يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

7.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52224

⸱

سبتمبر 25, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

في هذه المقالة

ملخص

تنظيم المغذيات باستخدام التغذية المعدلة للنمو المستمر يحسن معدلات نمو كرويات خلايا الثدييات مقارنة بالتغذية الدفعية المتقطعة للمزارع في المفاعلات الحيوية المعلقة المقلوبة. توضح هذه الدراسة الطرق المطلوبة لإنشاء مزارع تغذية بمعدل معدل.

الملخص

في هذا العرض التوضيحي ، تم استزراع الكرويات المتكونة من خط خلايا الورم الجزيري β-TC6 كنموذج لتصنيع منتج خلية جزيرة الثدييات لتوضيح كيف يمكن لتنظيم مستويات المغذيات تحسين غلة الخلايا. في الدراسات السابقة ، سهلت المفاعلات الحيوية زيادة أحجام الزراعة على الثقافات الساكنة ، ولكن لم يتم ملاحظة أي زيادة في غلة الخلايا. يمكن أن تؤدي القيود المفروضة على العناصر الغذائية الرئيسية مثل الجلوكوز ، والتي تم استهلاكها بين الوجبات الدفعية ، إلى قيود في توسع الخلايا. لوحظت تقلبات كبيرة في مستويات الجلوكوز ، على الرغم من الزيادة في تركيزات الجلوكوز في الوسائط. أدى استخدام أنظمة التغذية المستمرة إلى القضاء على التقلبات في مستويات الجلوكوز ، وتحسين معدلات نمو الخلايا عند مقارنتها بطرق الزراعة الثابتة وSSB التي يتم تغذيتها على دفعات. لوحظت زيادات إضافية في معدلات النمو من خلال تعديل معدل التغذية بناء على استهلاك المغذيات المحسوب ، مما سمح بالحفاظ على الجلوكوز الفسيولوجي على مدى ثلاثة أسابيع في المزرعة. يمكن أيضا تكييف هذه الطريقة مع أنواع الخلايا الأخرى.

المقدمة

من أجل توليد أعداد كبيرة من الخلايا البشرية قابلة للحياة وظيفية للزرع، وتنظيم شروط الثقافة أمر حتمي. استنزاف المواد المغذية، جنبا إلى جنب مع تراكم النفايات الأيضية والمساهمين الرئيسيين في الشيخوخة والتغييرات الأيضية التي تقلل من جودة المنتج الخلية 1-3. يوضح هذا الإجراء وسيلة لخلايا الثدييات الثقافة في الكروية باستخدام مفاعل حيوي أثار جنبا إلى جنب مع نظام تغذية معدل نضح المعدل لتنظيم الجلوكوز في مجموعة الفسيولوجية 4 طوال مدة الثقافة. لغرض هذه الدراسات، تم تعريف نطاق الفسيولوجية كما بين 100 و 200 ملغ / دل. الأساليب نفسها يمكن استخدامها لتنظيم المواد المغذية الأخرى والنفايات الأيضية مثل اللاكتات.

وتستخدم - (30 مل 1) عادة في إعداد مختبر للحفاظ على وتمييز خطوط الخلايا لexperime الثقافات ثابتة في أحجام صغيرةأغراض ntal. يتم تنفيذ الركض الخلايا مع التغيرات المتوسطة كاملة حسب الحاجة، على فترات منتظمة. معظم "التقليدية" مستنبت يحتوي على نسبة الجلوكوز المرتفع (450 ملغ / دل لDMEM المستخدمة في هذه الدراسات) للسماح للتغييرات متوسطة أقل تواترا دون التعرض لخطر القيود الغذائية. ومع ذلك، وهذه الطريقة الرضاعة دفعة لا يزال يتطلب التلاعب المتكرر، ويدخل التغير في البيئة الخلايا، ويزيد من خطر التلوث 5-9. المفاعلات الحيوية تعليق أثار (SSB) تقدم أفضل خلط وانخفض التعامل مع 3،10 - 20، ولكن مثل الثقافات ثابتة، سوف يتطلب تغييرات المتوسطة اليدوية التي تسهم في التقلبات الضارة المحتملة في مستويات المنتجات الغذائية والنفايات. التغذية نضح من الثقافات SSB يقلل تبقى هذه المشاكل عن طريق التسريب المستمر وإزالة المتوسطة، ولكن تغييرات كبيرة في مستويات المواد الغذائية بسبب نمو الخلايا قضية. استخدام وسيلة را التغذية المعدلالشركة المصرية للاتصالات من حسابات استخدام المواد الغذائية على أساس الاحتياجات خلية يقدر يمكن أن توفر بيئة مستقرة الخلية المطلوبة لتحسين بقاء الخلية وتعمل 21-24.

