يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التعامل مع الفأر القطن في الدراسات لتقييم ما قبل السريرية من حال الورم الفيروسات

9.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52232

⸱

نوفمبر 24, 2014

 ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster Immunology Research Centre, Institute for Infectious Disease Research, McMaster University

في هذه المقالة

ملخص

الفئران القطنية متحمسة للغاية ولديها استجابة قوية للطيران أو القتال. تم وصف طريقة المناولة المحسنة لتقليل إجهاد مما يجعل الوصول إلى فئران القطن أكثر سهولة كنموذج قبل السريري.

الملخص

فيروسات حال للأورام هي علاج جديد مضاد للسرطان مع القدرة على استهداف الخلايا السرطانية ، مع ترك الخلايا السليمة سليمة. لكي تنجح هذه الاستراتيجية ، أظهرت الدراسات الحديثة أن مشاركة الجهاز المناعي المضيف أمر ضروري. لذلك ، يجب تقييم العلاج الفيروسي المحلل للأورام في سياق نموذج ذو كفاءة مناعية. علاوة على ذلك ، فإن دراسة العلاجات المضادة للأورام في النماذج الحيوانية المتسامحة قد تلخص بشكل أفضل النتائج التي شوهدت في التجارب السريرية. تعتبر الفئران القطنية ، التي يشيع استخدامها لدراسة فيروسات الجهاز التنفسي ، نموذجا جذابا لدراسة العلاج الفيروسي المحلل للأورام حيث أن النماذج التركيبية لسرطان الثدي والساركوما العظمية راسخة. ومع ذلك ، هناك نقص في المعلومات المنشورة حول إجراءات المناولة المناسبة لهذه القوارض شديدة الإثارة. يقلل نهج المناولة والالتقاط الموضح من إجهاد لتسهيل التجارب. تتوقف هذه التقنية على قدرة الباحث على الحفاظ على الهدوء أثناء التعامل وتنفيذ الإجراءات في الوقت المناسب. أخيرا ، نصف كيفية تحضير الخلايا السرطانية الثديية للفئران القطنية لتكوين ورم تحت الجلد بشكل متسق ، وكيفية إجراء الحقن داخل الورم وداخل الصفاق. يمكن تطبيق هذه الطرق على مجموعة واسعة من الدراسات التي تعزز تطوير فأر القطن كنموذج ما قبل السريري ذي الصلة لدراسة العلاج المضاد للأورام.

المقدمة

الفيروسات حال الورم (OV) تكرار انتقائي في الخلايا السرطانية من خلال استغلال الاختلافات البيوكيميائية بين الخلايا الطبيعية والسرطانية 1،2. هناك نوعان من OVS: تلك التي لا تحتاج إلى طفرة لتحقيق انحلال الورم انتقائية، ويشار إلى الفيروسات التي تحدث بشكل طبيعي من النوع البري وتلك التي يجب أن هندستها لتحقيق انحلال الورم انتقائي. جمع الطفرات ضمن نوع الورم نظرا يحدد طبيعة ميزة النمو انتقائية على الخلايا الطبيعية لOV 2. وقد تجلى سلامة والاستفادة من استخدام OVS في التجارب السريرية 3-7. وعلى الرغم من التقدم في مجال علاج بالفيروسات حال الورم توجد الفجوات بين النتائج ما قبل السريرية والسريرية، مما يوحي بأن هناك حاجة إلى نماذج أفضل لتقييم فعالية مضادة للورم من OVS.

البقري نوع هربس 1 (BHV-1) هو عضو في عائلة فيروسات هربسية، وAlphaherpesviridae فصيلة. BHV-1 initiآتش البقري مجمع أمراض الجهاز التنفسي في الماشية، ويظهر في مجموعة متنوعة واسعة من أعراض تشبه نزلة برد 8،9. BHV-1 يربط مرفق ودخول مستقبلات يستخدمها HSV-1، مثل كبريتات heparan وnectin-1 10. ومع ذلك، فإنه يربط CD155 في مكان nectin-2 10. BHV-1 لديها مجموعة والمضيف ضيق جدا بحيث أنه غير قادر على الدخول بكفاءة وبدء النسخ المتماثل في الخلايا الطبيعية وتحويلها الفئران 3،4،10. وهذا يجعل من استخدام نماذج الفئران التقليدية إشكالية. وقد تجلى القدرة حال الورم من BHV-1 في المختبر 11،12. وقد تبين BHV-1 لبدء النسخ المتماثل في وقتل الخلايا السرطانية البشرية من مجموعة متنوعة من أصول النسيجية، بما في ذلك خلايا سرطان الثدي وسرطان الثدي الشروع في الخلايا 11،12. ومع ذلك، يجب تقييم القدرة انتيتومور من BHV-1 في الجسم الحي في سياق مضيف مناعيا.

