يتم تغيير الوصلة العصبية العضلية (NMJ) في مجموعة متنوعة من الظروف التي يمكن أن تبلغ ذروتها في بعض الأحيان بالفشل المشبكي. يصف هذا التقرير الطرق القائمة على المجهر الفلوري لتحديد مثل هذه التغييرات الهيكلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو كبير، والتتابع الكوليني المشبك من خلالها الخلايا العصبية الحركية الثدييات تتحكم تقلص العضلات الطوعية. التغييرات الهيكلية في NMJ يمكن أن يؤدي إلى فشل العصبي، مما يؤدي إلى ضعف، وضمور وحتى الموت من الألياف العضلية. حققت العديد من الدراسات كيف تعديلات وراثية أو أمراض يمكن أن يغير هيكل NMJ الماوس. لسوء الحظ، يمكن أن يكون من الصعب مقارنة النتائج مباشرة من هذه الدراسات لأنها غالبا ما تستخدم معايير مختلفة وأساليب التحليلية. وصفت ثلاثة بروتوكولات هنا. أول يستخدم أقصى الإسقاط كثافة الصور مبائر لقياس مجال أستيل مستقبلات (الاستشاري لحقوق الإنسان) الغنية المجالات الغشاء بعد المشبكي في endplate ومنطقة متشابك حويصلة تلطيخ في المغطي الأعصاب الطرفية قبل المشبكي. بروتوكول الثاني يقارن كثافة نسبية للالمناعية للبروتينات متشابك في الغشاء بعد المشبكي. العلاقات العامة الثالثةotocol يستخدم نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) للكشف عن تغيرات في التعبئة من مركز عمان بعد المشبكي في endplate. وقد تم تطوير البروتوكولات وصقلها خلال سلسلة من الدراسات. وتناقش العوامل التي تؤثر على جودة واتساق النتائج ويتم توفير البيانات المعيارية للل NMJs في صحية الفئران الشباب البالغين.
المقدمة
الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو المشبك تتابع الأهمية بمكان أن يتوسط التواصل بين الجهاز العصبي والعضلات والهيكل العظمي. هو مطلوب منها لجميع الحركات الإرادية. منذ فترة طويلة تستخدم مضان المجهر لدراسة آثار الجينات المحورة على الماوس NMJ 1-3 أو لمقارنة آثار السن، والنظام الغذائي وممارسة الرياضة والمرض على لل NMJs القوارض 4-11. لقد علمتنا هذه الدراسات لنا الكثير عن علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية من NMJ، ولكن ذكرت المعلمات المتنوعة (على سبيل المثال، منطقة الاستشاري لحقوق الإنسان، منطقة endplate، وطول محيط، مؤشرات تجزئة) غالبا ما تجعل من الصعب مقارنة النتائج التي توصلت إليها هذه الدراسات. وهناك توق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: التصميم والتنفيذ والإبلاغ من التجارب على الحيوانات يجب أن تأخذ في الاعتبار المبادئ التوجيهية الحالية 24. يجب الموافقة على مثل هذا العمل مقدما من قبل السلطة الرفق بالحيوان المحلية (في حالتنا لجنة الأخلاقيات الحيوان في جامعة سيدني).
1. القتل الرحيم للحيوان وتشريح العضلات
- نقل الماوس من غرفة الاحتجاز إلى غرفة منفصلة حيث الموت الرحيم مع حقنة داخل الصفاق من حل بنتوباربيتون (30 ملغ / كلغ) باستخدام طريقة التعامل مع الماوس مفصل من قبل شيميزو 25. ضع الماوس مرة أخرى في قفص....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قياس المساحة متشابك في NMJ
يعتمد أي تقدير للمنطقة على رسم حدود لتحديد مدى التخصصات متشابك. في عضلات صحية الشباب البالغين يجب عرض الصور NMJ حدود واضحة المعالم لكلا الاستشاري لحقوق الإنسان وتلطيخ synaptophysin (الشكل 2A وباء). كثافة مضان لكلا الاستشاري لحقوق الإنسان وsynaptophysin ترتفع بشكل حاد على الحدود بين الجزء شبه متشابك ومتشابك من endplate السيارات (الشكل 5A 'وباء')........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد مكنت البروتوكولات الموصوفة هنا لنا لقياس بشكل موثوق وقياس التغيرات في خصائص NMJ عبر مجموعة من الشروط، بما في ذلك الشيخوخة والمرض الدول العادية. الطرق الموضحة للأون تواجه والصور NMJ تسمح للباحثين لمقارنة مجال التخصصات قبل وبعد المشبكي ومنطقة متشابك التداخل / المحاذاة. لمقارنة الكثافة النسبية للبروتينات قبل وبعد المشبكي البروتوكول الثاني، والذي يستخدم المقاطع البصرية عرضية، ويفضل. بروتوكول ثالث اختبارات على وجه التحديد لإجراء تغييرات في القرب من التعبئة والتغليف من مركز عمان في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
< p class = 'jove_content'>تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية [570930]. تم إجراء التصوير في مرفق الفحص المجهري المتقدم التابع لمعهد بوش. يتم شكر الأعضاء السابقين في المختبر ، الذين تم الاستشهاد بعملهم ، على مساهماتهم في تطوير هذه الأساليب.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مسح مجهر متحد البؤر | Leica | DM 2000 مع نظام TCS SP2 | يجب أن تكون معظم المجاهر الماسحة متحدة البؤر مناسبة. |
| زايس | LSM 510 ميتا | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (أحمر-BGT) | تقنيات الحياة | B35451 | تستخدم لوضع العلامات AChRs |
| Alexa647-&-bungarotoxin (far-red-BGT) | تقنيات الحياة | B35450 | فلورة حمراء بعيدة: بالكاد يمكن رؤيتها من خلال العدسة |
| الأرانب المضادة للsynaptophysin | تقنيات الحياة | 18-0130 | تختلف دفعات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية في تخفيف العمل الفعال |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | الجسم المضاد أحادي النسيلة المترافق مع FITC |
| FITC-donkey المضاد للأرانب IgG | Jackson | 711-095-152 | يمكن أن تختلف الأجسام المضادة الثانوية متعددة النسيلة في الجودة وفقا للمصدر والدفعة |
| مركب درجة حرارة القطع الأمثل (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | مصفوفة تضمين Cryostat لتجميد العضلات |
| DABCO | Sigma | 10981 | وسيط تركيب يبطئ التبييض الضوئي للفلوروفورات |
المراجع
- Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
- Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
