اشتقاق كفاءة خلايا الظهارة الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية

ملخص

يمكن استخدام

خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) المشتقة من الخلايا الجذعية لتطبيقات متعددة بما في ذلك العلاجات القائمة على الخلايا لتنكس الشبكية ونمذجة الأمراض ودراسات الأدوية. نقدم هنا بروتوكولا بسيطا لاشتقاق RPE بشكل متكرر من الخلايا الجذعية.

الملخص

لم يتم اكتشاف أي علاج للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو السبب الرئيسي لفقدان البصر لدى الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 55 عاما. AMD هو مرض معقد متعدد العوامل له مسببات غير معروفة ، على الرغم من أنه يعتقد إلى حد كبير أنه يحدث بسبب الموت أو الخلل الوظيفي في ظهارة صبغة الشبكية (RPE) ، وهي طبقة أحادية من الخلايا تكمن وراء شبكية العين وتوفر دعما مهما للمستقبلات الضوئية. قد تحمل استراتيجيات استبدال خلايا RPE وعدا كبيرا لتوفير الإغاثة العلاجية لمجموعة فرعية كبيرة من مرضى AMD ، وقد تم إنشاء خلايا RPE التي تشبه إلى حد كبير الخلايا البشرية الأولية (hRPE) في العديد من المختبرات المستقلة ، بما في ذلك مختبراتنا. بالإضافة إلى ذلك ، لا تقتصر استخدامات iPS-RPE على العلاجات القائمة على الخلايا ، ولكن تم استخدامها أيضا لنمذجة أمراض RPE. قد لا توضح هذه الأنواع من الدراسات القواعد الجزيئية للأمراض فحسب ، بل قد تعمل أيضا كأدوات لا تقدر بثمن لتطوير واختبار أدوية جديدة. نقدم هنا بروتوكولا محسنا للتمايز الموجه ل RPE من الخلايا الجذعية. إن إضافة النيكوتيناميد وإما Activin A أو IDE-1 ، وهو جزيء صغير يحاكي آثاره ، في نقاط زمنية محددة ، يعزز بشكل كبير إنتاجية خلايا RPE. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا اشتقاق أعداد كبيرة من RPE منخفض المرور في وقت مبكر يصل إلى ثلاثة أشهر.

المقدمة

يتم تنظيم أنواع الخلايا المختلفة التي تشغل شبكية العين في بنية وظيفية. المستقبلات الضوئية في الجزء الخلفي من شبكية العين مسؤولة عن تحويل الضوء إلى نبضات كهربائية من خلال التنبيغ الضوئي. ومع ذلك ، لا يمكن أن يحدث التنبيغ الضوئي بدون الجهود المنسقة لأنواع الخلايا المجاورة الأخرى بما في ذلك خلايا Mueller الدبقية وظهارة صبغة الشبكية (RPE). طبقة أحادية من خلايا RPE تقسم الشبكية الحسية عن المشيمة الشعرية ، وهي إمدادات الدم الأساسية للمستقبلات الضوئية ، وهي في موقع مثالي للتحكم في وظائف متعددة مهمة لتوازن المستقبلات الضوئية. في الواقع ، تعتمد RPE والمستقبلات الضوئية على بعضها البعض لدرجة أنها تعتبر على نطاق واسع وحدة وظيفية واحدة. (لمراجعة جميع الوظائف المتنوعة ل RPE ، انظر Strauss، 2005¹.) يمكن أن يؤدي موت أو خلل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية إلى التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو السبب الرئيسي لفقدان البصر الدائم في البلدان الصناعية^2-4.

AMD هو مرض متعدد العوامل يصيب RPE والمستقبلات الضوئية والأوعية الدموية المشيمية ؛ عوامل الخطر متنوعة وتشمل مجموعات من التأثيرات البيئية والجينية^5،6. علاجات AMD محدودة للغاية ، ولكن أحد العلاجات المحتملة الواعدة هو استبدال خلايا RPE^7،8. في حين أن النتائج كانت مختلطة ، فإن زرع خلايا RPE في مرضى AMD (وفي المرضى الآخرين الذين يعانون من تنكس الشبكية) وأيضا في نماذج القوارض من تنكس الشبكية ، لديه القدرة على منع ضمور مستقبلات الضوء بشكل عابر^9-23. (النموذج الحيواني المستخدم بشكل شائع في هذه الدراسات هو فئران الكلية الملكية للجراحين (RCS) ، والتي تؤوي طفرة في جين MerTK. هذه الطفرة تجعل خلايا RPE غير قادرة على البلعمة للأجزاء الخارجية المستقبلة للضوء وتعزز تنكس الشبكية²⁴.) في حين أن معدلات البقاء على قيد الحياة المبلغ عنها ل RPE المزروعة في الفضاء تحت الشبكية للفئران والفئران RCS تختلف اختلافا كبيرا ، إلا أن هناك إمكانية للبقاء على قيد الحياة لعدة أشهر أو سنوات^{9،10،12،20}.