اتش الإنسان (الإعلان)، والتيهناك 57 الأنماط المصلية التي تم تحديدها، تتسبب الأكثر شيوعا أمراض الجهاز التنفسي لدى البشر. تم تقييم ناقلات الإعلان حال الورم لفعالية مضادة للورم مع العديد التقدم في التجارب السريرية 13-15. وعلى الرغم من بيانات ما قبل السريرية واعدة، وتراجعت النتائج السريرية قصيرة من التوقعات. وعادة ما يتم استخدام نماذج طعم أجنبي الورم البشري لدراسة فعالية مضادة للورم من ناقلات الإعلان، على الرغم من أنها تظهر الموهن الاستجابات المناعية للفيروس 16،17. وعلاوة على ذلك، ونماذج الفئران مسانج غير قابلة للمتساهلة للإصابة الإعلان، مما يجعل تقييم المضيف الاستجابات المناعية باستخدام هذه النماذج غير عملي 17،18.

تم التعرف على الجهاز المناعي المضيف كآلية الأكثر تأثيرا التي OVS يثير ورم الخلايا الموت 19. ردود انتيتومور بين tolerized وغير tolerized مستضد المرتبطة الورم (TAA) نماذج تختلف ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على نجاح العلاج OV. وHSV-1 OV KM100 (ICP0 n212VP16 في عام 1814 20) 20،21 أثار الورم الانحدار في 80٪ من الفئران الحاملة للورم في الفئران التورام الأوسط T مستضد نموذج سرطان الثدي 22. ومع ذلك، في HER-2 نماذج / NEU، وفعالية مضادة للورم من KM100 تنوعت بين الانحدار الكامل 20٪ في الفئران مسانج وورم في ركود المعدلة وراثيا والفئران HER2 tolerized. معا هذه البيانات تبرز أهمية تقييم كامل OVS باستخدام نماذج حيوانية أن ألخص أفضل المشهد المناعة البشري أن نفهم تماما ما هي الميزات تحديد النجاح العلاجي.

يتم استخدام الفئران القطن (Sigmodon hispidus)، السكان الأصليين لأمريكا الشمالية والجنوبية، والأكثر شيوعا كنموذج للعدوى فيروس الجهاز التنفسي المخلوي (كما استعرض في 5). وتستخدم الفئران القطن أيضا في مجال البحوث لمكافحة BHV-1 التطعيم لأنها تلخيص علم الأمراض المرتبطة بأمراض الجهاز التنفسي البقري معقدة 6،23. وعلاوة على ذلك، BHV-1 إصابة الفئران القطنيولد مناعة، الأمر الذي أدى المخاطية المستدام والاستجابات المناعية الجهازية 6،23-25. وقد استمدت خطوط الخلايا من يفية عفوية وosteosarcomas من الغدة الثديية (LCRT) والعظام (CCRT وVCRT)، على التوالي 26. وقد استخدمت الفئران القطن لتقييم فعالية في الجسم الحي من ناقلات الإعلان حال الورم كما هي عرضة للإصابة الإعلان ويحمل علم أمراض مماثلة على البشر 27-29. استخدام نماذج المناعة لتقييم ما قبل السريرية من OVS ليسوا سوى أقل يدل على الردود السريرية للعلاج لكنها لا تأخذ في الاعتبار دور الجهاز المناعي في علاج بالفيروسات حال الورم 30،31. ولذلك، فإن مسانج ونماذج الفئران القطن tolerized ورم سرطان الثدي وعظمية والنماذج ذات الصلة التي لتقييم فعالية ما قبل السريرية من OVS، مثل BHV-1 والإعلان التي لا يمكن دراستها باستخدام نماذج الفئران التقليدية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على البروتوكولات التي تستخدمها المؤسسات الحيوانية البحوث أخلاقيات مجلسنا في جامعة ماكماستر وفقا لمبادئ توجيهية المجلس الكندي للرعاية الحيوان: ملاحظة. وأجريت التجارب في مرفق المركزي جامعة ماكماستر الحيوانية.

1. خلايا التثقيف LCRT

  1. خلايا الثقافة LCRT في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco لفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. الحفاظ على الخلايا في T-150 قوارير زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. خلايا مرور عندما تشكيل أحادي الطبقة 90٪ متكدسة (كل 2-3 أيام، الشكل 1).
  2. قبل دافئ 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 1X التربسين والمتوسطة في 37 ° C حمام الماء لمدة 10 دقيقة قبل تقسيم الخلايا.
  3. نضح المتوسطة من القارورة وشطف الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  4. بعد الشطف، ونضح PBS واحتضانالخلايا مع 2 مل من 1X التربسين حتى تنفصل الخلايا من القارورة (~ 2 دقيقة).
  5. Resuspend الخلايا في 8 مل المتوسطة (أي ما مجموعه 10 مل تعليق خلية) وبلطف ماصة صعودا وهبوطا لتفريق كتل من الخلايا.
  6. الحفاظ على الخلايا في قارورة T-150 من قبل البذر 1 مل تعليق خلية في 24 مل المتوسطة (أي ما مجموعه 25 مل لكل T-150) وقارورة صخرة بلطف من جانب إلى آخر. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى انقسام المقبل.

