يسمح النهج الجراحي التالي للأذن الموصوف بالتوصيل السريع والمباشر إلى قوقعة الأذن للفأر مع تقليل فقدان الدم ووفيات. يمكن استخدام هذه الطريقة للعلاج بالوقوقعة الصناعية باستخدام التوصيل الجزيئي والدوائي والفيروسي إلى فئران ما بعد الولادة من خلال غشاء النافذة المستديرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الطريقة الجراحية لفيروسي وساطة جين التسليم إلى الأذن الداخلية الماوس من خلال جولة النافذة غشاء
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العلاج الجيني، وتستخدم لتحقيق الانتعاش وظيفية من الصمم الحسي العصبي، وعود بمنح فهم أفضل للآليات الجزيئية والجينية الأساسية التي تساهم في فقدان السمع. ويجب أن يتم إدخال ناقلات في الأذن الداخلية بطريقة توزع على نطاق واسع وكيل في جميع أنحاء القوقعة مع التقليل من إصابة في الهياكل القائمة. توضح هذه المخطوطة نهج الجراحي بعد أذني التي يمكن استخدامها للماوس العلاج القوقعة باستخدام الجزيئية، الصيدله، والتسليم الفيروسي على الفئران يوم ما بعد الولادة 10 وكبار السن عبر النافذة غشاء الجولة (RWM). هذا النهج الجراحي يمكن التسليم السريع والمباشر إلى طبلة الأذن سكالا مع تقليل فقدان الدم وتجنب نفوق الحيوانات. هذه التقنية تنطوي على ضرر يذكر أو لا للهياكل الأساسية في الأذن الداخلية والوسطى وكذلك عضلات الرقبة بالكامل مع الحفاظ على السمع. للتدليل على فعالية هذه التقنية الجراحية، وglutam حويصليأكل نقل ستستخدم 3 خروج المغلوب (VGLUT3 KO) الفئران كمثال على نموذج الفأر من الصمم الخلقي أن يسترد السمع بعد الولادة من VGLUT3 إلى الأذن الداخلية باستخدام فيروس الغدة المرتبطة (AAV-1).
المقدمة
منذ فترة طويلة واقترح العلاج الجيني كعلاج محتمل لفقدان السمع الوراثية، ولكن ظلت النجاح في هذا المجال بعيد المنال 1. حتى الآن، وقد سادت منهجيات بوساطة فيروسي بسبب القدرة النظرية لاستهداف أنواع معينة من الخلايا داخل القوقعة التي يتعذر الوصول إليها نسبيا. وقد استخدمت كل من اتش (AV) وفيروس الغدة المرتبطة (AAV) لتوصيل الجينات القوقعة. AAVs هي مفيدة في القوقعة لعدد من الأسباب. وهي فيروسات النسخ ناقصة ويمكن نقل الجزيئات المعدلة وراثيا بكفاءة لأنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية، هدف هام لعدد من الأسباب المؤدية إلى فقدان السمع. وتوسطت دخول AAV في الخلية التي كتبها مستقبلات محددة 2. وبالتالي، يجب أن ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: جميع الإجراءات والحيوان معالجة ينسجم مع المبادئ التوجيهية الأخلاق NIH ومتطلبات البروتوكول وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو.
1. إعداد الحيوان للجراحة
- تنفيذ العمليات الجراحية في نظيفة، ومساحة مخصصة. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية، وتعقيم للتعقيم الزجاج حبة قبل الجراحة.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدم يوم بعد الولادة 10-12 (P10-12) الفئران FVB. مختلف الأعمار وسلالات من الفئران يمكن استخدامها لتلبية احتياجات مش....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
للتحقق من الخصائص التقنية وفائدة النهج بعد أذني لعلاج الجزيئي القوقعة، تم تسليم AAV1-VGLUT3، AAV1-GFP وAAV2-GFP في الفئران P10-12 الأذن الداخلية عن طريق RWM. هذا النهج يوضح الناجح التعبير التحوير في خلايا الشعر الداخلية (IHC) (VGLUT3 الشكل 1 و 2 و GFP الشكل GFP الشكل 3A)، وخلايا الشعر الخارجي (OHC) (GFP الشكل 2) والخلايا الداعمة (GFP الشكل 2 والشكل 3A) 26 دون جهاز كبير .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا العمل، نحن تصف بالتفصيل تقنية التي يمكن استخدامها للعلاج بالجينات القوقعة، وذلك بهدف استعادة أو إنقاذ وظيفة السمع العادية التي تتعرض للخطر من قبل خلل جيني. كما هو ارضحي عادة، وهذا النهج هو آمن لنقل الجين القوقعة أو العلاجات الجزيئية المحتملة الأخرى 30. وقد وصفت مناهج أخرى للعلاج القوقعة، بما في ذلك النهج بطني 24، 31،32 فغر القوقعة والكيس اللمفي الباطن تسليم 33 في الماوس وخنزير غينيا. في تجربتنا، ونهج ما بعد أذني هو أسرع وأسهل، ويرتبط مع انخف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
هذا العمل مدعوم بمنحة R21 من المعاهد الوطنية للصحة وبمنحة من Hearing Research، Incorporated.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كيتامين | بتلر شاين | ||
| زيلازين | AnaSed | ||
| Acepromazine | مقدمة من UCSF LARC | ||
| كاربروفين مسكنات التسكين | المقدمة من UCSF LARC | ||
| بيتادين | بيتادين بيورديو فارما | ||
| ديكساميثازون مرهم العين (TobraDex) | Alcon | ||
| وسادة التدفئة | Braintree Scientific ، Inc. | ||
| 25G إبرة | BD | 305127 | |
| ماصة شعرية من البورسليكات | أدوات الدقة العالمية ، بما في ذلك. | 1B100F-4 | |
| خياطة PDS * بالإضافة إلى | الأنسجة المضاد للبكتيريا | PDP149 | |
| (Vetcode) Butler | Schein | 31477 | |
| الأرانب المضادة للجسم المضاد ل GFP | Invitrogen | A11122 | |
| تشريح المجهر ؛ | Leica | MZ95 | |
| مشتعل / ماصة دقيقة بنية | Sutter Instrument Co | ||
| Puller موديل P-97 & nbsp ؛ | |||
| نظام TDT BioSig III | تاكر ديفيس تكنولوجيز |
المراجع
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