وهناك مجموعة كبيرة من المؤلفات التي تصف طرق للثقافات SSB قابلة للخلايا الثدييات على وجه التحديد للثقافة والتوسع في الخلايا المحفزة 25 - 32، مع الآخرين تركز على جزيرة (بيتا) خلايا 17،33،34، أو إنتاج المنتجات البيولوجية 24، 35-38. العديد من هذه الأنواع خلية التحقيق قد نمت في الثقافات كروي، ويجب أن يكون الأمثل إجراءات محددة لنوع من الخلايا المستخدمة قبل تطبيق نظام التغذية المستمر. في هذه المظاهرة، واستخدمت طريقة التغذية نضح لتوسيع خط خلايا بيتا كما نمت الكروية في مفاعل حيوي أثار 39-43. الطريقة الموصوفة هنا يوفرتنفيذ مباشر لتغذية تعديلات سعر استنادا إلى قياسات الجلوكوز خارج الشبكة لتحقيق الظروف والثقافة المستهدفة. ضبط معدل التغذية مع هذه الطريقة للحفاظ يظهر مستوى الجلوكوز الفسيولوجية لعائدات الخلوي الزيادات. خلايا الثدييات هي التي تعتمد على المواد الغذائية الرئيسية، والجلوكوز، لإنتاج الطاقة، وبالتالي فإن استخدام هذا الخط الخلية يمثل نموذجا للعديد من خلايا الثدييات مثقف 44. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الخط مثالا على تعقيد مزيد من خلايا بيتا، التي تعتبر حساسة لمستويات عالية مزمنة من الجلوكوز 45. لهذه الدراسة، تم السماح للخلايا β TC6 لتشكيل الأجسام الشبه الكروية في الثقافة لتقريب متوسط حجم الجزر لانجرهانز في الجسم الحي. نظام مفاعل حيوي نضح 17 - 19،21،46 مع معدل التغذية تعديلها لالجلوكوز الاستهلاك، أدى في الحفاظ على الظروف الفسيولوجية وعوائد الخلية أعلى من دون تغيير في قدرتها على البقاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. خط الخلية والصيانة

  1. الحصول على الخلايا β TC6 (أو غيرها من خط خلية الثدييات ملتصقة المطلوب). في إطار التحضير للدراسة، والثقافة، والمرور، وcryopreserve الخلايا وفقا لتعليمات مزود.

2. تجميع نظام التغذية المستمر

ملاحظة: مستمر تصميم نظام التغذية في الأسلوب أدناه يستند إلى أنظمة مشابهة وصفها في المؤلفات 17 - 19،21،47 - 49. وصفت جمعية النظام المستخدم هنا في التفاصيل في منشور السابق 3.

