يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

21.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52199

⸱

ديسمبر 23, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Centre for Structural and Functional Genomics, PERFORM Centre, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Structural and Functional Genomics, PERFORM Centre, Concordia University, 3Department of Exercise Science, Centre for Structural and Functional Genomics, PERFORM Centre, Concordia University

في هذه المقالة

ملخص

تلطيخ شيف الحمضي الدوري هو تقنية تصور محتوى السكريات في الأنسجة. توضح هذه المقالة بروتوكول تلطيخ شيف الحمضي الدوري الذي تم تكييفه للاستخدام في خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المنقاة من الدم الوريدي البشري. يتم إثراء هذه العينات للخلايا الليمفاوية وخلايا الدم البيضاء الأخرى في الجهاز المناعي.

الملخص

تلطيخ شيف الحمضي الدوري (PAS) هو تقنية كيميائية مناعية تستخدم في خزعات العضلات وكأداة تشخيصية لعينات الدم. السكريات مثل الجليكوجين والبروتينات السكرية والجليكوليبيدات تلطخ اللون الأرجواني اللامع مما يجعل من السهل تعداد الخلايا الموجبة والسالبة داخل الأنسجة. في خلايا العضلات ، يتم استخدام تلطيخ PAS لتحديد محتوى الجليكوجين في أنواع مختلفة من خلايا العضلات ، بينما في عينات خلايا الدم ، تم استكشاف تلطيخ PAS كأداة تشخيصية لمجموعة متنوعة من الحالات. يحتوي الدم على نسبة من خلايا الدم البيضاء التي تنتمي إلى جهاز المناعة. لم يتم استكشاف فكرة أن خلايا الجهاز المناعي تمتلك الجليكوجين وتستخدمه كمصدر للطاقة على نطاق واسع. هنا ، نصف نسخة معدلة من بروتوكول تلطيخ PAS الذي يمكن تطبيقه على الخلايا المناعية أحادية النواة للدم المحيطي من الدم الوريدي البشري. لوحظت خلايا صغيرة ذات حبيبات إيجابية PAS وخلايا أكبر مع تلطيخ PAS المنتشر. معالجة العينات بالأميليز تلغي هذه الأنماط ، مما يؤكد خصوصية البقعة. أكدت تقنية بديلة تعتمد على الهضم الأنزيمي وجود وكمية الجليكوجين في العينات. هذا البروتوكول مفيد لأطباء الدم أو علماء المناعة الذين يدرسون محتوى السكريات في الخلايا الليمفاوية المشتقة من الدم.

المقدمة

حمض الدوري شيف (PAS) تلطيخ هو أسلوب المناعى التي يتم استخدامها على نطاق واسع في مجال البحوث العضلات والتشخيص. ويستخدم أيضا كأداة تشخيصية على عينات الدم. هذه التقنية تعمل من خلال تطبيق محلول حمض الدوري للعينة، والذي يتأكسد وحدات داخل السكاريد إنشاء مجموعات ألدهيد التي تتفاعل مع كاشف وعديم اللون شيف وبالتالي إنتاج منتج أرجواني عميق. وتظهر الخطوات من هذا الإجراء في الشكل 1. وصمة عار تتحول أي شيء مع السكريات أرجواني، بما في ذلك الجليكوجين، البروتينات السكرية، السكرية، mucins، أو جزيئات أخرى مع الأنصاف السكاريد.

وكثيرا ما يستخدم تلطيخ PAS لقياس مستويات الجليكوجين في الألياف العضلية. أقسام الأنسجة العضلات هي مثالية للتقنية كما نعلق بحزم إلى الشريحة وتحمل متعددة الغسيل وتلطيخ الخطوات. الجليكوجين هو الأكثر حضورا في نشل سريع من النوع الثاني ألياف العضلات، والتي تعاني من ارتفاع الطلبلإنتاج ATP السريع تتطلب الجليكوجين لأقصى قدر من الأداء 1،2. الجليكوجين هو بوليمر أفرع الجلوكوز التي يمكن تقسيمها إلى الجلوكوز مجانا من خلال عمل انزيمات الجليكوجين فسفوريلاز. في أوقات الراحة والتغذية الاكتفاء، وتجديد الجليكوجين خلال عملية تكون الغليكوجين، بينما في أوقات التغذية قصور أو ذات الطاقة العالية الطلب. يتم تقسيم الجليكوجين إلى جلوكوز عن طريق تحلل الغليكوجين. في وقت مبكر من واستكشفت عام 1950 العلماء الطبيب تلطيخ PAS على عينات الدم لتحليل المحتوى الجليكوجين في الأمراض المختلفة 3-7. على سبيل المثال، في بومب مرض تخزين الجليكوجين المخلصين خلايا الدم البيضاء بأمراض تتراكم كميات كبيرة من الجليكوجين الذي يختلف كثيرا عن الاصحاء 8.

