يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الطريقة الجراحية لفيروسي وساطة جين التسليم إلى الأذن الداخلية الماوس من خلال جولة النافذة غشاء

16.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52187

⸱

مارس 16, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of California, San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

يسمح النهج الجراحي التالي للأذن الموصوف بالتوصيل السريع والمباشر إلى قوقعة الأذن للفأر مع تقليل فقدان الدم ووفيات. يمكن استخدام هذه الطريقة للعلاج بالوقوقعة الصناعية باستخدام التوصيل الجزيئي والدوائي والفيروسي إلى فئران ما بعد الولادة من خلال غشاء النافذة المستديرة.

الملخص

العلاج الجيني، وتستخدم لتحقيق الانتعاش وظيفية من الصمم الحسي العصبي، وعود بمنح فهم أفضل للآليات الجزيئية والجينية الأساسية التي تساهم في فقدان السمع. ويجب أن يتم إدخال ناقلات في الأذن الداخلية بطريقة توزع على نطاق واسع وكيل في جميع أنحاء القوقعة مع التقليل من إصابة في الهياكل القائمة. توضح هذه المخطوطة نهج الجراحي بعد أذني التي يمكن استخدامها للماوس العلاج القوقعة باستخدام الجزيئية، الصيدله، والتسليم الفيروسي على الفئران يوم ما بعد الولادة 10 وكبار السن عبر النافذة غشاء الجولة (RWM). هذا النهج الجراحي يمكن التسليم السريع والمباشر إلى طبلة الأذن سكالا مع تقليل فقدان الدم وتجنب نفوق الحيوانات. هذه التقنية تنطوي على ضرر يذكر أو لا للهياكل الأساسية في الأذن الداخلية والوسطى وكذلك عضلات الرقبة بالكامل مع الحفاظ على السمع. للتدليل على فعالية هذه التقنية الجراحية، وglutam حويصليأكل نقل ستستخدم 3 خروج المغلوب (VGLUT3 KO) الفئران كمثال على نموذج الفأر من الصمم الخلقي أن يسترد السمع بعد الولادة من VGLUT3 إلى الأذن الداخلية باستخدام فيروس الغدة المرتبطة (AAV-1).

المقدمة

منذ فترة طويلة واقترح العلاج الجيني كعلاج محتمل لفقدان السمع الوراثية، ولكن ظلت النجاح في هذا المجال بعيد المنال 1. حتى الآن، وقد سادت منهجيات بوساطة فيروسي بسبب القدرة النظرية لاستهداف أنواع معينة من الخلايا داخل القوقعة التي يتعذر الوصول إليها نسبيا. وقد استخدمت كل من اتش (AV) وفيروس الغدة المرتبطة (AAV) لتوصيل الجينات القوقعة. AAVs هي مفيدة في القوقعة لعدد من الأسباب. وهي فيروسات النسخ ناقصة ويمكن نقل الجزيئات المعدلة وراثيا بكفاءة لأنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية، هدف هام لعدد من الأسباب المؤدية إلى فقدان السمع. وتوسطت دخول AAV في الخلية التي كتبها مستقبلات محددة 2. وبالتالي، يجب أن يكون اختيار النمط المصلي خاص متوافق مع أنواع الخلايا إلى أن transduced. يمكن AAVs بالنقل فعال خلايا الشعر (3) وتدرج في الجينوم المضيف، مما أدى إلى مستقر، والتعبير على المدى الطويل من هيئة تنظيم الاتصالاتnsgenic البروتين والتغير المظهري في الخلية 4. في حين لا فائدة بالضرورة لتطبيقات قصيرة الأجل مثل تجديد خلايا الشعر، والتعبير على المدى الطويل هو مهم جدا لإنقاذ مستقر من عيوب وراثية. لأن لا ترتبط AAVs مع أي مرض أو عدوى الإنسان وإظهار أي تسميم أذني 5،6،7، فهي مرشحا مثاليا للاستخدام في العلاج الجيني لأشكال الموروثة من فقدان 8 السمع.

