مقالة منهجية

طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي في المختبر

DOI:

10.3791/52221

⸱

مارس 21, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Animal Biology, The University of Western Australia, 2School of Animal Biology and The Oceans Institute, The University of Western Australia, 3Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Anatomy, Physiology and Human Biology, The University of Western Australia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمرير ضوء الزينون غير المتماسك من خلال تداخل ضيق النطاق ومرشحات كثافة محايدة لتوصيل ضوء بطول موجي وكثافة متفاوتة إلى الخلايا المستزرعة. تم استخدام هذا البروتوكول لتقييم آثار العلاج بالضوء الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة على إنتاج الأنواع التفاعلية في المختبر: لم يتم ملاحظة أي تأثيرات باستخدام المعلمات المختبرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحمر / العلاج شبه ضوء الأشعة تحت الحمراء (R / NIR-LT)، وسلمت عن طريق الليزر أو ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED)، ويحسن النتائج الفنية والصرفية في مجموعة من إصابات الجهاز العصبي المركزي في الجسم الحي، وربما عن طريق الحد من الإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، فقد ثبت آثار R / NIR-LT على الاكسدة تختلف اعتمادا على الطول الموجي أو شدة الإشعاع. الدراسات التي تقارن المعلمات العلاج غير موجودة، نظرا لعدم وجود الأجهزة المتوفرة تجاريا التي تقدم موجات متعددة أو شدة، ومناسبة لأعلى مستوى من خلال وضع في الدراسات الأمثل المختبر. يصف هذا البروتوكول تقنية للتسليم من الضوء على مجموعة واسعة من الأطوال الموجية وشدة لتحسين الجرعات العلاجية المطلوبة للنموذج إصابة معينة. لقد افترضنا أن وسيلة لإيصال الضوء، والتي يمكن بسهولة تغيير الطول الموجي وشدة المعلمات، يمكن أن يسهل تحديد جرعة المثلى لR / NIR-LT للحد من أنواع الاكسجين التفاعلية(ROS) في المختبر.

تم تصفيتها غير متماسك زينون الضوء من خلال مرشحات تدخل ضيقة النطاق لتقديم موجات متفاوتة (موجات مركز 440، 550، 670 و 810nm) وfluences (8.5 × 10 -3 إلى 3.8 × 10 -1 J / سم 2) من الضوء إلى الخلايا المستزرعة. تم معايرة الضوء الناتج من الجهاز لتنبعث منها جرعات كمي ذات الصلة علاجيا، متساوية من الضوء في كل الطول الموجي. تم الكشف عن الأنواع المتفاعلة في وأكدت الغلوتامات الخلايا المعالجة مع الضوء، وذلك باستخدام DCFH-DA وH 2 O 2 الأصباغ الفلورية الحساسة.

سلمنا بنجاح الضوء على مجموعة من الناحية الفسيولوجية وعلاجيا موجات وشدة ذات الصلة، إلى الخلايا المستزرعة تتعرض لالغلوتامات كنموذج للإصابة الجهاز العصبي المركزي. في حين أن fluences من R / NIR-LT المستخدمة في الدراسة الحالية لم ممارسة تأثير على ROS التي تولدها الخلايا المستزرعة، وطريقة التسليم الخفيف ينطبق على نظم ال آخريننظم الإدارة البيئية بما في ذلك الميتوكوندريا أو أكثر من الناحية الفسيولوجية نماذج ثقافة شريحة عضوي النمط ذات الصلة معزولة، ويمكن استخدامها لتقييم الآثار على مجموعة من التدابير نتائج الأيض التأكسدي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرجى ملء أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) لطائفة من إشارة مسارات نقل وردود الفعل الطبيعية من الأيض الخلوي، بما في ذلك الحماية العصبية 1. ومع ذلك، عندما آلية مضادة للأكسدة الذاتية غير قادرة على السيطرة على إنتاج ROS، الخلايا قد فريسة لالاكسدة 2،3. وبعد إصابة في الجهاز العصبي المركزي، ويعتقد أن الزيادات المرتبطة بحضور ROS والاكسدة للعب دور كبير في تطور الضرر 4،5. على الرغم من العدد واسعة من استراتيجيات لتخفيف الاجهاد التأكسدي التي تم تقييمها، وهناك حاليا أي والاستراتيجيات المضادة للأكسدة فعالة تماما ذات الصلة سريريا لتخفيف إنتاج ROS والاكسدة المرتبطة بها في الاستخدام السريري التالية رضح عصبي 6. وبالتالي تخفيف الإجهاد التأكسدي يبقى هدفا مهما للتدخل العلاجي 7.