يمكن الحصول على خلايا

RPE بأعداد كافية للزرع عن طريق اشتقاقها من الخلايا الجذعية متعددة القدرات^9-14،25-28. أثبتت العديد من المجموعات المستقلة أن هذه الخلايا تعمل بطرق مماثلة لنظيراتها الجسدية ، وتشير الدراسات طويلة المدى إلى أنها آمنة عند زرعها في نماذج أمراض الفئران^{والفئران 9،10،12،14،19،20،25،29-32}. قد يكون استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات بدلا من الخلايا الجذعية الجنينية مفيدا حيث يمكن تجنب القضايا الأخلاقية والتحديات المناعية المرتبطة ب RPE الخيفي^33،34. تطبيق آخر مثير لتقنية iPS هو نمذجة الأمراض³⁵. يمكن أن تكون القدرة على استجواب أعداد كبيرة من خلايا RPE المشتقة من المرضى الذين يعانون من أمراض RPE لا تقدر بثمن لفهم قواعدهم الجزيئية. تم إجراء هذا النوع من الدراسة مؤخرا باستخدام Best disease مريض RPE ويمكن أن يمهد الطريق لدراسات مماثلة لاعتلال البقعة الموروثة³⁶.

اشتقاق RPE من الخلايا الجذعية هو عملية بسيطة نسبيا ويمكن إجراؤها بالكامل في ظروف خالية من xeno. أبسط استراتيجية هي اشتقاق طبقات أحادية من خلايا RPE تلقائيا ، ومع ذلك ، يمكن تحسين العائد بشكل كبير باستخدام تقنيات التمايز الموجهة. لكن هذه التقنيات تنطوي على استخدام عوامل بروتينية خارجية يمكن أن تكون باهظة الثمن وغالبا ما تتولد في البكتيريا أو المصادر الأخرى غير البشرية^10،12،37. في دراساتنا ، اتبعنا بروتوكولا^{راسخا 10} يستخدم النيكوتيناميد و Activin A ، وهو عامل إشارة ثبت أنه كاف لمواصفات RPE³⁸. سنوضح هنا أن الجزيء الصغير IDE-1 يمكن أن يحل محل Activin A بشكل كاف ، وبالتالي تقليل التكاليف وتخفيف المخاوف المرتبطة باستخدام البروتينات المؤتلفة³⁹. بالإضافة إلى ذلك ، نستخدم بدائل المصل الخالي من xeno ، ونقوم بزراعة خلايا RPE المتمايزة على ركيزة اصطناعية خالية من xeno. لقد ثبت سابقا أن خلايا RPE تتمايز بشكل فعال للغاية باستخدام هذا^{النهج 40}.

عندما يتم تمييزها كطبقة أحادية ، نتخيل مستعمرات مصطبغة تحتوي على خلايا RPE بعد خمسة أسابيع¹². بمجرد وصولها إلى الحجم الكافي ، يمكن استئصالها يدويا ونقلها إلى طبق آخر للتوسيع. تشتهر خلايا RPE بعدم التمايز مع كل مقطع ، ويجب تجنب استخدام أي شيء أقدم من خمسة مقاطع (نجد أنه يمكن بسهولة إنشاء أعداد كافية من الخلايا للتوصيف والزرع في النماذج الحيوانية بعد ممرين أو ثلاثة مقطع). بمجرد التمايز الكامل ، نستخدم تقنيات متعددة لتوصيف الخلايا تشريحيا ووظيفيا للتأكد من أنها ستكون بمثابة بدائل مناسبة ل RPE المريضة. وصف هذه التقنيات ، وبروتوكول زرع iPS-RPE في الفضاء تحت الشبكية للقوارض ، خارج نطاق ورقة الطرق هذه وقد تم نشرها سابقا^12،32،41.

< p class = 'jove_content'> في حين أن تطوير بروتوكولات موحدة للاشتقاق الفعال ل iPS-RPE مهم بشكل واضح للعيادات ، إلا أن هناك أيضا عملا كبيرا قبل السريري لا يزال يتعين القيام به في النماذج الحيوانية. هناك مخاوف بشأن مناعة الخلايا المشتقة من iPS ، ويتم استكشاف العديد من تقنيات الزرع المختلفة ، بما في ذلك زرع الخلايا على ركائز اصطناعية^{، 42،43}. لهذه الأسباب ، نشعر أن نشر البروتوكولات الموحدة مفيد لتسهيل كل من الدراسات السريرية وما قبل السريرية. خاصة إذا تم إجراء مقارنات مباشرة لخلايا iPS-RPE المشتقة في مختبرات مختلفة من قبل مجموعات بحثية مختلفة.