  1. جمع العناصر اللازمة لنظام التغذية الذي يتكون من خمسة عناصر رئيسية هي: خزان المتوسط، مضخة تحوي، مفاعل حيوي أثار، خزان النفايات، ومصمم خصيصا مجموعة أنابيب / أخذ العينات.
    1. إنشاء خزان المتوسطة باستخدام زجاجة 1 لتر الزجاج، وخزان النفايات باستخدام زجاجة 2 لتر، وstirreد مفاعل حيوي باستخدام مفاعل حجم كوب 250 مل (من النسخة الرف).
    2. استخدام مضخة تحوي الرقمية أو مضخة مماثلة مع رئيس مضخة 8 قنوات للسيطرة على صرف المتوسط.
    3. تصنيع الخزان والأغطية مفاعل حيوي معدلة من البلاستيك الصلب وautoclavable مع أنابيب الصلب غير القابل للصدأ تمر عبر الموانئ إلى توفير التهوية من خلال مرشحات معقمة، والسماح للنقل المتوسط ​​بين الخزانات والمفاعلات الحيوية. بدلا من ذلك، شراء الأغطية المتخصصة مع الموانئ تدفق من مختلف البائعين.
      ملاحظة: قد تحتوي على غطاء المفاعل الحيوي منافذ إضافية المار لأجهزة القياس اختياري وتحقيقات الرصد (على سبيل المثال، مراقبة الأكسجين).
    4. نعلق أنبوب تدفق (OT) ملفقة من مسامية أنابيب زجاجية تهوية مع متوسط ​​نطاق حجم المسام من 40 ميكرون إلى 60 ميكرون، وكثافة المسام من 40٪ إلى غطاء SSB تعديلها. بدلا من ذلك، اختيار أنبوب تدفق آخر استنادا إلى متطلبات معينة من الثقافة.
      ملاحظة: اخترOT حجم المسام لإزالة الوحيد المتوسطة والحطام الخلية، وترك المجاميع خلية في ثقافة (كما هو موضح في القسم 6 و نشر 3 لمزيد من التفاصيل).
  2. تجميع autoclavable مجموعات نضح أنابيب من فلوريد البولي فينيل (PVDF) وصلات الأنابيب ودائم تحوي أنابيب المضخة. ويبلغ طول القسم يعتمد على المسافة بين العناصر المختلفة.
    ملاحظة: عناية خاصة عند اختيار أنابيب متنوعة لضمان المتانة والموثوقية للالتجارب على المدى الطويل.
  3. تجميع أنابيب مجموعة من ثلاثة أجزاء: خط تغذية، خط النفايات، وخط العينة.
    1. تجميع خط تغذية باستخدام اثنين من أقطار الأنابيب (L / S 14 و L / S 13). استخدام L / S 14 للأنابيب الأساسي الذي سيمتد على مسافة واحدة من مفاعل حيوي إلى الخزان المتوسطة، وإدراج طول قصيرة من L / S 13 في منتصف طول الأنبوب لقسم مضخة باستخدام محولات PVDF المناسبة.
    2. استخدام معيار PVDF خرطوم الشائكة TUBIمحولات نانوغرام للانضمام قطعتين من L / S 14 الأنابيب على جانبي الباب مضخة أقصر (L / S 13) أنابيب.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، على طول الأنابيب يمكن أن يكون قطرها أصغر L / S 13 الأنابيب، ويمكن الاستعاضة عن طول الأنبوب بالكامل عندما سلامة القسم المضخة في السؤال.
  4. تجميع قسم أنابيب ثان لإزالة النفايات باستخدام أكبر قطر (L / S 16) أنابيب وإدراج مقطع قصير من L / S 14 الأنابيب في منتصف لقسم الضخ. ويتم ذلك في نفس الطريقة كما في خط تغذية التجمع تستخدم محولات خرطوم الشائكة PVDF، أو بدلا من ذلك يستخدم طول المستمر من المطلوب حجم مضخة وأنابيب، واستبدال حسب الحاجة.
    ملاحظة: إذا تم استخدام نفس المضخة ورئيس مضخة لدائرة التغذية ودائرة النفايات، يجب أن يكون القسم مضخة للخطوط أنابيب والتخلص من النفايات قطره أكبر من القسم مضخة من خط التغذية. وهذا يضمن أن معدل ضخ إزالة أسرع من معدل التغذية، وسوف تجنب قويةالاتحاد العالمي للتعليم عن تغييرات كبيرة في حجم والثقافة، والحد من مخاطر تجاوز.
  5. التجمع المكون النهائي للمجموعة أنابيب: جمعية جمع العينات.
    1. يصف هذا الإجراء مخصص تجميعها أخذ عينات النظام الميناء؛ بدلا من ذلك، يمكن شراء ميناء أخذ العينات المعقمة من مختلف البائعين.
    2. بناء مجموعة من ثلاثة قصيرة (~ 6 سم) L / S 14 أطوال الأنابيب المتصلة ببعضها البعض مع موصل PVDF T-نوع، واثنين من المشابك خرطوم صغير على اثنين من أطوال الأنابيب.
    3. نعلق مرشح الغاز معقم للتنفيس الغاز إلى واحدة من أطوال فرضت، ويستخدم الآخر للاتصال حقنة أخذ العينات المعقمة (قد تحتاج مرشحات الغاز العقيمة التي يمكن ان تضاف في خزانة السلامة البيولوجية بعد التعقيم العديد من الفلاتر عقيمة ليست autoclavable).
    4. قم بتوصيل الطرف الثالث لموصل عينة الفولاذ المقاوم للصدأ تعلق على غطاء من مفاعل حيوي.
    5. الأوتوكلاف تجميع العينات أثناء الاتصال إلى مفاعل حيوي قبل بدايةالتجربة (الرجوع إلى الخطوة 3 أدناه).
    6. استخدام هذا التجميع لجمع عينات معقمة من مفاعل حيوي حسب الحاجة دون الإخلال عملية تغذية مستمرة.

3. الأوتوكلاف جميع المواد

  1. تحضير جميع مكونات مفاعل حيوي لتعقيم الأوتوكلاف.
  2. جمع المكونات الفردية للتعقيم. المتوسطة والنفايات الخزانات (تجميعها من الخطوة 2.1.1)، 250 مل الدوار قارورة (تجميعها من 2.1.1)، والأغطية اللازمة المعدلة (تجميعها من 2.1.3)، أنبوب تدفق (الموصوفة في 2.1.4)، وثلاث مجموعات الأنابيب ( تجميعها في أقسام 2.2 through2.5)، أنبوب تدفق (حسب الحاجة لتغذية مستمرة).
    1. تجميع الدوار قارورة مع جميع المكونات وتأكد يتم إرفاق أنبوب تدفق بقوة داخل قارورة الدوار (الموصوفة في القسم 2.1.4)، وإرفاق مخصصة تجميعها ميناء أخذ العينات (القسم 2.5)، أو غيرها من ميناء أخذ العينات إلى الجزء العلوي من الغطاء .
    2. التفاف كامل التجمع الدوار قارورة مع السياراتالعصا المواد التفاف، والأوتوكلاف تشير الشريط. تأكد من أن التفاف محكم. ملاحظة: رقائق الألومنيوم أو مواد مشابهة يمكن استخدامها لتغطية الغايات الفردية لكل ميناء الوصول في غطاء مفاعل حيوي للحفاظ على عقم موصل / ينتهي عند إزالة التغليف وعندما غير متصل إلى مجموعات الأنابيب داخل الحاضنة.
    3. تجميع الأغطية معدلة من الخزانات المتوسطة والنفايات ومن ثم نعلق على قوارير زجاجية منها. تغطية لهم باستخدام رقائق الألمنيوم والأوتوكلاف تشير الشريط.
    4. التفاف على حدة مجموعات الأنابيب (قسم 2،2-2،5) مع التفاف الأوتوكلاف والشريط للمساعدة في التجميع النهائي. رقائق الألومنيوم أو مواد مماثلة يمكن استخدامها للالتفاف نهايات الفردية لكل أنابيب المقرر أن الحفاظ على عقم موصل / ينتهي عند إزالة التغليف.
    5. الأوتوكلاف جميع البنود ملفوفة باستخدام دورة الأوتوكلاف الجافة القياسية (على سبيل المثال، "الجاذبية" الإعداد مع ~ 15 رطل على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 30 دقيقة أو أكثر).
      ملاحظة: لا نعلق عقيمةمرشحات قبل التعقيم ما لم يتم تأكيدها أن تكون آمنة الأوتوكلاف.