تحسينات تتبعتم الإبلاغ جي R / NIR-LT في مجموعة واسعة من الإصابات والأمراض بما في ذلك تخفيض في فؤادي حجم احتشاء، والمضاعفات الكلوية والكبدية أثناء مرض السكري، وتنكس الشبكية أو الإصابة CNS والسكتة الدماغية 8، ربما عن طريق الحد من الإجهاد التأكسدي. مع إيلاء اهتمام خاص إلى إصابة الجهاز العصبي المركزي، وقد أظهرت الدراسات قبل السريرية من فعالية ضوء 670nm آثار جيدة في نماذج من تنكس الشبكية 9-11، واصابات الحبل الشوكي 12، موت الخلايا العصبية (13). وقد أجريت التجارب السريرية لسن الجافة بتحلل البقعة الصفراء والتي تجرى حاليا للسكتة الدماغية 14، إلا أن نتائج هذه التجارب لا تظهر واعدة، وربما يرجع ذلك إلى عدم توظيف علاج فعال المعلمات 15. على هذا النحو، لم يعتمد R / NIR-LT على نطاق واسع كجزء من الممارسة السريرية العادية في رضح عصبي، على الرغم من كونه وسيلة سهلة لإدارة، غير الغازية والعلاج غير مكلفة نسبيا. وتشمل الحواجز على الترجمة السريرية عدم وجود CLأدركت منذ البداية آلية العمل وعدم وجود موحد فعال 16،17 بروتوكول العلاج. الأدب الحالي بشأن العلاج بالضوء يكشف عن عدد كبير من التباين في المعايير في المعاملة بين مصادر الإشعاع (LED أو ليزر)، والطول الموجي (على سبيل المثال، 630، 670، 780، 810، 830، 880، 904nm)، الجرعة الإجمالية (جول من الإشعاع / وحدة المساحة)، ومدة (زمن التعرض) والتوقيت (إهانة ما قبل أو ما بعد)، وتواتر العلاج وطريقة التسليم (نبض أو مستمر) 8. التباين في المعاملة بين المعلمات دراسات يجعل المقارنة صعبة وساهم في الشكوك بشأن فعالية 16.

لذلك، والتحسين من R / NIR-LT مطلوب بشكل واضح، مع أنظمة قادرة على توفير آلية فحص عالية الإنتاجية اللازمة لمقارنة متغيرات متعددة ثقافة الخلية. ولكن هناك عدد قليل من النظم الإضاءة المتاحة تجاريا التي يمكن أن توفر ما يكفي من المرونة والسيطرة على واvelength وشدة لأداء مثل هذه التجارب الأمثل. تجاريا المتاحة أجهزة LED هي عموما ليست قادرة على تقديم الأطوال الموجية أو شدة متعددة، مما أدى إلى المحققين توظيف عدة أجهزة LED من مختلف الصانعين، والتي قد تختلف ليس فقط في شدة، ولكن أيضا الطيف من الطول الموجي للضوء المنبعث. لقد تناولت هذه القضية من خلال توظيف مصدر ضوء زينون النطاق العريض التي تمت تصفيتها من خلال مرشحات تدخل الضيق، وبالتالي توليد مجموعة من الأطوال الموجية للضوء وfluences، مما يسمح ثيقة، مراقبة دقيقة من المعلمات من R / NIR-LT.