وقد تمت دراسة نقل المادة الوراثية الخارجية إلى الأذن الداخلية الثدييات باستخدام ناقلات فيروسية خلال العقد الماضي، ويبرز بوصفه تقنية واعدة لعلاج أشكال كلا الوراثية والمكتسبة للخسارة 9 السمع. القوقعة يحتمل أن تكون هدفا مثاليا للعلاج بالجينات لعدة أسباب: 1) يتطلب حجمه صغير كمية محدودة من الفيروس الحاجة؛ 2) عزلتها النسبية عن غيرها من آثار حدود أجهزة الجسم الجانب. و3) غرف مملوءة بسائل في تسهيل الفيروسيةتسليم جميع أنحاء المتاهة 10، 11،12،13،14، 15.

نماذج الماوس من الصمم الخلقي تسمح لاستخدام العديد من أساليب الدراسة إلى رصد التنمية في الأذن الداخلية و بطريقة قابلة للتكرار منهجية. في حين أن صغر حجم الماوس القوقعة لا يقدم بعض الصعوبة الجراحية، ويعمل الماوس باعتبارها نموذجا هاما للغاية في دراسة فقدان السمع الوراثية، مع العديد من المزايا التجريبية على الأنواع الأخرى (16). نماذج الماوس تسمح بتقييم مجموعة من الخصائص من خلال التحليل الجيني الربط، وجمع من الملاحظات الشكلية مفصلة، ​​ومحاكاة سيناريوهات المسببة للأمراض. على هذا النحو، فهي مرشحة جيدة للعلاج بالجينات بوساطة فيروسي. جعلت الدراسات الجينية واسعة في الفئران جنبا إلى جنب مع التقدم التكنولوجي من الممكن لتوليد الفئران المعدلة وراثيا بطريقة استنساخه في المختبرات 17،18، 19، 20،21. Furthermorه، توجد العديد من النماذج على حد سواء المكتسبة والموروثة سماع الظواهر الخسارة في الفئران، مما يسمح للاختبارات صارمة في هذا النموذج الحيواني 22، 23،24. وهكذا، وتصحيح السمع باستخدام العلاج الجيني بوساطة فيروسي في نموذج الفأر هو خطوة أولى المناسبة في البحث عن علاج لمرض البشري.

لقد أظهرنا سابقا أن الفئران المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى نقل الغلوتامات حويصلي 3 (VGLUT3) يولدون الصم بسبب عدم الإفراج الغلوتامات في IHC الشريط المشبك 25. لأن هذه الطفرة لا يؤدي إلى انحطاط الأساسي للخلايا الشعر الحسية، هذه الفئران الطافرة يمكن أن تكون نموذجا ممتازا فيها لاختبار العلاج الجيني قوقعة لفقدان السمع الخلقية.

حتى الآن، وقد وصفت عدد من التقنيات تسليم الفيروسية للعلاج بالجينات القوقعة، بما في ذلك جولة نشر نافذة الغشاء، مستديرة حقن نافذة الغشاء، والتسليم عن طريق فغر القوقعة. هناك قويةمزايا وعيوب كل من هذه الأساليب 9 الاتحاد العالمي للتعليم.

نحن هنا الإبلاغ عن طريقة جراحية للتوسط فيروسي توصيل الجينات إلى الأذن الداخلية VGLUT3 KO الماوس من خلال النافذة غشاء الجولة (RWM). وبعد أذني طريقة الحقن RWM هو الغازية الحد الأدنى مع الحفاظ على جلسة ممتازة، وسريع نسبيا. كما نشرنا سابقا، في محاولة لاستعادة السمع في هذا النموذج الماوس، تم إدخال ناقلات AAV1 تحمل الجين VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) في القوقعة من هذه الفئران صماء في يوم ما بعد الولادة 12 (P! @)، مما أدى إلى استعادة السمع 26. السمع في الفئران VGLUT3 KO تم التحقق من استجابة الدماغ السمعية (ABR)، في حين تم التحقق من البروتين التحوير التعبير باستخدام المناعي (IF). وهكذا يوضح هذه المنهجية أن العلاج الجيني بوساطة فيروسي يمكن أن تصحح الخلل الجيني التي من شأنها أن يؤدي خلاف ذلك في الصمم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: جميع الإجراءات والحيوان معالجة ينسجم مع المبادئ التوجيهية الأخلاق NIH ومتطلبات البروتوكول وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو.

