من 3 الإطارات.
  5. العودة إلى طبق بتري العميق مع 50 مل E3 + PTU أو إلى individuaآبار ل (طبق 24-جيدا الثقافة، 3 مل E3 + PTU)، واحتضان عند 33 ° C.

7. تشريح Swimbladder

  1. ملء حقنة 10 مل مع ارتفاع الشحوم فراغ.
  2. إعداد LMA 2٪ (الخطوة 5.3 مع 160 ملغ من انصهار منخفضة الاغاروز في 8 مل من E3).
  3. وفي الوقت المطلوب، تخدير الأسماك (الخطوة 5.2).
  4. نقل 10 سمكة إلى أنبوب 1.7 مل الطرد المركزي مع 1 مل من E3 والموت ببطء من خلال إضافة 200 ميكرولتر من 4 ملغ / مل تريكين (نهائي تركيز 800 ميكروغرام / مل) إلى أنبوب الطرد المركزي واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد شريحة زجاجية التصوير عن طريق وضع 4 قطرات من الشحوم فراغ في الساحة، 1 سم بعيدا على شريحة مجهرية (75 × 25 مم، الشكل 2).
  6. وضعت 2 قطرات من 2٪ LMA في وسط الساحة.
  7. ضع السمك واحد على شريحة زجاجية منفصلة تحت مجهر تشريح والتحقق من أن القلب قد توقف الضرب، وإزالة المياه الزائدة.
    8. استخدام ملاقط غرامة تشريح swimbladder من خلال الحفاظ على الرأس في وضع ثابت مع ملاقط اليسار وسحب أسفل القناة الهضمية الأمامي مع ملاقط الصحيحة (الشكل 4A).
  8. التقاط swimbladder من قبل القناة الهوائية مع ملاقط اليسار، فصله من الجهاز الهضمي، ووضعه في وسط LMA 2٪ قبل أن يتصلب.
  9. ضع غطاء الانزلاق (18 × 18 ملم) على أعلى من شريحة زجاجية التصوير ودفعها حتى يلمس الشحوم فراغ فضلا عن LMA (الشكل 2).
  10. صورة في غضون 10 دقيقة من تشريح كما هو موضح في الخطوة 6.4. كرر الخطوة 7،7-7،11 مع الأسماك الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حقن مكروي في swimbladder الخلفي

المنهج التجريبي المعروضة هنا يصف حقن جرعة ثابتة من C. خلايا الخميرة البيض في swimbladder من 4 DPF الزرد. العمل السابق مع نموذج الغمر تشير إلى أن الاستجابة المناعية للswimbladder C. البيض هو مماثل لالثدييات المخاطية المبيضات 32. نحن هنا لشرح طريقة العدوى المحورة التي هي أكثر وضوحا، استنساخه وسريعة. عدة مئات من الزرد يمكن حقن وفحص في غضون بضع ساعات....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السلف والقيود المفروضة على swimbladder حقن مكروي نموذج المرض

والنموذج المقدم هنا هو امتداد للنموذج الغمر المخاطية المبيضات وصفها في Gratacap وآخرون (2013)؛ وتضيف مزايا وقت الإصابة التي تسيطر عليها، وجرعة العدوى استنساخه للغاية، وبالتالي تحسين الكفاءة. علينا أن نظهر هنا أساليب جديدة تسمح الوثائق الزمنية غير الغازية للديناميات العدوى بقدر كبير من التفصيل، وكذلك دقة أعلى فيفو السابقين التصوير من swimb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر الدكتور لو ترينه والدكتور توبين لتوفير بسخاء-كاتينين α: خط الأسماك السترين وبيل جاكمان على إتاحة الفرصة لنا للقيام التصوير في مختبره. المؤلفون تقر مصادر التمويل المعاهد الوطنية للصحة (المنح 5P20RR016463، 8P20GM103423 وR15AI094406) ووزارة الزراعة الأميركية (مشروع # ME0-H-1-00517-13). يتم نشر هذه المخطوطة كما الزراعة الرئيسية وتجربة الغابات المنشور محطة رقم 3371.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 مل أنابيبAxygenMCT-175-C
أطباق بتري عميقةفيشر ساينتفيك89107-632
ماصات نقلفيشر ساينتفيك13-711-7M
مستخلص الخميرةVWR Scientific90000-726
الببتونVWR Scientific90000-264
سكر العنبفيشر ScientificD16-1
AgarVWR Scientific90000-760
ملاقط دقيقة (Dumont Dumoxel # 5)أدوات العلوم الدقيقة11251-30
مسامير خشبيةVWR Scientific10805-018
منخفضة الذوبان الاغاروزVWR Scientific12001-722
مجتذب الماصات الدقيقة البني المشتعلأدوات SutterP-97
البورسليكات الشعريةSutter InstrumentsBF120-69-10
MPPI-3الأجهزة العلمية التطبيقيةMPPI-3
وحدة الضغط الخلفيالأجهزة العلمية التطبيقيةالدقيقة BPU
الأجهزة العلمية التطبيقيةMPIP
مفتاح القدمتطبيقي علمي الأجهزة FSW
Micromanipulatorالأجهزة العلمية التطبيقيةMM33
القاعدة المغناطيسيةالأجهزة العلمية التطبيقيةالقاعدة المغناطيسية ثلاثي
الميثان سلفوناتشركة Western Chemical Inc.MS-222
تشريح المجهرأوليمبوسSZ61 أعلى SZX-ILLB2-100
قاعدة مجهر متحد البؤرأوليمبوسIX-81 مع FV-1000 نظام متحد البؤر للمسح بالليزر
Eppendorf 930001007
(16 × 150 مم)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4< / sub>VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
طين الأطفال (Play-Doh)Hasbro
CaCl2< / sub> FisherScientificC69-500
الميثيلين الأزرقVWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
أطباق بتريفيشر ScientificFB0875712
مقياس الدم ( Hausser العلميVWR Scientific15170-172
زيت الغمر من النوع Aمنتجات الرخام الأزرق51935
جهاز طرد مركزيEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agarose (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2< / sub>HPO4< / sub> فيشر ScientificS374-500
KH2< / sub>PO4< / sub> FisherScientificP285-500
سلك الصيدStren
96 لوحة تصوير البئر (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
الشحوم عالية الفراغ (داو كورنينج)VWR Scientific59344-055
شريحة صغيرة (25 × 75 مم)VWR Scientific48300-025
زلات غطاء (18 × 18 مم) ، رقم 1.5VWR Scientific48366-045
طبق بتري مقاس 15 سم (بلاستيك أوليمبوس)Genesee Scientific32-106
Glycerol (مواد كيميائية EMD)VWR ScientificEMGX0185-5
طبق ثقافة 24 بئر (بلاستيك أوليمبوس)Genesee Scientific25-107
قوارب الوزن (8.9 سم)VWR Scientific89106-766
أدوات طقم حامل الماصة 20X مجهر موضوعي أوليمبوس UPlanSApo 20x / 0.75 أسطوانة الأسطوانة نيو برونزويك Scientific TC-7 نصائح ماصة Microloader أنابيب ثقافة زجاجية )

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675(2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815(2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019(2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549(2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mucosal CandidiasisZebrafish ModelSwimbladder InjectionCandida AlbicansConfocal MicroscopyNeutrophil RecruitmentHost Pathogen InteractionFluorescent ProteinSwimbladder DissectionJuvenile Zebrafish

Related Articles