نقدم بروتوكولا لتوليد الثقافات الأولية للفئران والخلايا اللحمية للمريء البشرية مع نمط ظاهري للأرومات الليفية العضلية. تحتوي الخلايا المستنبتة على مورفولوجيا على شكل مغزل ، وتعبر عن α-SMA و vimentin ، وتفتقر إلى علامات سطح الخلايا الظهارية والمكونة للدم والبطانة. يمكن استخدام الخلايا اللحمية المميزة في الدراسات الوظيفية للتفاعلات الظهارية اللحمية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم إنشاء الفئران والمريء البشري myofibroblasts عن طريق الهضم الأنزيمي. يتم حصاد الوليد (8-12 يوم من العمر) المريء الفئران، مفروم، وغسلها، وتعرض لعملية الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز وdispase لمدة 25 دقيقة. يتم تجريد العينات استئصال المريء الإنسان للالمخصوصة العضلية والبرانية ومفروم الغشاء المخاطي المتبقية، وتعرض لعملية الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز وdispase لمدة تصل إلى 6 ساعات. الخلايا المستزرعة تعبر α-SMA وفيمنتين وdesmin صريح ضعيفة أو لا على الاطلاق. الظروف الثقافة ليست مواتية لنمو طلائي، المكونة للدم، أو الخلايا البطانية. تأكيد ثقافة نقاء مزيدا من تدفق تقييم cytometric من سطح الخلية علامة التعبير من المحتمل المكونة للدم تلويث والخلايا البطانية. تقنية الموضحة واضح ومباشر والنتائج في جيل ثابت من غير hematopoieitc، خلايا انسجة غير البطانية. القيود المفروضة على هذه التقنية هي الملازمة لاستخدامالثقافات الأولية في دراسات البيولوجيا الجزيئية، أي تقلبات لا مفر منه اجه بين الثقافات أنشئت في جميع أنحاء الفئران أو البشر مختلفة. لكن الثقافات الأولية هي انعكاس أكثر تمثيلا للدولة في الجسم الحي بالمقارنة مع خطوط الخلايا. هذه الأساليب أيضا توفير المحققين القدرة على عزل والخلايا الثقافة انسجة من الحالات السريرية والتجريبية المختلفة، ويتيح إجراء مقارنات بين المجموعات. ويمكن أيضا خلايا انسجة المريء تتميز استخدامها في الدراسات وظيفية التحقيق التفاعلات الظهارية اللحمية في اضطرابات المريء.
المقدمة
وتشارك التفاعلات الظهارية اللحمية في تنظيم مجموعة متنوعة من الوظائف الجهاز الهضمي بما في ذلك تجديد الغشاء المخاطي، وإصلاح، والتليف، والتسرطن 1،2. وكانت هذه التفاعلات أفضل درس في الأمعاء الدقيقة والقولون وربما تلعب بالمثل دورا في اضطرابات المخاطية للمريء 3. وقد تجلى جزء من السكان من myofibroblasts الخلايا اللحمية المعوية والقولون ووصف للمشاركة في التوسط إصابة الأنسجة، والتهاب وإصلاح 4،5. في الجهاز الهضمي البعيدة، وهذه الخلايا المغزل على شكل يقع بالقرب من الغشاء القاعدي في واجهة بين الظهارة والصفيحة المخصوصة وتعرف بأنها α-SMA وفيمنتين إيجابية، لعموم cytokeratin سلبية، وإيجابية ضعيفة أو desmin سلبي 5.
لم يتميز سدى المريء بصرامة على المستوى الخلوي أو الجزيئي. عملنا في المريء الفئران وديmonstrated α-SMA وفيمنتين الخلايا في سدى المريء، تحتاني في بعض الأحيان إلى ظهارة الحرشفية 6. قد تورطت التفاعلات الظهارية اللحمية في اضطرابات المخاطية للمريء مثل المعدي المريئي بوساطة إصابة 6 والتهاب المريء اليوزيني 3. القيود تليفي هي أيضا من المضاعفات المعروفة للخلايا الإصابة وانسجة المريء قد تورطت في التسبب في التليف الهضمي. سوف عزل هذه الخلايا تساعد في إنجاز الدراسات اللازمة للتحقيق في مسارات الإشارات مختل.