1. إعداد الحيوان للجراحة

  1. تنفيذ العمليات الجراحية في نظيفة، ومساحة مخصصة. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية، وتعقيم للتعقيم الزجاج حبة قبل الجراحة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدم يوم بعد الولادة 10-12 (P10-12) الفئران FVB. مختلف الأعمار وسلالات من الفئران يمكن استخدامها لتلبية احتياجات مشروع معين. الفئران الأكبر سنا من P40 يمكن أن يكون تحديا لأن العظام الفقاعة أكثر صعوبة.
  2. تخدير الفئران مع حقن داخل الصفاق من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين (100 ملغ / كلغ)، هيدروكلوريد زيلازين (10 ملغ / كلغ)، وآسيبرومازين (2 ملغ / كلغ). تبدأ التحضير الجراحي إلا بعد الحيوان لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة، مثل قرصة أخمص قدميه. اذا لزم الامرذ، إدارة جرعة معززة (خمس الجرعة الأصلية) من كوكتيل مخدر لاستعادة الطائرة مخدر الأصلية.
    ملاحظة: احرص على هذه الخطوة لأن معظم وفيات لوحظ في هذا العصر تسببها جرعة زائدة من مخدر.
  3. تغطية أعين الحيوان مع مرهم للعين وقائي للحفاظ على العينين رطبة أثناء التخدير، وقمع طرفة المنعكس الحيوان.
  4. ضع الماوس مع الرقبة امتدت على وسادة التدفئة في جميع أنحاء الإجراء حتى الفأر هو مستيقظا تماما، لمنع ما بعد التخدير، انخفاض حرارة الجسم.
  5. حلق منطقة ما بعد أذني اليسرى مع المقص وتعقيم مع الايثانول 70٪ وبوفيدون اليود قبل التلاعب الجراحي.

2. إجراء العمليات الجراحية والمتجهات حقن

  1. استخدام نهج ما بعد أذني لفضح الفقاعة الطبلية. شق النسيج تحت الجلد مع مقص صغير لفضح العضلات بعد أذني. بعد التراجع في الأنسجة الدهنية إلى thالبريد الجانب الخلفي من شق، فصل العضلات على الجانب الأيمن والأيسر عمودي على شق لفضح العظم الصدغي. تأكد من أن هذا الشق طويلة بما فيه الكفاية للعمل بشكل مريح مع التصور الملائم.
  2. خرم الفقاعة الطبلية مع 25 G إبرة وتوسيع ثقب عند الضرورة مع ملقط عن طريق تقشير العظم الخلفي للسماح بالوصول إلى بدوره القاعدية من القوقعة، ومن ثم توسيع بما فيه الكفاية لتصور الشريان الركابي والغشاء النافذة المستديرة (RWM) .
  3. ثقب RWM بلطف في وسط مع ماصة البورسليكات الشعرية. نلاحظ هروب رأس المال السائل من خلال RWM في هذه المرحلة. وهذا أمر طبيعي. انتظر حتى استقر هروب رأس المال (تجفف السائل effluxed من القوقعة مع ورق الترشيح العقيمة).
    ملاحظة: خذ الحيطة والحذر عند عقد ودفع الإبرة الزجاج بحيث ثقب RWM صغير بقدر الإمكان. اعتمادا على المجهر المستخدمة، عقد ماصات باستخدام لمياداة مجهرية أو باليد باستخدام ماصةحامل.
  4. إعداد ماصات للحقن باستخدام ماصة مجتذب يتم إعدادها بنفس الطريقة الماصات المشبك التصحيح. تأكد من أن قطر الحافة هو كبير (حوالي 15 ميكرون في القطر) بحيث pipetting لفيروس الدخول والخروج من السهل القيام به.
  5. وضع 1 إلى 2 ميكرولتر من AAV1-VGLUT3، AAV1-GFP أو AAV2-GFP إلى ماصة الحقن. بعد استقرار هروب رأس المال (من 5 إلى 10 دقيقة)، microinject هذا الحجم ثابت في طبلة الأذن سكالا خلال نفس الحفرة جعلت سابقا في RWM.
  6. ختم المتخصصة RW بسرعة بعد سحب ماصة مع المكونات صغيرة من العضلات وضمان الحصول عليها مع قطرة صغيرة من مادة لاصقة وضعت على الأنسجة العضلية لتجنب تسرب من النافذة المستديرة.
    ملاحظة: ختم هذا الثقب بشكل جيد للغاية بعد إزالة الإبرة مع المكونات صغيرة من العضلات لمنع أي تسرب اللمف المحيطي من القوقعة-هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على السمع. والفشل في التوصل تماما فإن RWM يؤدي إلى فقدان السمع مع مرور الوقت.
  7. بعد الحقن، تغطيةثقب في الفقاعة السمعية مع الأنسجة الدهنية، والعودة العضلات بعد أذني والأنسجة الدهنية إلى وضعها الطبيعي وخياطة الجرح في طبقات مع 6-0 أو أصغر خياطة الكروم للامتصاص.
  8. تطهير الجرح مع بوفيدون اليود.