توضح هذه المقالة الفيديو-نسخة معدلة من PAS تلطيخ للاستخدام على خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) عينات من الدم الوريدي من الموضوعات البشرية السليمة. PBMCS احتواء معظمها الخلايا الليمفاوية من الخلايا اللمفاوية T و B الأسر الخلايا اللمفاوية، وكذلك الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا القاتلة الطبيعية وحيدات. الخطوة الأولى تنقية يزيل الكريات الحمراء، العدلات، والمحببة الأخرى. توفر هذه التقنية البيانات على نسبة مركزة من الخلايا الليمفاوية مما يسمح للتعداد أكثر قوة من خلايا PAS إيجابي مقارنة باستخدام مسحات الدم الكامل.

figure-introduction-1
الشكل 1: خطوة منهجية خطوة من PAS تلطيخ على PBMC (A) أولا، ويتحقق عزل PBMC من خلال ficoll الانحدار، وتظهر اللوحة اليسرى إعداد قبل الطرد المركزي، وتظهر اللوحة اليمنى بعد الطرد المركزي حيث معطف الشهباء التي تحتوي على PBMC لوحظ في وسط الأنبوب. ثابتة (B) PBMCs المعزولة على الشريحة باستخدام الفورمالين الإيثانول المحاليل تثبيتينشوئها. يتم شطف الشريحة بلطف بالماء المقطر من زجاجة غسل البلاستيكية. ثم يتم وضع (C) الشريحة في 100 مل دورق منتصف الطريق مليئة حل الأميليز، والتي سوف تذوب الجليكوجين. وتشطف الشريحة بلطف. يتم التعامل مع (D) الشريحة بمحلول حامض الدوري، حيث أكسدة ساتشاريديس تأخذ مكان. يتم شطف بلطف الشرائح. هذا سوف إزالة حمض الدوري الزائد ووقف الخطوة الأكسدة. (E) عند إضافة كاشف شيف على الشرائح، وسوف تتفاعل مع الألدهيدات إنشاؤها أثناء الخطوة الأكسدة. وهذا كاشف عديم اللون ثم يؤدي إلى منتج أرجواني أحمر عميق. وتشطف الشرائح برفق لإزالة شيف كاشف الزائد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتمت الموافقة بحث مع عينات الدم البشري من جامعة كونكورديا أخلاقيات مراجعة المجلس، وشهادة عدد 10000618. العمل على العضلات الماوس وافقت عليه جامعة كونكورديا أخلاقيات مراجعة المجلس وعدد شهادة 2010BERG.

1. PBMC العزلة من الدم الكامل

ملاحظة: إجراء هذا الإجراء في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام تقنية معقمة وأجهزة تعقيم الشركة المصنعة.