البروتوكول

1. إخراج تمايز الخلايا الجذعية المشتقة من خلية RPE

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات حضانة بها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂

1. الحفاظ على حس أو الوركين خطوط (إطعام يوميا) في وسائل الإعلام الصيانة (MM، الجدول 1). مرة واحدة وقد وصلت خطوط معايير كافية من مراقبة الجودة، والمحافظة عليها على طبقة من الفأر الجنينية الخلايا المغذية (MEFS) المصنف في مناطق ذات كثافة من 250،000 / بئر من لوحة جيدا ستة. ويمكن أيضا أن تتولد الثقافات خالية من كره بعد بروتوكول التي وضعتها تاكر وآخرون. ^40.
2. السماح للمستعمرات الخلايا الجذعية للوصول إلى confluency.
3. التحول إلى وسائل الإعلام التمايز مع نيكوتيناميد (DM / NIC، الجدول 1)؛ تغذية يوميا.
4. بعد ثلاثة أسابيع في الثقافة، والتحول إلى وسائل الإعلام التمايز مع نيكوتيناميد وإما Activin-A أو IDE-1 (DM / NIC / AA أو DM / NIC / IDE1، الجدول 1) لتعزيز RPE التمايز.
5. بعد خمسة أسابيع في الثقافة، والتبديل إلى DM / NIC. الوجبات اليومية لم تعد ضرورية مرة واحدة المؤشرات درجة الحموضة في توقف وسائل الإعلام تحول الأصفر اليوم بعد الرضاعة.
6. انتظر الجزر الخلايا الصباغية للمثول التي تكون كبيرة بما يكفي لخفض وإزالة (انظر الشكلين 2D-F و3A).

2. عزل الصباغي الفشوت

1. معطف الآبار من 24 لوحة جيدا مع مصفوفة الذي يحاكي البيئة الطبيعية خلية (خالية من كره هو الأفضل).
   ملاحظة: شفرات القرنية وحادة، ملقط غرامة ذات الرؤوس هي مفيدة جدا للاختيار. ورقة كاملة من خلايا متمايزة يمكن فصل بينما نقطف. تجنب ذلك من خلال العمل بعناية والبداية اختيار المستعمرات في وسط الطبق.
2. شغل العديد من الآبار من لوحة 24-جيدا مع وسائل الإعلام التمايز (DM، الجدول 1) حسب الحاجة. هذا القرار سيعتمد على عدد من المستعمرات المصطبغةالتي تم جمعها.
3. في غطاء ثقافة الخلية مع نطاق تشريح، وقطع يدويا من الجزر المصطبغة. تقطيع كل جزيرة في الجزء السفلي من لوحة أصلية باستخدام مشرط في حوالي 2-6 قطع والاستيلاء على أجزاء مصطبغة مع ملقط حادة.
4. نقل 1-2 قطعة المصطبغة في كل 24 عاما أيضا.
5. لا تغيير وسائل الاعلام لمدة 3-5 أيام حتى خلايا تلتزم، ثم البدء في تغيير وسائل الإعلام ثلاث مرات في الأسبوع. (اذا لم تلتزم بعد هذا الوقت، واحتمال جيد بأنهم سوف أبدا).
6. توسيع الخلايا لمدة 3-4 أسابيع في وسائل الإعلام التمايز (DM، الجدول 1) - يتم عرض صورة للثقافة نموذجية في الشكل 3B. الخلايا قد لا يزال غير ملء البئر كله ولكن الانتظار لفترة أطول لا يبدو للمساعدة. تغذية خلايا ثلاث مرات في الأسبوع.
7. بعد حوالي 3 أسابيع، يدويا إزالة مجموعات من الخلايا البيضاء في كتل إذا لزم الأمر مع ملقط حادة. لا تفعل هذه الخطوة إلا عند الضرورة - فمن السهل أن إدخال الملوثات. وهو مثالي لمحاولة للحصول على أنقى سكان RPE من المستعمرات المصطبغة الأصلية في الخطوة 1.6.