4. تشكيل كروي

ملاحظة: هذه التقنية مشابهة لتلك التي وصفها في المؤلفات 17 - 19،21،50 - 52 لغيرها من الثقافات خلايا الثدييات. يجب أن تتم جميع الإجراءات التالية تعقيم في غطاء تدفق الصفحي واستخدام قفازات معقمة للحفاظ على ظروف معقمة للثقافة الخلية.

  1. لجميع الظروف، والثقافة، وتوسيع خلايا β-TC6 في الثقافات تمسكا القياسية (التي وصفها بائع) حتى نفاذ الكمية خلية كافية ويتم الحصول على البذور العدد المرغوب فيه من المفاعلات الحيوية.
    1. تجميع مفاعل حيوي التغذية المستمر مع أنبوب تدفق كما هو مبين في الشكل (1) وصفه في الباب 2، وربط ميناء أخذ العينات لغطاء أخذ العينات. ملاحظة: أنبوب تدفق وأخذ العينات التجمع ميناء ينبغي أن يضاف إلى bioreactأو لتغذية مستمرة قبل تشكيل كروي، ويجب أن يتم سحبها للخروج من مستنبت حتى يبدأ تغذية مستمرة.
    2. تعقيم التجمع SSB تعديلها من قبل الأوتوكلاف (الموصوفة في القسم 3).
    3. إرفاق فتحات معقمة (0.22 ميكرون أو أصغر المرشحات معقمة) إلى المواقع المناسبة على أغطية من القارورة الدوار، والسفن المتوسطة والنفايات.
      ملاحظة: وهذا أمر مهم لمنع قفل بخار، وتتيح تبادل الغاز بين الحاضنة (CO 2 5٪) البيئة ومفاعل حيوي. تبادل الغاز ضروري للحفاظ على درجة الحموضة الصحيحة عند استخدام وسائل الإعلام مخزنة بيكربونات.
  2. جمع الخلايا عن طريق trypsinization لطيف باستخدام 0.25٪ (ث / ت) حل Trypsin- 0.53 ملي EDTA، في درجة حرارة الغرفة وساعد على الإثارة الميكانيكية ل2-3 دقائق، والبذور في المفاعلات الحيوية في مناطق ذات كثافة من حوالي 1.3 × 10 6 خلية / مل في 200 مستنبت مل.
    1. نقل قوارير المعينة من الحاضنة وفي مجلس الوزراء الحيوية السلامة.
      ملاحظة: يجب أن يتم كل خلية ثقافة والتلاعب في مجلس الوزراء الحيوية السلامة باستخدام تقنية معقمة المناسبة.
    2. إزالة مستنبت من قوارير بواسطة الشفط.
    3. غسل الخلايا بواسطة pipetting 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم ++)، في قارورة، والشطف عبر الخلايا على السطح، ثم نضح برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة 3 مل من محلول التربسين-EDTA لكل قارورة التي سيتم جمعها (عادة حوالي 10X 175 سم 2 T-قوارير).
    5. تسمح للخلايا المقطوع لاحتضان في درجة حرارة الغرفة ل2-3 دقيقة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
    6. تستنهض الهمم بلطف باليد لتخفيف الخلايا من سطح القارورة، وجمع الخلايا عن طريق إضافة 6 مل من مستنبت (مع المصل) إلى القارورة، ونقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل. عند واحد 50 مل أنبوب مليء، استخدام أنبوب 50 مل أخرى إلى أن يتم جمع كافة الخلايا الحاجة (تقريبا سوف تكون هناك حاجة إلى أنبوب واحد 50 مل لكل 5 T-175 قواريرجمع).
    7. بلطف أجهزة الطرد المركزي (حوالي 50 × الجاذبية) تعليق خلية التي تم جمعها لخلايا بيليه.
    8. نضح المتوسطة المتبقية ترك بيليه سليمة.
    9. جمع كل من الخلايا في أنبوب واحد من خلال إعادة تعليق-الكريات في الثقافة المتوسطة (التي تحتوي على مصل) باستخدام ماصة، ونقل جميع الكريات في نفس الأنبوب.
    10. عد كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات القياسية مع تلطيخ التريبان الأزرق كما هو موضح في الأدب 53.
    11. إضافة العدد المطلوب من مجموع الخلايا إلى عقيمة SSB لكل حالة (كانت 1.3 × 10 6 خلية / مل كثافة الخلية انطلاق المستهدفة لهذه التظاهرة).
    12. إضافة المتوسطة (مع تركيز الجلوكوز المطلوب، في هذه الحالة كنا مستويات الجلوكوز المتوسطة ضمن نطاق الفسيولوجية) لSSB باستخدام ماصة للوصول إلى حجم ثقافة الكلي المطلوب (تم استخدام 200 حجم مل الثقافة لهذه الدراسات).
      ملاحظة: للحصول على هذه تغذية مستمرة يدرس SSB على مكعب وكانت المصنفة ltures باستخدام المعدلة "الجلوكوز المنخفضة" نسخة من مستنبت (100 ملغ / دل). هذا ما سمح للثقافات لبدء في تركيز السكر في الهدف المنشود بدلا من البدء مع "ارتفاع السكر" المتوسطة والانتظار لاستهلاك الجلوكوز لتحقيق مستويات الجلوكوز إلى أسفل داخل نطاق الفسيولوجية للبدء في تغذية. كل وسيلة أخرى لإطعام في هذه الدراسات استخدام معيار "ارتفاع السكر" المتوسطة (500 ملغ / دل).
    13. نقل SSB مع الخلايا إلى لوحة ضجة داخل حاضنة الثقافة الخلية.
  3. خلايا الثقافة في المفاعلات الحيوية بدون تغذية لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2، الرطوبة النسبية 100٪، ومعدل ضجة من 70 دورة في الدقيقة للسماح الكروية لتشكيل.
    ملاحظة: يجب أن يلاحظ أي انتشار كبير خلال فترة تشكيل كروي لمدة ثلاثة أيام.
  4. بعد تشكيل كروي، تقسيم الكروية بين المفاعلات الحيوية مع الظروف الثقافة المطلوبة.
لو "> 5. الثقافة تغذية مستمرة والمعدل تغذية تقييم