من المهم أن نلاحظ أن الجرعة العلاجية من العلاج تم تعريفه من قبل عدد من الفوتونات التفاعل مع photoacceptor (حامل اللون)، والتي، وافترض في حالة R / NIR-LT أن تكون السيتوكروم ج أوكسيديز (COX) 18. طاقة الفوتون تسليمها يختلف مع الطول الموجي. وهذا يعني جرعات متساوية للطاقة في أطوال موجية مختلفة يكون كومنفيسة من أرقام مختلفة من الفوتونات. ولذلك، فإن الضوء المنبعث من الجهاز تم معايرة لتنبعث منها عدد متساو من الفوتونات لكل من الأطوال الموجية المختار لفحصها. قمنا بتطوير نظام التي يمكن استخدامها لتقديم R / NIR-LT في مجموعة واسعة من الأطوال الموجية وشدة إلى خلايا في المختبر، وأثبت القدرة على قياس الآثار المترتبة على تسليمها R / NIR-LT على الإنتاج ROS في الخلايا تعرض ل الإجهاد الغلوتامات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بصري المعايرة: قياس الضوء الناتج

  1. لإعداد جهاز تسليم خفيفة، توصيل مصدر الضوء النطاق العريض (على سبيل المثال، زينون أو مصباح التنجستن) لامدادات الطاقة المناسب. ضع العدسة الموازاة أمام مصدر الضوء لإنتاج شعاع موازى للضوء. تمرير الضوء من خلال مرشح الحرارة السائل لإزالة معظم الحرارة من شعاع ضوء. اعتمادا على التطبيق، والتركيز شعاع موازى إلى فتحة مدخل دليل ضوء السائل، والذي ينص على تسليم أكثر مرونة من الضوء (على سبيل المثال، إلى حاضنة).
  2. في الطرف الآخر من دليل ضوء السائل، ضع العدسة الموازاة الثانية ثم حامل للتدخل ومرشحات الكثافة محايدة. تحقق من أن هذا الترتيب ينتج بقعة مضيئة بالتساوي من ضوء و waveband المطلوب وشدة.
    ملاحظة: المسافة بين نهاية نور الهداية والطائرة العينة قد تحتاج إلى تختلف تبعا لالمنطقة التي يجب أن تكون مضيئة، ولكن تذكر أن والمسافة من نهاية الزيادات دليل الخفيفة، وشدة الضوء ستنخفض. في هذه الدراسة، هذه المسافة هي ل 14cm وتنتج المقطع العرضي شعاع الذي ينير بالتساوي على المنطقة جيدا 3X3 على طبق من ذهب 96-جيدا.
  3. تأكد من أن الضوء الشارد من مصباح والمكونات البصرية المرتبطة بها غير قادر على الوصول إلى العينة.
  4. بدوره على برودة الماء لتصفية حرارة السائل وضمان عدم وتبادل المياه من خلال سترة التصفية. بدوره على مصدر الطاقة مصباح والانتظار لمدة 5 دقائق على الأقل لمصدر ضوء النطاق العريض لتحقيق الاستقرار. ملاحظة: مطلوب استخدام برودة الماء لمنع الإفراط في التدفئة للجهاز.
  5. اختر مرشح تدخل الضيق (التي توصف عادة من قبل الطول الموجي لها مركز، النفاذية الذروة والعرض الكامل في نصف كحد أقصى (FWHM) عرض النطاق الترددي) لتوليد و waveband المطلوب من الإضاءة. ملاحظة: وكانت المرشحات تدخل الضيق المستخدمة في الدراسة الحالية 442 نانومتر و 550 نانومتر، 671 نانومتر و 810 نانومتر.
  6. قياس الضوء التي تنتجها مصباح في الطائرة حيث العينة هو وضعه خلال فترة العلاج. قياس الضوء باستخدام مسبار الإشعاع معايرة (جيب التمام جامع) متصلة مقياس الطيف مناسبة، وذلك باستخدام برنامج اللياقة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  7. استخدام مرشحات الكثافة محايدة لضبط شدة الضوء حتى يتم الحصول على النتيجة المرجوة. ملاحظة: في هذه الدراسة، ويتم ضبط شدة مرت من قبل كل مرشح تدخل ضوء لإعطاء ناتج كمي على قدم المساواة في كل من wavebands العلاج الأربعة. فمن المهم للتحقق من معايرة بانتظام، والإخراج المصباح هو عرضة للتغيير.
    ملاحظة: بعد مجموعة تتكون من جهاز، والخلايا جاهزة للمضيئة الشكل 1 هو تمثيل لجهاز تسليم ضوء المستخدمة في الدراسة الحالية.