يوفر هذا التقديم التقنيات اللازمة لإنشاء الثقافات الأولية من α-SMA، myofibroblasts إيجابية فيمنتين الايجابية ان هذه الفجوات القائمة في المعرفة بشأن مسارات إشارات تتوسط هذه التفاعلات يمكن معالجتها. تقنية الموضحة وقد استخدم بنجاح من قبل المؤلفين لإنشاء الأولية myofibroblasts القولون الفئران (7) وابعد من ذلكص تكييفها لإنشاء الفئران وخلايا انسجة 6 المريء مثل الأرومة الليفية العضلية الإنسان.
هنا نحن تصف الشروط اللازمة لإنشاء وتميز هذه الثقافات أنشئت من الماوس أو المريء البشري قبل استخدامها في الدراسات الوظيفية المستقبلية. الثقافات يمكن زراعتها والاستفادة منها لمدة تصل إلى 15 الممرات. العزلة وإنشاء الثقافات الأولية عن طريق الأساليب المذكورة أدناه يولد خلايا انسجة مع النمط الظاهري الأرومة الليفية العضلية. α-SMA، فيمنتين إيجابي، وإيجابي ضعيف أو سلبي لdesmin، وcytokeratin سلبي. هذا النمط الظاهري يختلف عن النمط الظاهري من الخلايا الليفية المريء والتي هي في الغالب إيجابية فيمنتين، α-SMA سلبي 3 أو α-SMA إيجابي، فيمنتين النمط الظاهري السلبي للالعضلية المخاطية 6.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بروتوكول لأداء التجارب على الحيوانات، والأساس المنطقي وأهداف البحث، وتمت الموافقة عليها من قبل جامعة جنوب كاليفورنيا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
وتمت الموافقة على بروتوكول لإنشاء الثقافات الأولية من إلغاء تحديدها-العينات المريء الإنسان من جامعة جنوب كاليفورنيا مجلس المراجعة المؤسسية.
1. الحصول على الماوس أو المريء الإنسان
- الحصول ماوس المرئ:
- الموت ببطء الماوس القديم 8-12 يوم مع 2٪ جرعة زائدة المستنشق الأيزوفلورين تليها خلع عنق الرحم.
- دبوس الحيوان أسفل البطن مع مواجهة والرطب السطح البطني مع الايثانول 70٪. بالملقط، والاستيلاء ورفع الأمامي الجلد لفتح مجرى البول بالملقط. استخدام مقص جراحي القياسية على التوالي لقطع على طول خط الوسط بطني من فتح مجرى البول إلى الذقن. كن حذرا لقطع فقط الجلد.
- إجراء شق من مجرى البول فتح الأسفل إلى الركبة على جانبي الحيوان، وتشكيل رأسا على عقب "Y". جعل شق آخر على جانبي الحيوان على طول القفص الصدري.
- قشر بعناية الجلد على كلا الجانبين، الخروج من الغشاء البريتوني الكامنة والقفص الصدري، ووضع على الجانبين. دراسة القفص الصدري المغطي التجويف الصدري والصفاق المغطي تجويف البطن.
- رفع الصفاق مع ملقط وقطع طريق ليصل إلى الحجاب الحاجز والقفص الصدري، مشيرا مقص التصاعدي لمنع تلف محتويات البطن. رفع بلطف صعودا الفص الأيسر من الكبد، وفضح المعدة الأساسية، تقاطع-المريء المعدة والجزء البطني من المريء.
- استخدام مقص جراحي تعقيمها لقطع طريق القص والقفص الصدري على طول خط الوسط حتى حزام عنق الرحم. مقص نقطة صعودا لمنع الأضرار التي لحقت محتويات الصدرية. كشف تماما عن محتوياتالتجويف الصدري عن طريق سحب القفص الصدري على الجانبين.