  1. الأوتوكلاف أو الغاز تعقيم كافة المكونات، والتجمع في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام تقنيات معقمة (الخطوات 2-4).
  2. بعد تشكيل كروي، وإزالة SSB من الحاضنة وتجميع مكونات نظام التغذية المستمر في خزانة السلامة البيولوجية.
    1. أولا ملء الخزان المتوسطة الطازجة مع مستنبت المطلوب، ومن ثم الاتصال على جانب واحد من خط تغذية. أيضا التأكد من أن الخزان المتوسطة الطازجة وتنفيس بشكل صحيح مع تصفية العقيمة.
    2. ربط جانب واحد من خط تغذية لمدخل الميناء تتغذى على مفاعل حيوي بطريقة معقمة. يجب تثبيت مرشح العقيمة بين خط تغذية وميناء مفاعل حيوي مدخل لتصفية المتوسطة قبل أن يدخل مفاعل حيوي.
    3. ربط خط النفايات إلى أنبوب مفاعل حيوي تدفق وخزان النفايات المتوسط، والتأكد من أن خزان النفايات وتنفيس بشكل صحيح مع STERILالبريد التصفية.
  3. نقل الجمعية من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (وهذا ربما تتطلب شخصين لتنفيذ كل ما من السفن والأنابيب)، ووضع كل المكونات خارج للثقافة على المدى الطويل.
    1. وضع SSB على لوحة ضجة داخل الحاضنة باستخدام المعلمات الثقافة نفسها لتشكيل كروي (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، 100٪ الرطوبة و 70 دورة في الدقيقة). ملاحظة: قد يكون من الضروري لقطع مؤقتا شرائح أنابيب من مفاعل حيوي إذا في حاجة إلى خطوط لتشغيل من خلال الثقوب في جانب من الحاضنة وليس من خلال طوقا في الباب. ويمكن أن يتم ذلك بطريقة معقمة عن طريق لف نهايات مجموعات الأنابيب مع رقائق الألومنيوم قبل التعقيم (الخطوة 3)، وينتظر أن نعلق على الجانب مفاعل حيوي من الأعلاف وأنبوب النفايات أقسام حتى مفاعل حيوي هو داخل الحاضنة. خطوط الأنابيب يمكن وضعها في مكان، ويمكن إزالتها رقائق الألومنيوم داخل الحاضنة وبسرعة تعلق على مفاعل حيوي.
    2. تشغيل الغايات المتبقية من مجموعات الأنابيب (تلك لا علاقة لها غطاء مفاعل حيوي) من خلال ميناء الوصول حاضنة (المار)، أو من خلال الشق في طوقا باب الحاضنة.
    3. خارج الحاضنة (في خزانة السلامة البيولوجية قريب إن أمكن)، وسرعان ما ربط خط تغذية إلى الخزان المتوسطة الطازجة، والخط النفايات إلى خزان النفايات المتوسط، والتأكد من أن خزان النفايات وتنفيس بشكل صحيح مع تصفية العقيمة. ملاحظة: للقيام بذلك بطريقة معقمة، وإزالة رقائق الألومنيوم من الأنابيب والأوعية الروابط والاتصال في الأوعية منها في أسرع وقت ممكن (وخاصة إذا كان يحتاج هذا الصدد إلى أن يتم ذلك خارج مجلس الوزراء السلامة البيولوجية).
    4. وضع خزان المتوسطة الطازجة (مليئة المتوسطة تغذية الرغبة) داخل القريبة مصغرة الثلاجة. تحقق للتأكد من أن خطوط تغذية والنفايات قادرة على الخروج من الحاضنة وتدخل الثلاجة دون أن يمنع ذلك الأبواب على كل من الإغلاق. ومن الأهمية بمكان أيضا أن تغذية للا مقروص مغلقة إيناس من أبواب إما الثلاجة أو الحاضنة.
      وكانت الوسيلة المستخدمة لهذه الدراسات مستنبت معيار ارتفاع نسبة الجلوكوز (500 ملغ / دل) أوصت به البائع لهذا نوع من الخلايا: ملاحظة. ويمكن استخدام أي ارتفاع متوسط ​​الجلوكوز على أساس الاحتياجات المحددة لنوع من الخلايا المستزرعة. يجب أن يكون تركيز الجلوكوز في المتوسط ​​تغذية أعلى إلى حد معقول (2X أو أكثر) من التركيز المطلوب في الثقافة كما يعتمد نظام التغذية على زيادة معدل التغذية المتوسطة ارتفاع نسبة الجلوكوز للحفاظ على مستويات الجلوكوز الكافية في الثقافات مع الحفاظ على معدلات التغذية معقولة .
    5. بعد ذلك، الخزان المتوسطة النفايات يمكن وضعها على رأس مقاعد البدلاء خارج الحاضنة في موقع مناسب.
    6. بعد ذلك، وضع قسم "مضخة" من الأعلاف والمخلفات خطوط في الرأس مضخة ضمان التوجه السليم بحيث تكون خطوط تغذية سيضخ المتوسطة من الخزان المتوسط ​​جديدة في SSB، وخطوط النفاياتستضخ المتوسطة من SSB وإلى الخزان المتوسطة النفايات.
  4. تشغيل المضخة إلى معدل التغذية المطلوبة.
    1. حساب معدل التغذية باستخدام المعادلة معدل التغذية المعدلة وصفها في المؤلفات 3 وفي قسم النتائج تمثيلية الواردة أدناه.
    2. استخدام أحدث المعلومات عدد خلايا (الإجراء الموضح في الخطوة 5) جنبا إلى جنب مع التنبؤ النمو، وقياس الجلوكوز المتوسطة لتقدير معدل التغذية اللازمة للحفاظ على تركيز الجلوكوز المطلوب في الثقافة.
      ملاحظة: إن معدلات نمو الخلايا ومعدلات استهلاك الجلوكوز في حاجة الى الحصول عليها قبل القيام بهذه الإجراءات.
    3. ضبط سرعة المضخة على أساس معدل التغذية المحسوب.
  5. كرر حساب معدل التغذية وضبط سرعة مضخة لكل نقطة أخذ العينات (كل ثلاثة أيام للأسلوب وصفه).