figure-protocol-1

الشكل 1. صورة الجهاز تسليم خفيفة. المصور هي مصدر الطاقة الخفيفة، مصباح زينون مع السكن، عدسة الموازاة، تصفية المياه، ومدخل الفتحة، دليل ضوء السائل، عدسة الموازاة الثانية، حامل مرشح، والإطار العلاج وغير لامع بطاقة سوداء. لاحظ أن الضيق الطول الموجي وشدة المرشحات لا تظهر.

2. خلية التحضير

  1. وR / NIR-LT طريقة التسليم وصفها يمكن تطبيقها على أي نوع من الخلايا أو في نظام نموذجي المختبر. على هذا النحو الأوصاف التالية من زراعة الخلايا هي عامة، وذلك باستخدام تقنيات راسخة لورم القواتم الثقافة (PC12)، مولر (rMC1) وخلايا الشبكية المختلطة الابتدائية.
  2. قبل البذر خلية للعلاج الخفيفة والأكسدة الإجهاد الفحص، تخليد ثقافة الخلايا في وسائل الإعلام الخاصة النمو منها تحتوي على المكملات المناسبة (على سبيل المثال، FBS والمضادات الحيوية) في إف إل أي إس T75كانساس حتى 70-80٪ متموجة.
  3. فصل خلايا خلدت من قوارير T75، وذلك باستخدام الطريقة المناسبة لنوع من الخلايا لفحصها على سبيل المثال.، التربسين. إذا لزم الأمر، قبل الشروع في البذر من الخلايا في 96-جيدا لوحات الفحص والآبار لوحة معطف مقايسة مع 10μg / مل بولي-L-ليسين ل1H (على سبيل المثال، للخلايا PC12) أو 10μg / مل بولي-L-ليسين ل 1H يعقبه O / N الحضانة مع 10μg / مل laminin (على سبيل المثال، للخلايا الشبكية مختلطة).
  4. خلايا الطرد المركزي لجمع حسب الاقتضاء (على سبيل المثال، 3 دقائق في 405 x ج لخلايا PC12 أو 10 دقيقة في 218 x ج لخلايا rMC1)، وإزالة وطاف resuspend في 8 مل من المناسب سائل الإعلام ثقافة الخلية.
  5. إذا خلايا الشبكية مختلطة هي لاستخدامها، وإعداد من P0-5 الفئران الوليدة حديثي الولادة عن طريق الهضم الأنزيمي (غراء) وفقا للإجراءات المقررة 19
  6. حساب عدد خلايا قابلة للحياة باستثناء 0.4٪ (ث / ت) صبغة زرقاء التريبان، وذلك باستخدام haemocytometer.
  7. ضبط كثافة الخلية يرغب، يمثح أن الخلايا ستكون حوالي 70-80٪ متموجة بعد 24 أو 48H في الثقافة. (للخلايا PC12 كثافة البذر هي 4.0 × 10 5 خلايا قابلة للحياة / مل، للخلايا rMC1، فمن 2.5 × 10 5 خلايا قابلة للحياة / مل وللخلايا الشبكية المختلطة هو 8 × 10 5 خلايا قابلة للحياة / مل). بعد إضافة خلايا إما لوحات 96-جيدا واضحة أو السوداء (التي تستخدم لH 2 O 2 أو DCFH-DA فحص على التوالي)، في 100 ميكرولتر من وسائط النمو المناسب، والسماح لوحة للجلوس على سطح مستو عند 37 درجة مئوية، 5 ٪ CO 2 (أو أيا كان الظروف المناسبة لنوع خلية معينة) لا يقل عن 24 ساعة للسماح الالتزام الخلية.
  8. خلايا الثقافة في وسائل الاعلام النمو في مناسبة 96 صواني جيدا حتى تكون 70-80٪ متموجة (24H لPC12 والخلايا rMC1، 48H لخلايا الشبكية مختلطة).