- بلطف إزالة القلب وكل من فصوص الرئة. امتصاص الدم الزائد مع Q-النصائح. المريء الصدري هو ضيق، أنبوب الكذب مرنة الخلفي إلى القصبة الهوائية والأمامي إلى الفقرات الصدرية.
ملاحظة: المريء يمكن أن يكون من الصعب تحديد في حديثي الولادة الفئران. توطين تقاطع-المريء المعدة يجعل تحديد المريء واضحة. - اتبع بعناية المريء من المعدة، تشريح الأوعية الدموية المحيطة بها، والدهون ومساريق على طول الطريق حتى إلى الأصل المريء في تجويف الرحم. مقص جراحي مع تلميح حادة تعمل على أفضل وجه لهذا الغرض.
- بتر كامل طول المريء ومكان في هانكس "محلول ملحي متوازن (HBSS) لمزيد من المعالجة هو موضح أدناه. إزالة جزء من المعدة لأغراض التوجه اذا شئت.
ملاحظة: نظرا لحجم الأنسجة صغير، والفصل بين العضلية المخصوصة من العضلاتهو الغشاء المخاطي ليست قابلة للتحقيق في الفئران حديثي الولادة المريء ويخضع المريء كامل لمعالجة موضح أدناه.
- الحصول على المرئ الإنسان:
- غسل العينات استئصال المريء (عادة 5 سم أو أقل) مع HBSS وإزالة أي تعلق النسيج الضام، والدهون، أو الأوعية الدموية.
- بتر جزء من العينة ووضعها في الفورمالين لفحص نسيجية في المستقبل اذا شئت.
- فصل ما تبقى من الغشاء المخاطي من الأساسي العضلية المخصوصة التي كتبها تشريح حاد.
- قطع الغشاء المخاطي إلى أجزاء سنتيمتر الفرعية وتخضع لبروتوكول موضح أدناه.
ملاحظة: استئصال المريء الإنسان يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى 6 ساعات قبل تجهيزها موضح أدناه. سوف مصدر العينات المريء تملي حجم العينة، وسوف يكون المختبر معتمدا.
2. عزل الفئران والإنسان المريء اللحمية خلايا
- عزل خلايا انسجة المريء والفئران مدمج والأنسجة البشرية من خلال مزيج من الهضم الميكانيكي والأنزيمية.
- هضم ميكانيكيا بواسطة تنميق الأنسجة مع مقص ويغسل متعددة مع HBSS. هضم إنزيمي التي يحتضنها الأنسجة مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة 25 دقيقة (الأنسجة الفئران) أو لمدة تصل إلى 6 ساعات (الأنسجة البشرية). التأكد من أن الأدوات المستخدمة في تنميق تم تعقيمها وتعقيم.
ملاحظة: Collagenases هي الانزيمات التي تفتت الكولاجين، وهو البروتين مصفوفة خارج الخلية مسؤولة عن عقد الأنسجة الحيوانية معا. كولاجيناز الحادي عشر ديه نشاط كولاجيناز عالية وشهدت نجاحا في هذا البروتوكول العزلة. Dispase هو الإنزيم البكتيري معتدلا مع النشاط التفكك بروتين أن يحافظ على خلية نشاط الغشاء ويستخدم في تركيبة مع كولاجيناز كما انزيم الثانوي. - وضع شظايا المخاطية تم الحصول عليها من الماوس أو الأنسجة البشرية في 1.7 مل الصغيرة الطرد المركزي أو 5 مل أنابيب على التوالي، التي تحتوي على HBSS. نسيج اللحم المفروم مزيدإلى 2-3 مم القطع باستخدام مقص مع عرض غيض مفتوحة من شأنها أن تناسب أنابيب منها. يتيح وقتا كافيا للسماح للشظايا الغشاء المخاطي للمريء إلى الرواسب في قاع الأنبوب.