3. بعد العملية الجراحية العناية

  1. وضع الفئران في قفص دافئ وليس تركهم دون مراقبة حتى تعافى تماما أنهم ثم نقلها مرة أخرى مع الأم. فمن المستحسن لإزالة الذكور من القفص قبل وضع الجراء مرة أخرى مع الأم.
  2. إدارة تحت الجلد كاربروفين (2 ملغ / كلغ) لتسكين الألم بعد العمل الجراحي وكل 24 ساعة بعد ذلك لمدة 3 أيام، لإدارة الالتهاب والألم. مراقبة الحيوانات يوميا بحثا عن علامات الضيق، وفقدان الوزن غير طبيعية، والألم، أو العدوى. عموما اليوم 3 الثالثة بعد الجراحة جميع الفئران يجب أن يتصرف بشكل طبيعي. في حالة ظهور أي علامات على الضيق أو المرض في الماوس بعد اليوم 3 الثالثة، والنظر في القتل الرحيم رانه الماوس وفقا لتوجيهات المؤسسية.

4. تقييم من وظيفة القوقعة بعد التسليم الفيروسي عن طريق الدماغ السمعية الاستجابة (ABR) تسجيلات

ملاحظة: استجابة الدماغ السمعية (ABR) هي أثار والسمعية إمكانات المستخرجة من النشاط الكهربائي المستمر في الدماغ وسجلت عن طريق أقطاب كهربية وضعت تحت فروة الرأس. يتم تحفيز الحيوان مع الصوت. ويتكون تسجيل الناتجة من خمس موجات التي تعكس النشاط الكهربائي من النقاط المتتالية في مسار السمعي في ميللي ثانية 10 الأولى بعد ظهور حافز السمعي.

  1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين وزيلازين هيدروكلوريد كما هو موضح في القسم 1.2 من هذا البروتوكول، باستثناء دون آسيبرومازين.
  2. ضع الماوس على وسادة التدفئة في جميع أنحاء اختبار السمع حتى الفأر هو مستيقظا تماما، لمنع ما بعد التخدير، انخفاض حرارة الجسم.
    ملاحظة: استخدمالمنبهات الصوتية التالية في هذه التجربة: اضغط (5 ميللي ثانية مدتها؛ 31 معدل العرض هرتز).
  3. وضع أقطاب كهربائية إبرة تحت الجلد في قمة الرأس، وتحت الصيوان من الأذن اليسرى (المرجع)، وتحت الأذن المقابل (الأرض) والبدء ABRs تسجيل كما هو موضح سابقا في غرفة عازلة للصوت 27،28. سجل الطول الموجي ABR في 5 فترات ديسيبل مستوى ضغط الصوت منخفضا من أقصى السعة.
  4. تحديد عتبات ABR بعد العمل الجراحي في أقرب وقت 4 أيام بعد الولادة الفيروسي
    يتم تعريف عتبة كمستوى أدنى التحفيز التي استجابة قمم للموجات I-V من الواضح والحاضر مرارا وتكرارا على الفحص البصري: ملاحظة.
  5. قياس الموجة I لتحليل النشاط من العصب القوقعي. يتم تعريف أدنى مستوى التحفيز التي تعطي ABR الموجي كشفها كما العتبة.