3. إضافة الغلوتامات الضغوطات إلى خلايا

  1. إعداد أحادية الصوديوم حمض تركيزات هيدرات الملح الضغوطات-L الجلوتاميك من 0-10mM في تنمو الكامل المناسبعشر وسائل الإعلام الثقافة.
  2. إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وغسل بلطف الخلايا 3 مرات مع PBS (PC12) أو HBSS (rMC1 وخلايا الشبكية مختلطة). يغسل بعد، إضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على الغلوتامات إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد.

4. الأولى جرعات من العلاج الخفيفة

  1. فور إضافة الغلوتامات أو الإجهاد في الاختيار، وفضح الخلايا لعلاج الضوء على موجات المطلوب وشدة عن طريق وضع تحت جهاز استعداد تسليم النور. تأكد من تغيير المخرجات كمي من شعاع ضوء باستخدام تركيبات الثابتة للمرشحات الكثافة محايدة اعتمادا على الطول الموجي تدار.
    ملاحظة: في التجارب الحالية، وتعريض الخلايا لعلاج الخفيفة لمدة 3 دقائق حفاظ على درجة الحرارة التي يستريح لوحات جيدا 96 على 37 درجة سادة C الحرارة. يجوز تغيير وقت العلاج على النحو المطلوب.
    1. وضع بطاقة سوداء ماتي تحت الخلايا لمنع الضوء المنعكس في الآبار المجاورة في-96 أهلا وسهلال علبة المخصصة لمعلمات العلاج الأخرى.
  2. إذا كان المطلوب العلاج لفترات أطول من الوقت، إضافة عازلة 25MM HEPES للحفاظ على درجة الحموضة وسائل الإعلام ثقافة الخلية أو من الناحية المثالية، ووضع لوحات الأجهزة والعلاج داخل حاضنة مع CO 2 تركيز ينظم إلى 5٪ CO 2، أو الظروف التي هي الأمثل لنوع خلية معينة.
  3. وبعد الانتهاء من العلاج الخفيفة، ووضع الخلايا على سطح مستو واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (أو أيا كان الظروف المثالية للنوع من الخلايا) ل24H.
    ملاحظة: يمكن أن تدار جرعات إضافية من R / NIR-LT كما هو موضح أعلاه، كما تريد.