- صب ببطء HBSS، والحرص على عدم تجاهل عن غير قصد الأنسجة. استبدال HBSS الطازجة التالية عن طريق هز لطيف. بدلا من ذلك، إزالة HBSS مع ماصة 1 مل.
- غسل الأنسجة بهذه الطريقة ما مجموعه 8 مرات مع لطيف تهتز في بين يغسل يتيح وقتا لشظايا المريء على الرسوبيات بين كل غسل.
ملاحظة: الأنسجة البشرية سيتطلب أكثر تنميق أن الأنسجة الوليد الماوس.
- هضم ميكانيكيا بواسطة تنميق الأنسجة مع مقص ويغسل متعددة مع HBSS. هضم إنزيمي التي يحتضنها الأنسجة مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة 25 دقيقة (الأنسجة الفئران) أو لمدة تصل إلى 6 ساعات (الأنسجة البشرية). التأكد من أن الأدوات المستخدمة في تنميق تم تعقيمها وتعقيم.
- احتضان الأنسجة الفئران مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة 25 دقيقة على شاكر هزاز وضعت في سرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الأنسجة البشرية مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة تصل إلى 6 ساعات، على شاكر هزاز وضعت في سرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: توفر esopha البشريجوس هو متغير. الغشاء المخاطي المريء البشري حضنت مع الانزيمات لمدة تصل إلى 6 النتائج ساعة في جيل ناجح من الثقافات الأولية.
- احتضان الأنسجة البشرية مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة تصل إلى 6 ساعات، على شاكر هزاز وضعت في سرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الهضم الأنزيمي، اللحم المفروم الأنسجة أكثر مع مقص والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة.
- تجاهل طاف. نقل بيليه، ويتكون من تعليق الخلية المختلطة إلى أنبوب 5 مل ويغسل 5 مرات في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 2٪ السوربيتول للقضاء على خلايا غير قابل للحياة والحطام.
- خلايا البذور في 6 لوحات جيدة والثقافة في DMEM مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 10 ملغ / مل الأنسولين، و 10 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و2 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) . مرشح فراغ (0.22 ميكرون) جميع المكونات باستثناء EGF التي يمكن أن تضاف بعد الترشيح. توزيع الخلايا التي تم الحصول عليها من العينات استئصال الإنسان بين متعددة 6 لوحات جيدا، وهذا يتوقف على حجم الاستئصال الجزئي.
- مرة واحدة الآبار هي 80٪ متموجة، مرور الخلايا الملتصقة إلى T25 قارورة لناجي 0.05٪ التربسين / حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA). تحييد مع وسائل الإعلام وتدور في 400 ز س.
- لمرور 6 جيدا لقارورة T25، وخلايا مرور في نسبة 1: 1. يمكن passaged قوارير متكدسة T25 في 1: 2 أو 1: 3 نسبة. إلى الانتقال من قارورة T25 إلى قارورة T75، استخدم نسبة 1: 1. تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام بغض النظر عن السفينة.
- زراعة خلايا في 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة والثقافة في وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية المذكورة أعلاه.
ملاحظة: الخلايا الظهارية لا البقاء على قيد الحياة في ظل هذه الظروف ثقافة أو المرور. الخلايا المستخدمة لتوصيف والدراسات المبينة أدناه هي بين الممرات 5 و 15. - البرد الحفاظ على الخلايا في السائل N 2 وذلك بإضافة 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية.
3. تميز الفئران والإنسان المريء اللحمية خلايا
- دراسة مورفولوجيا الخلايا مع مجهر مقلوب. مراقبة على شكل المغزلمورفولوجيا الخلايا الملتصقة (الشكل 1).
- تميز الخلايا المستزرعة التي كتبها تقييم علامات هيكل الخلية التالية: α-SMA، فيمنتين، desmin، وcytokeratin. خلايا انسجة مع النمط الظاهري مثل الأرومة الليفية العضلية تعبر عن علامات الأرومة الليفية العضلية هيكل الخلية α-SMA وفيمنتين (الشكل 2).