5. القوقعة التعبير التحوير البروتين عن طريق المناعي

  1. تخدير الفئران عن طريق جرعة زائدة من intrapحقن eritoneal من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين وزيلازين هيدروكلوريد النحو الموضح في القسم 1.2 من هذا البروتوكول، باستثناء دون آسيبرومازين.
  2. قطع رأس رئيس إلا بعد الحيوان لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة، مثل قرصة أخمص قدميه.
  3. تشريح للقوقعة بها وعملية لجبل لالجامع المناعي كما هو موضح 26. يوصف بروتوكول مفصل من قوقعة كله يشن المناعي باستخدام مكافحة VGLUT3 والأجسام المضادة 7A مكافحة الميوسين في عقيل وآخرون. 2013 29.
  4. لوضع العلامات GFP، احتضان قوقعة يتصاعد كلها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأرنب مكافحة GFP الأجسام المضادة في 1: 250 التخفيف.
  5. شطف القوقعة مرتين لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني ثم احتضان لمدة 2 ساعة في الماعز المضادة للأرنب مفتش مترافق إلى Cy2 المخفف 1: 4،000 في برنامج تلفزيوني.
  6. شطف القوقعي مع برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 10 دقيقة واحتضان لهم دابي لمدة 15 دقيقة.
  7. تركيب القوقعة على الشرائح الزجاجية ومراقبة اوندإيه المجهر مع المناعي متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتحقق من الخصائص التقنية وفائدة النهج بعد أذني لعلاج الجزيئي القوقعة، تم تسليم AAV1-VGLUT3، AAV1-GFP وAAV2-GFP في الفئران P10-12 الأذن الداخلية عن طريق RWM. هذا النهج يوضح الناجح التعبير التحوير في خلايا الشعر الداخلية (IHC) (VGLUT3 الشكل 1 و 2 و GFP الشكل GFP الشكل 3A)، وخلايا الشعر الخارجي (OHC) (GFP الشكل 2) والخلايا الداعمة (GFP الشكل 2 والشكل 3A) 26 دون جهاز كبير ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا العمل، نحن تصف بالتفصيل تقنية التي يمكن استخدامها للعلاج بالجينات القوقعة، وذلك بهدف استعادة أو إنقاذ وظيفة السمع العادية التي تتعرض للخطر من قبل خلل جيني. كما هو ارضحي عادة، وهذا النهج هو آمن لنقل الجين القوقعة أو العلاجات الجزيئية المحتملة الأخرى 30. وقد وصفت مناهج أخرى للعلاج القوقعة، بما في ذلك النهج بطني 24، 31،32 فغر القوقعة والكيس اللمفي الباطن تسليم 33 في الماوس وخنزير غينيا. في تجربتنا، ونهج ما بعد أذني هو أسرع وأسهل، ويرتبط مع انخف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

هذا العمل مدعوم بمنحة R21 من المعاهد الوطنية للصحة وبمنحة من Hearing Research، Incorporated.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كيتامينبتلر شاين
زيلازينAnaSed
Acepromazineمقدمة من UCSF LARC
كاربروفين مسكنات التسكينالمقدمة من UCSF LARC
بيتادينبيتادين بيورديو فارما
ديكساميثازون مرهم العين (TobraDex)Alcon
وسادة التدفئةBraintree Scientific ، Inc.
25G إبرةBD305127
ماصة شعرية من البورسليكاتأدوات الدقة العالمية ، بما في ذلك.1B100F-4
خياطة PDS * بالإضافة إلىالأنسجة المضاد للبكتيرياPDP149
(Vetcode) ButlerSchein31477
الأرانب المضادة للجسم المضاد ل GFPInvitrogenA11122
تشريح المجهر   ؛        LeicaMZ95
مشتعل / ماصة دقيقة بنية          Sutter Instrument Co
Puller موديل P-97 & nbsp ؛  
نظام TDT BioSig III                                تاكر ديفيس تكنولوجيز
غراء

المراجع

  1. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  2. Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
  3. Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
  4. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218(2012).
  5. Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
  6. Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
  7. Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
  8. Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
  9. Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
  10. Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
  11. Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
  12. Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  13. Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
  14. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  15. Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
  16. Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
  17. Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
  18. Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
  19. Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
  20. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  21. Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
  22. Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
  23. Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
  24. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
  25. Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
  26. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  27. Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
  28. Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
  29. Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
  30. Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  31. Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
  32. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  33. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  34. Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
  35. Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
  36. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  37. Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
  38. Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
  39. Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
  40. Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
  41. Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673(1998).
  42. Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
  43. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

VGLUT3
الطريقة الجراحية لفيروسي وساطة جين التسليم إلى الأذن الداخلية الماوس من خلال جولة النافذة غشاء
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.