6. التهم الخلية، الجدوى، وقياسات تركيز الجلوكوز

<رأ>
  • جمع عينات من كل مفاعل حيوي كل ثلاثة أيام، أو كما تريد.
  • أخذ عينات ثقافة من الثقافات SSB تغذية بشكل مستمر باستخدام منفذ أخذ العينات المتخصصة المذكورة أعلاه.
    1. ترك SSB تغذية مستمرة داخل مفاعل حيوي، ونعلق محقنة معقمة (تم استخدام حجم حقنة 5 مل لهذه الدراسات) للاتصال تصفيتها الامم المتحدة للميناء أخذ العينات.
    2. نقل أنبوب أخذ العينات وصولا إلى مستنبت.
    3. Unclamp قسم أنبوب الذهاب إلى الحقنة، وسحب مجموع حجم العينة المطلوبة.
    4. نقل العينات أنبوب حتى أن لم تعد هي غارقة في الثقافة، والاستمرار في سحب الحقنة حتى تتم إزالة الهواء.
    5. المشبك الأنبوب الذي يغذي حقنة، وفصل حقنة تحتوي على العينة، ويوضع جانبا.
    6. قبل تحميل محقنة معقمة جديدة ثانية مع الهواء، ونعلق على الجانب تصفية العقيمة من ميناء أخذ العينات.
    7. Unclamp أنبوب الذهاب الى الجانب حقنة مرشح للميناء أخذ العينات، ثم تطهير ميناء أخذ العينات عن طريق طرد بلطف الهواء في حقنة من خلال تصفية العقيمة. هذا يضمن أن ميناء أخذ العينات سوف تكون واضحة من أي وسيط المتبقية.
    8. إعادة المشبك أنبوب يذهب إلى التصفية، افصل محقنة معقمة وتخلص منه.
  • أخذ الحقنة التي تحتوي على عينة خلية من الثقافة، وإخراجها في أنبوب 10 مل. يمكن أن تؤخذ عينات فرعية من وحدات التخزين المعروفة مباشرة من هذا الأنبوب.
  • لتعداد خلايا، إزالة يعرف حجم الخلايا ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، وأجهزة الطرد المركزي بلطف لمدة 1-2 دقيقة (حوالي 50 × الجاذبية).
  • نقل طاف لأنبوب منفصل لقياس الجلوكوز، وإعادة تعليق بيليه مع نفس الحجم من الحل التربسين-EDTA (0.25٪ (ث / ت) التربسين، 0.53 ملي EDTA)، والاعتماد في ثلاث نسخ باستخدام عدادة الكريات القياسية مع التريبان تلطيخ الأزرق كما هو موضح في الأدب 53.
    1. إضافة المتوسطة (مع المصل) لالعينة للتخفيف عند الضرورة.
    2. عد الخلايا، وحساب بقاء الخلية عن طريق تسجيل الحية الخلايا (غير ملوثين)، والميتة (الملون) الخلايا بشكل مستقل (الجدوى٪ = الخلايا الحية / مجموع الخلايا).
  • قياس مستويات السكر المتوسطة في ثلاث نسخ باستخدام مقياس الجلوكوز في الدم وتستخدم مرة واحدة اختبار شرائط.
    1. أخذ قياسات الجلوكوز كما هو موضح بالتعليمات متر الجلوكوز استبدال مستنبت للدم.
    2. تراجع شريط الاختبار في المتوسط ​​لفحصها (جمعت من عينات العد أعلاه)، وكرر لالعدد المرغوب فيه من مكررات (ينصح ثلاثة مكررات).
    3. اختبار كل وسيلة جديدة والمتوسطة النفايات لتركيزات الجلوكوز.
      ملاحظة: للحصول على بضعة أمتار، والقياسات أقل من 20 ملغ / ديسيلتر (عتبة كشف للمتر)، يمكن ملاحظة أنه خطأ في إخراج متر.