5. النهائي جرعة من العلاج الضوء والكشف عن ROS

  1. قبل تنفيذ الجولة الاخيرة من العلاج الخفيفة، وإعداد الكواشف لاستخدامها للكشف عن ROS. إعداد 50MM عازلة سيترات (pH6.0)، تريتون X100، وH 2 O 2 كشف كاشف العمل(نسبة 97 من 10MM H 2 O 2 الكشف عن حل الأسهم كاشف، و 10 U / مل البيروكسيديز الفجل، 50MM سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.0) 1: 2) حل. إعداد DCFH-DA بتركيز نهائي من 100μM في وسائل الإعلام المناسبة.
    ملاحظة: DCFH-DA كاشف للخلايا PC12 في وسائل الإعلام RPMI، DCFH-DA كاشف للخلايا rMC1 هو في وسائل الاعلام DMEM. لاحظ أن الكواشف كشف المتاحة تجاريا لها الحساسيات التفاضلية لROS محددة ويجب اختيارها بعناية الكواشف لتوفير المعلومات المطلوبة لتطبيق الفردية.
  2. إدارة العلاج الخفيفة إلى الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 4.1-4.1.2. يعالجون ضمان الخلايا مع المطلوب fluences / الأطوال الموجية للضوء.
  3. فورا بعد العلاج الخفيفة، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الغلوتامات ويغسل مرتين مع حل العازلة المناسب (للخلايا PC12، ويستخدم برنامج تلفزيوني وللخلايا rMC1، ويستخدم HBSS). إجراء فحوصات ROS على الخلايا على النحو التالي:
    1. H 2 O 2 2 لمدة 15 دقيقة. إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O 2 حل العاملة الكشف واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. قياس مضان باستخدام قارئ لوحة مع الطول الموجي الإثارة من 530nm الطول الموجي وانبعاث 480nm.
    2. DCF الفحص: إضافة 100 ميكرولتر من حل 100 ميكرومتر من DCFH-DA إلى كل من الآبار واحتضان لمدة 30min في في 37 ° C وCO 2 5٪. إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على 100 ميكرومتر DCFH-DA، ويغسل مع حل العازلة المناسب (كما هو موضح أعلاه) مرتين. إضافة 90 ميكرولتر من حل العازلة و 10 ميكرولتر تريتون X100 إلى كل من الآبار ويهز بلطف على شاكر المداري لمدة 30 ثانية قبل 15 دقيقة الحضانة عند 37 درجة مئوية. قياس DCF مضان المستمدة باستخدام قارئ لوحة مع الطول الموجي الإثارة من 480nm ويفل الانبعاثاتength من 530nm.
    3. صريحة ROS تقدر نسبة إلى تركيز البروتين من الخلايا المتبقية في الآبار، وذلك باستخدام مجموعة اللونية لقياس تركيز البروتين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع الإشارة إلى منحنى القياسية لحساب ملغم بروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم معايرة إخراج ضوء ألقاها في طول موجة من 670nm باستخدام مرشحات الكثافة محايدة من أجل أشرق الخلايا مع مجموعة من fluences تشمل جرعة من الضوء 670nm هو موضح سابقا أن تكون مفيدة في الجسم الحي (0.3 J / سم 2) 20. حيث بلغ عدد مرشحات الكثافة محايدة أمام مصدر الضوء زيادة، وشدة (W / م 2) انخفضت، مما يسمح أقل ضوء بالمرور إلى المنطقة المستهدفة. ويعرض الجدول 1 بيانات المعايرة الضوء 670nm المولدة من مصدر الضوء مزودة مرشح الطول الموجي ويتضمن عدد من المرشحات ND المس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد تكيفت بنجاح نظام تسليم ضوء دقيقة ومحسوبة لتوفير آلية لدراسة تعظيم الاستفادة من R / NIR-LT في المختبر. الطول الموجي وشدة معالم R / NIR-LT قادرين على معالجته بدقة وفاعلية استخدام هذا النظام. أنشأنا أن العلاج الخفيفة من الخلايا لم تؤدي إلى موت الخلايا، على الرغم من ROS لم انخفاض في الأطوال الموجية وجرعات تسليمها، في أنواع الخلايا التي تم اختبارها. الحد الأقصى للكثافة من قبل النظام الحالي الذي تحقق في 670nm (20.11W / م 2) هي التي تزيد من التدابير التي تم نشرها ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج أبحاث الصدمات العصبية (أستراليا الغربية). يتم تمويل هذا المشروع من خلال حساب الثقة لصدمات الطرق ، ولكنه لا يعكس وجهات نظر أو توصيات مجلس السلامة على الطرق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
OxiSelect مجموعة فحص ROS داخل الخلايا (مضان أخضر)Cell BiolabsSTA-342
Amplex UltraRed الكاشفالمجسات الجزيئيةA36006
300 وات مصباح زينون قوسنيوبورت كوربوريشن6258مصدر ضوء مكثف للغاية ، لا تنظر مباشرة إلى المصباح. تأكد من وجود تبريد كاف للمصباح أثناء تشغيله
USB4000-FL Fluorescence SpectrometerOcean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector لجمع الانبعاثاتOcean Optics
200 & mu ؛ متر قطر الكوارتز الألياف البصريةالبصريات
SpectraSuite منصة التحليل الطيفيبصريات
2300 قارئ الألواح متعدد الأوضاعEnSpire Perkin Elmer
Pierce BCA Protein AssayKit Thermo Scientific23225
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1سمية حادة ، ارتد القفازات عند المناولة.