3. الركض الخلايا الجذعية المستمدة RPE

1. فصل الخلايا مع 200 ميكرولتر مع الحل تفارق الخلية (ويفضل أن لا التربسين-كاشف التي يمكن المعطل من خلال التخفيف هو الأفضل) لمدة 5-8 دقائق عند 37 درجة مئوية، وتعطيل من قبل تمييع مع DM. استخدام ماصة 200 ميكرولتر ليغسل كل الخلايا ول resuspend لهم (إذا كان اختيار جيد يحتوي سوى عدد قليل من الخلايا، والنظر في تجميع الخلايا من اثنين من 24 بئرا).
2. الطرد المركزي (800 x ج لمدة 5 دقائق)، ونبذ طاف، و resuspend في 3 مل سائل الإعلام DM.
3. خلايا إعادة لوحة من واحد (أو اثنين) 24 آبار في مصفوفة واحدة المغلفة 6 جيدا في 3 مل من DM لكل بئر (1: 5 التوسع).
4. توسيع لمدة 1-2 أسابيع حتى كانت الخلايا ~ 90٪ متموجة. ويظهر صورة لثقافة نقية متباينة تماما في الشكل 3C.
5. فصل الخلايا مع 1 مل خلية دحل issociation لمدة 5-8 دقائق عند 37 درجة مئوية، على تعطيل من قبل التخفيف مع DM، استخدم 1،000 ماصة ميكرولتر ليغسل كل الخلايا، و resuspend لهم.
6. تدور باستمرار (800 x ج لمدة 5 دقائق)، ونبذ طاف، و resuspend في 18 مل سائل الإعلام DM.
7. خلايا إعادة لوحة واحدة من 6 جيدا كل في ستة مصفوفة المغلفة 6 آبار في 3 مل من DM لكل بئر (1: 6 التوسع) أو المغلفة واحد 75CM ² قارورة (1: 7.5 التوسع).
8. كرر الخطوات من 3،4-3،8 حسب الضرورة حتى يتم الحصول على ما يكفي من الخلايا.
   ملاحظة: في محاولة لجمع أكبر عدد ممكن من المستعمرات ممكن للتوسع بدلا من التخطيط لتضخيم الثقافات عبر الركض لأن كل مرور يدفع RPE فقد التمايز.

النتائج

الخطوات الموضحة في هذه المخطوطة، كما هو مبين في الشكل رقم 1، ويمكن استخدامها لتوليد بسهولة RPE من الخلايا الجذعية كما ذكرت سابقا ^10،12. بعد الحفاظ على خطوط المحفزة لعدة أسابيع، المستعمرات الصباغية تبدأ في الظهور في المستعمرات بعد 5-7 أسابيع (وترد الثقافات القديمة 7 الأسبوع في الشكل 2A-C). ويمكن لهذه المستعمرات تستمر في النمو لعدة أسابيع حيث يتم الحفاظ على الثقافات. مرة واحدة تصل إلى أحجام كافية، كما هو مبين في الشكل 2D-F

المناقشة

في هذه المخطوطة نحن الخطوط العريضة الخطوات لتوليد بكفاءة أعداد كبيرة من الذهب الخالص الثقافات IPS-RPE. لقد أظهرنا سابقا باستخدام هذا البروتوكول التمايز الموجهة مع Activin A أننا يمكن أن تولد IPS-RPE التي تشبه بقوة hRPE على أساس transcriptomics، البروتينات، الايض، وظائف، وأنها تؤخر تنكس الشبكية عند زرعها في الفئران RCS ^12،31،32 . عملية توليد IPS-RPE هي مضيعة للوقت، ولكن ليس شاقة (الشكل 1). وبمجرد أن الثقافات الجذع تصل confluency يجب أن يكون الطعام مع وسا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
سكين القرنية	Surgipro	SPOI-070	× 1
DMEM / F-12 ، HEPES	Life Technologies	11330-032	500 مل × 4   ؛
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، 1X بدون Ca / خارج Ca أو Mg	VWR	45000-434	500 مل × 6
مصل بقري للجنين ، عادي (معطل حراريا)	VWR	45000-736	500 مل × 1
FGF-Basic (AA 10-155) تقنيات حياة البروتين البشري المؤتلف		PHG0021	100 & micro ؛ ز × 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 مجم × 1
بالضربة القاضية DMEM	Life Technologies	10829-018	500 مل × 1   ؛
KnockOut مصل بديل	Life Technologies	10828-028	500 مل × 1
L-Glutamine 200 mM & nbsp ؛	Life Technologies	25030-081	100 مل × 1
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X & nbsp ؛	لايف تكنولوجيز	11140-050	100 مل × 1
نيكوتيناميد	سيجما-ألدريتش	N0636-100G	100 جم × 1
بنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)	Life Technologies	15140-148	20 مل × 1
مؤتلف Human/Murine/Rat Activin A	PeproTech	120-14E	10 & مايكرو ؛ ز × 2
Synthemax-T سطح 6 ألواح آبار	Corning	3877	حالة (12) × 1
إنزيم TrypLE-Express (1X) ، بدون فينول أحمر   ؛	لايف تكنولوجيز	12604-021	500 مل × 1
زجاجة الفراغ / التخزين ، 0.1 & micro ؛ م المسام ، 500 مل   ؛	431475 كورنينج		(12) × 1 & nbsp ؛