- الاستمرار في تمييز الخلايا اللحمية مثقف من خلايا العضلات، immunostain لdesmin. لأداء المناعية على خلايا مثقف، لوحة 1.5 × 10 4 خلايا في الشرائح غرفة 4-جيدا وتنمو في وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية لمدة 24 ساعة. سوف خلايا انسجة مع النمط الظاهري مثل الأرومة الليفية العضلية يكون ضعيفا أو غائبا التعبير desmin. خلايا انسجة تفتقر التعبير عن علامة الظهارية عموم cytokeratin (لا تظهر البيانات).
ملاحظة: يتضمن تقييم الثقافات تقييم علامات هيكل الخلية التي كتبها مناعية وسطح الخلية علامات التدفق الخلوي. يستخدم مناعية كطريقة الرئيسي لتوصيف مثل السابقالملف الشخصي PRESSION من البروتينات هيكل الخلية هي فريدة من نوعها لالليفية، الأرومة الليفية العضلية أو الخلايا العضلية. يؤسس التدفق الخلوي ثقافة النقاء من خلال تقييم خلية التعبير سطح الظهارية، البطانية، والخلايا المكونة للدم علامات. CD90 مفيد كطريقة مرافقة من تحديد خلايا انسجة الإنسان كما يعبر عنه على كل من الخلايا الليفية الإنسان وmyofibroblasts. CD90 ليست مفيدة في توصيف خلايا انسجة الفئران كما أعرب أيضا عن طريق خلايا T الفئران.
- الاستمرار في تمييز الخلايا اللحمية مثقف من خلايا العضلات، immunostain لdesmin. لأداء المناعية على خلايا مثقف، لوحة 1.5 × 10 4 خلايا في الشرائح غرفة 4-جيدا وتنمو في وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية لمدة 24 ساعة. سوف خلايا انسجة مع النمط الظاهري مثل الأرومة الليفية العضلية يكون ضعيفا أو غائبا التعبير desmin. خلايا انسجة تفتقر التعبير عن علامة الظهارية عموم cytokeratin (لا تظهر البيانات).
- بعد خلايا تصل إلى 60٪ التقاء، وشطف الشرائح مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإصلاح مع الميثانول. احتضان الخلايا في الميثانول لمدة 10 دقيقة في -20 ° C، ثم تخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- اتبع بروتوكول المناعية القياسية.
- لفترة وجيزة، قبل تطبيق الأجسام المضادة الأولية، منع خلايا ثابتة مع 5٪ goatserum في برنامج تلفزيوني. تمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية في 5٪ مصل الماعز أيضا.
- للكشف عن α-SMA وفيمنتين، استخدمالأجسام المضادة التالية وتركيزات: الفأر MAB إلى α-SMA في 1: 250 التخفيف والأرنب PAB إلى فيمنتين في 1: 500 التخفيف.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وشطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة الأجسام المضادة الثانوية رودامين مترافق الماعز المضادة الماوس في التخفيف من 1: 200 وCy2 الماعز مترافق مكافحة الأرنب في التخفيف من 1: 1،000 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- نوى مباين مع 4 "، 6-Diamidino-2Phenylindole (دابي) بتركيز 1 ميكروغرام / مل لمدة 1 دقيقة ثم يغسل مع برنامج تلفزيوني. تحليل الشرائح مع مجهر مقلوب.
- إنشاء نقاء الثقافات عن طريق الفحص من خلايا المريء الفئران والإنسان للدم (CD45) والبطانية (CD31) علامات سطح الخلية عن طريق التدفق الخلوي (الشكل 3). تميز الخلايا البشرية مزيدا من التعبير عن الخلية انسجة علامة السطحية CD90.