  1. صب بعناية 10-15 مل من الدم الكامل من heparinized أنابيب (مكافحة تجلط الدم) جمع الدم إلى 50 مل العقيمة أنبوب مخروطي. لانسكاب الدم طفيفة، يمسح بقطعة ده 2 O و 70٪ ETOH باستخدام الأنسجة التنظيف.
  2. تمييع الدم في أنبوب مخروطي لنسبة 1: 1 مع الفوسفات عازلة المالحة (PBS 1X) ودرجة الحموضة 7.4. ضمان أن الحد الأقصى لإجمالي حجم لا يتجاوز 30 مل.
  3. المزيج بلطف باستخدام بندقية ماصة المصلية تجنب الفقاعات.
    ملاحظة: لا تخلط بواسطة قلب الأنبوب لتجنب دمccumulation في الحد الأقصى وتسرب لاحقا خلال الطرد المركزي.
  4. إضافة 13 مل من Ficoll-paque (انظر المواد والجدول المعدات)، إلى 50 مل قدرة جديد أنبوب مخروطي. الحفاظ على أنبوب تستقيم في رف.
  5. باستخدام ماصة نقل، واتخاذ الدم المخفف، المس طرف ماصة نقل إلى الجدار الداخلي للأنبوب بالقرب من أعلى. مع ضغط بطيء وثابت، ونقل الدم على طول الجدار الداخلي للأنبوب تشكيل طبقة الدم على أعلى طبقة السكروز. هل هذه الخطوة عدة مرات حتى تم تحويل كل الدم.
  6. غطاء الأنبوب بإحكام وأجهزة الطرد المركزي أنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في 700 x ج في الدوار سوينغ مع متوسط ​​مجموعة تسارع إلى 5، والتباطؤ تعيين إلى ZERO.
  7. اتخاذ ببطء الأنبوب ودون إزعاج طبقات، إعادته إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
  8. جمع بعناية معطف الشهباء (رقيقة طبقة بيضاء غائم)، حيث توجد PBMCs، وضعت بين PBS / البلازماالثانية طبقات ficoll باستخدام ماصة نقل. تجنب جمع طبقة السكروز وعدم الإزعاج طبقة خلايا الدم الحمراء.
  9. نقل معطف الشهباء إلى 50 مل جديد العقيمة أنبوب مخروطي. قد يستغرق عدة مرات من تكرار الخطوة 1.8 لجمع كل PBMC.
  10. إضافة PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 إلى أنبوب مع PBMC وملء ما يصل الى علامة 45 مل. هز أنبوب دقيق. لا الدوامة.
  11. غسل 1: أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 480 x ج مع كل من أقصى تسارع وتباطؤ المنصوص إلى 9. لاحظ تشكيل بيليه من PBMCs في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي الشكل.
  12. تجاهل PBS (طاف) في كوب من البلاستيك مع 10 مل من التبييض.
  13. تخفيف بيليه الخلية عن طريق بلطف "الاجهاد" ضد سطح بتموجات (أي رف فارغ). لا الدوامة.
  14. إضافة 25 مل من الطازجة PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 إلى الأنبوب. إذا كان يتم تجهيزها أنبوب أكثر من واحد، تجمع الكريات معا في هذه الخطوة.
  15. غسل 2: أجهزة الطرد المركزي في أنبوب لمدة 12 دقيقة في 480 x ج وايث كلا أقصى التسارع والتباطؤ المتوقع أن 9.
  16. تجاهل PBS (طاف) في كوب من البلاستيك مع هذا النبأ من التبييض.
  17. بلطف "رف" ضد سطح بتموجات (أي رف فارغ). لا الدوامة.
  18. إضافة 25 مل من برنامج تلفزيوني جديد للأنبوب.
    1. إخراج 50 ميكرولتر من الخلايا ونقل إلى أنبوب microcentrifuge لعدد قدرتها على البقاء.
    2. إضافة مبلغ مساو (50 ميكرولتر) من اللون الأزرق التريبان (وصمة عار الجدوى)، وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج بلطف.
  19. إخراج 10 ميكرولتر وتحويلها إلى عدادة الكريات للتحقق من جدوى خلايا لكل مل. تسجيل عدد من خلية / مل.
  20. إخراج المبلغ المطلوب من الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب لمدة 12 دقيقة في 480 x ج مع كل من أقصى تسارع وتباطؤ المقرر أن 9.
  21. تجاهل PBS (طاف) في دورق مع التبييض.
  22. بلطف "رف" ضد سطح بتموجات (أي رف فارغ). إضافة 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب.

2. جعل الشريحة PBMC

  1. ضع 80 ميكرولتر من الخلايا على شريحة المجهر. تشويه انخفاض بمساعدة شريحة أخرى أو مكان 2 قطرات من 40 ميكرولتر كل على طرفي الشريحة.
  2. ترك الشريحة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لتجف. تسمية الشريحة مع قلم رصاص على الجانب بلوري.

3. تحديد عينات على الشرائح

  1. إعداد الحل تثبيتي عن طريق خلط 0.5 مل من 37٪ إلى 4.5 مل الفورمالديهايد من 99٪ من الإيثانول.
  2. بعد يتم تجفيفها الشرائح، واخراج 2 مل من محلول تثبيتي تقدم طازجة وسكبه على الشريحة بحيث يتم تغطية كامل سطح الشريحة.
  3. ترك الحل على الشريحة لمدة 1 دقيقة. شطف الشريحة لمدة 1 دقيقة بماء الصنبور وتركه في الهواء الجاف.

4. جعل الحل الأميليز للسيطرة سلبية

  1. خذ 0.25 غرام من مسحوق الأميليز وتذوب في 50 مل من ديالمياه هدأ. صب الحل في نظيفة 100 مل دورق.
  2. تزج الشريحة في الدورق حتى أن نصف الشريحة يتلقى العلاج ويبقى النصف الآخر غير المعالجة ومن ثم احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1C).
  3. تقديم مذكرة على أي جانب من الشريحة يتلقى العلاج الأميليز. رسم خط على الجزء الخلفي من الشريحة يدل على الحدود بين العلاج والسيطرة.
  4. تغسل الشرائح مع DDH 2 O لإزالة الحل الأميليز وترك الشريحة الهواء الجاف.