حمض L-Glutamic أحادي الصوديوم هيدرات الملحSigma-Aldrich142-47-2 (اللامائية)
ورم القواتم الفئران النخاع الكظري (PC12) خلاياالنوع الأمريكي مجموعة الثقافةCRL-2522
معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI1640) MediaGibco11875-119
مصل الأبقار الجنيني ، معتمد ، معطل بالحرارة ، أمريكيالأصل Gibco10082-147دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
مصل الحصان ، نيوزيلندا الأصلGibco16050-122دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
مكمل GlutaMAXGibco35050-061دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
100 ملي بيروفات الصوديومجيبكو11360-070دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
البنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)جيبكو15140-122دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
100X MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco11140-050دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
شبكية العين مولر (rMC1)جامعة كاليفورنيا ، سان دييغو
دولبيكو النسر المتوسط المعدل (DMEM)جيبكو11965-118دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
75 سم 2< / sup> قواريرBD BiosciencesB4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromideSigma-Aldrich25988-63-0Aliquot وتخزينها عند -20 درجة ؛
الملح المتوازن من هانك (HBSS)جيبكو14025-134دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Gibco10010-049دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
بروتين الفأر Laminin ،Gibcoالطبيعي 23017-015Aliquot وتخزينه في -20 درجة ؛ C
1X Neurobasal متوسطGibco21103-049دافئ إلى 37 درجة ؛ C في حمام مائي قبل الاستخدام
محلول Trypan Blue ، 0.4٪Gibco15250-061
165U PapainWorthington
L-CysteineSigma-AldrichW326305
Corning 96 لوحة بئر ، قاع شفاف ، أسودCorningCLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates غير معالج ؛ شكل جيد: دائري. عقيم.كوستار07-200-103
أرجوحة الروكالمختبر القياسي epuipment
الطرد المركزيالمختبر القياسي epuipment
ورق ترشيح الكثافة المحايدة (0.3)THORLABS
442 نانومتر مرشح ممر النطاقTHORLABSFL441.6-10
550 نانومتر مرشح ممر النطاقTHORLABSFB550-10
670 نانومتر مرشح ممر النطاقTHORLABSFB670-10
810 نانومتر مرشح ممر النطاقTHORLABSFB810-10e
غير مثبت & Oslash ؛ مرشحات الكثافة المحايدة الماصة 25 مم (0.1)THORLABSNE01B
غير المثبتة & Oslash ؛ مرشحات الكثافة المحايدة الماصة 25 مم (0.2)THORLABSNE02B
غير مثبتة & Oslash ؛ مرشحات الكثافة المحايدة الماصة 25 مم (0.3)THORLABSNE03B
غير مثبتة & Oslash ؛ مرشحات الكثافة المحايدة الماصة 25 مم (0.5)THORLABSNE05B
غير مثبتة & Oslash ؛ مرشحات الكثافة المحايدة الماصة 25 مم (0.6)THORLABSNE06B
غير مثبتة & Oslash ؛ مرشحات الكثافة المحايدة الماصة 25 مم (1.0)THORLABSNE10B
المحيطاتالمحيط خلايا محلول جهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
  2. Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
  3. Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
  4. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
  5. Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
  6. Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
  7. Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
  8. Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
  9. Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257(2012).
  10. Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
  11. Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828(2013).
  12. Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
  13. Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
  14. Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
  15. Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
  16. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
  17. Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
  18. Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
  19. Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
  20. Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
  21. Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002(2013).
  22. Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
  23. Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DCFH DA H2O2

مقالات ذات صلة