ملاحظة: CD90 لا يمكن أن تستخدم لتحديد الخلايا اللحمية الفئران كما الفئران T سلليرة سورية أيضا التعبير عن CD90.- فصل خلايا فأر المريء انسجة مثقف من قوارير الثقافة عن طريق العلاج مع خلية غير الأنزيمية التفكك الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وغسلها مع العازلة FACS مرتين، عد وملطخة FITC-CD45 وAPC-CD31 مع الضوابط نمط إسوي ذات الصلة، وفقا لتلطيخ الاجراءات القياسية.
- جمع الخلايا باستخدام FACS بنات كوول وتحليل البيانات مع برنامج FlowJo. قبل خلايا تلطيخ، وتحسين الأجسام المضادة ويعاير تركيزات باستخدام عناصر تحكم نمط إسوي والطحال الماوس العادي، وخلايا نخاع العظام.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
خلايا انسجة المريء معزولة باستخدام الهضم الميكانيكي والأنزيمية ومطلي في البداية ومثقف في 6 لوحات جيدة. فحص الخلايا مع مجهر مقلوب في غضون ساعات من الطلاء يوضح تعليق خلية مختلطة ملتصقة فضفاضة لوحة أسفل (الشكل 1A). على مدى ساعة 24 المقبلة، ويلاحظ خلايا على شكل مغزل ملتصقة بقوة إلى أسفل لوحة اطلاق النار من تعليق الخلية المختلطة (الشكل 1B) .هذه تغطي الخلايا تنتشر في المنطقة بأكملها من بئر تقع ضمن نطاق 5 أيام ويمكن passaged بنجاح، والإبقاء على التشكل لا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقنيات لتوليد ثقافة الأساسي متشابهة عموما عند استخدام أنسجة الفئران أو الإنسان مع تنميق والهضم مرات تكييفها لحجم الأنسجة. تجربتنا مع الأنسجة الفئران تشير إلى أن استخدام الأساليب المذكورة أعلاه يؤدي باستمرار في إنشاء الناجح للثقافات الأولية. وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تعقيم المعدات الجراحية والتقنيات التالية معقمة القياسية للزراعة الأنسجة. عمر الفئران هو أيضا خطوة حاسمة. 8 - حديثي الولادة القديمة 12 يوما تسفر باستمرار الثقافات الأولية الناجحة. لم لم يتم إنشاء خلايا انسجة مع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NCI K08CA153036-01A1 (AS)، AGA-جنرال ميلز معهد بيل الصحة والتغذية جائزة بحوث الباحث في علم وظائف الأعضاء الوتر وجائزة الطيار مؤسسة رايت (AS) الصحة (AS) و.
شكر وتقدير
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كواشف زراعة | |||
| الأنسجة HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO ، Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO ، Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | سيجما ألدريتش | F42442 | |
| ترانسفيرين | روش | 10-652-202-001 | |
| التربسين / EDTA | كورنينج | 25-052-Cl | |
| عامل نمو البشرة | سيجما ألدريتش | E9644 | |
| الكواشف لتلطيخ | |||
| الماعز المصل | سيجما ألدريتش | G9023 | |
| ماوس mAB إلى α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 مترافق الماعز المضاد للأرانب | جاكسون ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 مترافق مع eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 مترافق مع APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V و 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| كتلة Fc للماوس ل CD16 / CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| معدات | |||
| أنبوب 5 مل | Eppendorf | 30108310 | |
| مجهر مقلوب | Motic | AE31 | |
| خزانة السلامة الحيوية وحاضنات | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/< / a> | |
| 4 شرائح غرفة بئر | حراري علمي | 177437 | |
| أجهزة طرد مركزي مبردة | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus نظام تصفية مدفوع بالفراغ | Genesee Scientific | 25-227 | |
| مجهر فلوري | نيكون | Eclipse TE300 | |
| 6 ألواح آبار | Corning | 3516 | |
| T25 قوارير | TRP | 90026 | |
| T75 قوارير | Corning | 43064 | |
| مقص | |||
| ملقط | |||
| Q-Tips ذو رأس | كيندال | 540500 | |
| Software | |||
| برنامج Metamorph (الأجهزة الجزيئية) | الأجهزة | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience |
المراجع
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