    • 7. كروي القياسات توطين السعر

    1. لضمان سللم يتم إزالة تجمعات ل من خلال نظام التغذية المستمر، وقياس معدل ترسيب الكروية-β TC6 من خلال مراقبة الترسيب في ماصة قطر بلاستيكية كبيرة.
    2. ثقافة الخلايا β-TC6 في المفاعلات الحيوية SSB لتشكيل الأجسام الشبه الكروية كما هو موضح أعلاه.
    3. بعد 3 أيام من الثقافة، ويستغرق 30 مل عينات من تعليق كروي ومكان في أنبوب 50 مل.
    4. الماصة بلطف صعودا ونزولا باستخدام اسعة قطرها 25 مل ماصة لتوزيعها بالتساوي في تعليق، ثم توقف pipetting لمع تعليق على المستوى المعروفة في الماصة (على سبيل المثال، 20 مل علامة)، ومن ثم تسجيل الوقت لجميع الكروية ل تسوية 5 سم.
    5. كرر هذا الإجراء مرات كافية لتحقيق الثقة الإحصائية (عادة ن> 3).
      ملاحظة: للحصول على الدراسات البيولوجية، يعتبر قيمة ا ف ب أقل من 0.05 إلى تكون ذات دلالة إحصائية عند مقارنة القياسات. وقد استخدم الخطأ المعياري للمتوسط ​​للأخطاء التقارير، واثنين من الذيل يقترن الامم المتحدة طالب تي اختباركان يستخدم لمقارنة الظروف للبيانات المقدمة.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    مستويات الجلوكوز المتوسطة والتقلبات تقييد التوسع خلية في الثقافات ستاندرد SSB

    مستويات الجلوكوز تتقلب في الثقافات ثابتة والثقافات SSB طوال فترة ثقافة 3. هذه التقلبات تكثف مع زيادة عدد الخلايا خلال الفترة الثقافة لمدة 21 يوما، وكانت متطابقة تقريبا في كل الثقافات ثابتة وSSB. وتعرض هذه الملاحظات في المنشور السابق لدينا 3. يمكن للمستويات الجلوكوز تكون فائقة الفسيولوجية لمدة الفتر...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    توليد منتجات خلايا الثدييات لإنتاج العوامل البيولوجية ولعلاجات الخلايا يتطلب ثقافة ورصد خلايا الثدييات في نطاق واسع 55-58. وعلاوة على ذلك، تدعو هذه التطبيقات لظروف ثقافة محددة والتحقق من صحتها. ببساطة زيادة حجم الخلايا باستخدام تقنيات الأبحاث لن تلبية كل هذه المتطلبات. التغييرات المتوسطة اليدوية تسبب تقلبات في المواد الغذائية وتراكم النفايات تقلل من جودة الخلية، الجدوى والعائد. ثبوت استخدام المفاعلات الحيوية بشكل جيد للثقافة تجارية من الكائنات الحي...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