5. تنفيذ حمض الدوري شيف (PAS) تلطيخ والتصوير

ملاحظة: الكواشف PAS سامة عن طريق الإستنشاق وهي تآكل، لذلك تحتاج إلى خطوات ينبغي القيام به في غطاء الدخان الكيميائية، والمنتجات النفايات يجب التخلص منها بطريقة صحيحة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

  1. ضع الشريحة على سطح مستو وتصب 1،50-2،00 مل من حمض الدوري الحل على العينة. Incubaالشركة المصرية للاتصالات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. شطف الشرائح في عدة تهم من الماء المقطر.
  3. صب 1،50-2،00 مل من كاشف شيف على الشريحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  4. غسل الشريحة مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق وتترك في الهواء الجاف.
  5. تطبيق 10 ميكرولتر وسائل الاعلام المتزايدة على الشريحة، وتغطي مع اثنين من coverslips صغيرة، أو تطبيق 50 ميكرولتر واستخدام واحدة ساترة كبيرة.
  6. تطبيق طلاء الأظافر واضحة على حواف ساترة، والسماح ليلة وضحاها الجاف.

6. الحصول على الصور مع مجهر الضوء باستخدام المجهر 100X الهدف

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتحقق من صحة الكواشف والتقنية الأساسية، تم إجراء PAS تلطيخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة على أقسام عضلة النعلية الماوس. وقد تم تلطيخ نفس يوم التضحية وفي الخطوة الأخيرة من تلطيخ، كانت ثابتة الأجزاء التي كتبها زيلين. ومن المعروف أن العضلات النعلية لاحتواء ~ 35٪-الجليكوجين إيجابي خلايا 9. خلايا العضلات ملطخة عرض متميزتين حبيبات منقط features--PAS إيجابي داخل الخلية، وخط متواصل demarking غشاء الخلية (الشكل 2A). وجود حبيبات منقط يتسق مع مخازن الجليكوجين، وكا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كانت الخطوات الحاسمة من هذه المقالة الفيديو أثناء الغسيل والأميليز علاج الخلايا. في حين غسل الشرائح، وخطوة رئيسية كانت تستخدم زجاجة غسل للعصر البلاستيكية والسماح الماء تشغيل بلطف من خلال العينة على الشريحة ولا تستهدف مباشرة على العينات. سيكون حتى أدنى ضغط المياه المباشر يسبب الخلايا للخروج من الملعب الشريحة. وكانت خطوة رئيسية أخرى لاستخدام نفس شريحة ل± الظروف الأميليز. بعد أن تم التقيد PBMCs إلى الشريحة، وضعت الشريحة بعناية في دورق ذلك تعرضت نصف فقط من تشويه في حل الأميليز. توفر ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث بمنحة من برنامج NSERC Discovery رقم منحة RGPIN 418522-2013. نشكر R. Kilgour على المناقشات المفيدة ، ونشكر Katelin Gresty و Dr. A. Berghdal على توفير أقسام عضلات الفأر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم Periodic Acid Shifffigure-materials-1 Sigma-Aldrich395Bيُترك ليصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. المواد الموجودة في هذا الطقم سامة وضارة، لذا يجب توخي الحذر.
α-Amylase مستخلص من بنكرياس الخنزيرfigure-materials-2 Sigma-AldrichA3176
مجهر ثنائي العينينCarl Zeiss MicroscopyAxio Lab A0
طقم تحليل Glycogenfigure-materials-3 Sigma-AldrichMAK016
Ficoll-Paque PLUSfigure-materials-4 VWR, GE Healthcare17-1440-02بوليمر اصطناعي غير أيوني من السكروز.
جهاز طرد مركزياستُخدمت الدلاء المتأرجحة لعزل PBMC.

المراجع

  1. Rich, P. R. The molecular machinery of keilin's respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
  2. Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits). Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).
  3. Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. Lymphocyte glycogen content in various disease. J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).
  4. Scott, R. B. Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro. J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).
  5. Fedele, D., et al. positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus. Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).
  6. Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).
  7. Yunis, A. A., Arimura, G. K. Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes. Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).
  8. Hagemans, M. L., et al. PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease. J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).
  9. Totsuka, Y., et al. Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains. 95 (2), 720-727 (2003).
  10. Murat, J. C., Serfaty, A. Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues. Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).
  11. Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation. J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).
  12. Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. Biochemical titration of glycogen in vitro. J.Vis.Exp. (81), (2013).
  13. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes. Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).
  14. Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. Evidence for the presence of glycogen in rat thymus. Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).
  15. Darlington, P. J., et al. Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation. Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).
  16. Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: http://www.atlasofms.org (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.