    شكر وتقدير

    يشكر المؤلفون مايكل جاروود وسام شتاين على تعليقاتهم المفيدة ، وكريستين إم ماينارد للمساعدة في إعداد المخطوطة.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    β TC-6 CellsATCC ، Manassas ، VACRL-11506خط خلايا الأنسولين للفأر (نوع الخلية الملتصقة)
    DPBS No Ca ، No MgInvitrogen ، Carlsbad ، CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144؟ ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CAانظر أدناه للحصول على أرقام المنتجات 
    DMEM عالي الجلوكوز (500 ملم)Invitrogen ، Carlsbad ، CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092< / a>
    DMEM منخفض الجلوكوز (100 ملم)Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (لاحظ أن هذه الوسيلة تحتوي بالفعل على البيروفات)
    L-glutamineInvitrogen، Carlsbad، CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081؟ ICID = search-product < / a >
    Sodium PyruvateInvitrogen ، Carlsbad ، CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070؟ ICID = search-product< / a>
    مصل الخنازير المعطل بالحرارةGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147< / a>
    Trypsin-EDTAInvitrogen ، Carlsbad ، CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056؟ ICID = search-product< / a>
    T-150 قوارير معالجة بزراعة الأنسجةكورنينج ، كورنينج ، نيويورك430825http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825 (علوم الحياة)
    & categoryname =
    حاضنة زراعة خلية NuAireبرينستون ، مينيسوتاالولايات المتحدة Autoflow. يمكن استخدام أي حاضنة لزراعة الخلايا CO2< / sub> مغلفة بالماء.
    طرد مركزيSorvall RT 7 (يمكن استخدام أي جهاز طرد مركزي مماثل على الطاولة)
    ثلاجةاستخدام أي ثلاجة مختبرية (تم استخدام نسخة صغيرة من سطح الطاولة لهذه الدراسات)
    1 لتر زجاجةزجاجية Corning ، Corning ، NY1395-1Lيمكن استخدام أي بائع. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L (علوم الحياة)
    & categoryname =
    2 لتر زجاجة زجاجيةCorning ، Corning ، NY1395-2Lيمكن استخدام أي بائع
    250 مل من المفاعلات الحيوية المقلوبة   ؛كورنينج ، كورنينج ، نيويورك4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(علوم الحياة)
    & categoryname=
    Stir PlateFisher Scientific11-496-104Aاستخدام أي لوحة تحريك آمنة للحاضنة ، أي بائع
    أطباق زراعة الأنسجة 100 مم قطرNunc ، روتشستر ، نيويورك (فيشر العلمية)1256598 يمكن استخدام أي بائع (يتم طلبه من خلال Fisher Sci)
    فالكون 50 مل أنابيب مخروطيةفالكون ، سان خوسيه ، كاليفورنيا1256598يمكن استخدام أي بائع
    Delran Plastic المستخدم لقطع الغيارالمخصصة McMaster Carrمختلف يمكناستخدام أي مادة من اختيارها ، ولكن يتم اختيار Deran لأنها آمنة للأوتوكلاف وغير تفاعلية وسهلة التصنيع. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ للأغطية المخصصةMcMaster Carrمتنوعةيمكن استخدام أي بائع. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    أغطية المفاعل الحيوي Delran المعدلة حسب الطلب للتغذيةمخصصة غير مدركة لأي بائعين ينتجون منتجا مشابها
    أغطية زجاجات زجاجية معدلة مخصصة للتغذية المستمرةمصنوعةحسب الطلب بعض البائعين ( على سبيل المثال < / em> ، Fischer Sci ، Corning) يصنعون منتجات مماثلة في الروابط أدناه.
    مضخة التمعج الرقمية Masterflexكول بارمر ، فيرنون هيلز ، إلينويEW-77919-25يمكن استخدام أي مضخة تمعجية دقيقة. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC / EW-77919-25
    موصلات أنابيب PVDF (مختلفة)كول بارمر ، فيرنون هيلز ، إلينويانظر الرابطيمكن استخدام أي بائع. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings / 55889
    Pharmed BPT Tubing L / S 16Cole Parmer ، Vernon Hills ، ILWU-06508-16يمكن استخدام أي بائع. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25 / WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L / S 14Cole Parmer ، Vernon Hills ، ILWU-06508-14يمكن استخدام أي بائع. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25 / WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L / S 13Cole Parmer ، Vernon Hills ، ILWU-06508-13يمكن استخدام أي بائع. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25 / WU-06508-13
    غشاء Millipore Millex GP PES 0.22 &# 181 ؛ ل مرشح حقنة معقمة (يستخدم للتنفيس والترشيح المتوسط)فيشر SLGP033RS العلمياستخدام أي بائع
    25 مل ماصة متدرجةفيشر Scientific13-678-11يمكن استخدام أي بائع ، ويمكن استخدام أحجام
    مختلفة PipetterFisher Scientific13-681-15Eاستخدام أي بائع أو منتج مشابه
    الدمFisher Scientific02-671-6يمكن استخدام أي بائع أو منتج مشابه
    Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061يمكن استخدام أي بائع أو منتج مشابه. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    المجهر الضوئي المقلوبلايكايمكن استخدام أي بائع أو منتج مشابه
    بلمسة واحدة لجهاز قياس نسبة الجلوكوز في الدمFisher Scientific22-029-293يمكن استخدام أي بائع أو منتج مشابه (على سبيل المثال< / i> ، Bayer)
    Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292  ؛يمكن استخدام أي بائع أو منتج مشابه (على سبيل المثال< / i> ، Bayer)
    جهاز يمكن يمكن المستمرة يمكن يمكن مقياس One

    المراجع

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611(2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262(2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    الوسوم

    تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية
    تواصل معنا
    أوصِ به للمكتبة

    الخصوصية

    شروط الاستخدام

    السياسات

    حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.