2. تقييم تكاثر الفيروس والسمسة في خلايا LCRT

  1. فيروس النسخ المتماثل
    ملاحظة: يبني الفيروسات التعبير عن علامة فلوري، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، تحت سيطرة المروجين الفيروسي الذاتية تسهيل التصور من عدوى فيروس وانتشرت باستخدام القراء لوحة مضان.
    1. خلايا LCRT البذور في لوحات الثقافة، وترك جيدا لفرز الأصوات. خلايا البذور بحيث أنها سوف تكون 80-90٪ متكدسة في وقت لاحق يوم واحد. استخدام تركيز 10 5 سلليرة سورية / مل (100 ميكرولتر لكل بئر) لإنتاج confluency المطلوب في وقت لاحق يوم واحد في 96-جيدا لوحات مسطحة القاع.
    2. في اليوم التالي، قبل دافئ برنامج تلفزيوني 1X، 1X التربسين والمتوسطة كاملة وخالية من المصل في 37 ° C حمام الماء لمدة 10 دقيقة قبل بدء التجربة.
    3. نضح المتوسطة من عد جيدا وشطف الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X التي كتبها هزاز ذلك على سطح البئر.
    4. بعد الشطف، نضح PBS واحتضان الخلايا مع 2 مل من 1X التربسين حتى تنفصل الخلايا من القارورة (~ 2 دقيقة).
    5. resuspend الخلايا في حجم مناسب من المتوسط ​​كاملة لتسفر عن كثافة الخلايا في نطاق معدود باستخدام عدادة الكريات. لضمان وجود عدد خلايا دقيقة، وتخلط جيدا تعليق الخلية قبل تلقيح عدادة الكريات من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
    6. تحديد حجم المخزون فيروس المطلوبة للعدوى في تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية).
      مطلوب Paque تشكيل وحدات (PFU) = عدد الخلايا مطلي * MOI(PFU / خلية)
      حجم المخزون فيروس المطلوبة = المطلوبة PFU / فيروس الأسهم عيار (PFU / مل)
    7. إعداد اللقاح فيروس في مصل خالية المتوسطة في أنابيب. مزيج دقيق من قبل vortexing أو pipetting لقيحة قبل إضافة إلى الخلايا.
    8. تصيب الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وبعد ذلك تطبيق تراكب صيانة DMEM + 1٪ FBS.
    9. لوحات مسح واحد ويومين العدوى بعد (باي) لتصور GFP مضان.
  2. فيروس السمسة
    ملاحظة: إجراء الفحص ريسازورين سمية الخلايا تحت ظروف الإضاءة المنخفضة مثل المركب هو حساس. وسيط تحتوي جيدا فقط ينبغي أن تدرج لتصحيح مضان الخلفية.
    1. إعداد 5٪ (ت / ت) حل ريسازورين في برنامج تلفزيوني 1X. مزيج الحل من قبل pipetting.
    2. نضح المتوسطة من الخلايا وتطبيق حل ريسازورين 5٪. تشمل المتوسطة التي تحتوي على بئر فقط لتصحيح مضان الخلفية.
    3. احتضان خلايا لمدة 30 دقيقة في 37 ° C، وبعدفيما يلي نصه مضان باستخدام قارئ لوحة مضان (530 الإثارة نانومتر، وانبعاث 595 نانومتر).
    4. تحليل البيانات المتعلقة الضوابط غير المصابة تصحيح لمضان الخلفية.

3. الإسكان والمناولة

  1. الإسكان والنظام الغذائي
    1. الفئران القطن منزل على حدة لتقليل في القتال في أقفاص الجرذ البولي تحتوي على الفراش القوارض (1/8 "الفراش كوز الذرة)، وقسم من PVC أنابيب لم يعد من 8 بوصات وnestlets كما تخصيب (الشكل 2).
    2. استخدام سلة الصلب القابلة للتأمين على الجلوس فاق من القفص واحتواء القوارض الطعام وزجاجة المياه.
      ملاحظة: هذا الإعداد قفص تسمح لالتقاط آمنة وسهلة للحيوانات، مع وضع أنبوب تخصيب ضد نهاية الوجود قفص ذات أهمية قصوى.
  2. معالجة
    1. التعامل مع الفئران القطن في الصباح، قبل جولات من قبل الفنيين منشأة الحيوانية لتجنب إثارة لهم قبلإجراء.
    2. خلال جميع الإجراءات، وارتداء قفازات جلدية سميكة للحماية.
    3. كما تبقى الحيوانات في المقام الأول في أنابيب تخصيب، واستخدامها لنقل الفئران في قفص جديد خلال التنظيف الروتيني. بدلا من ذلك، فتح القفص قليلا للسماح للمعالج لتصل إلى أيديهم في، الحيوان ومن ثم يمكن ضبط النفس من قبل scruffing الجلد فقط فوق الكتفين، ودفع إلى أسفل. الرعاية ممارسة بعدم استخدام القوة المفرطة كما الحيوان قد يعض لغتهم.
    4. التحلي بالصبر واستخدام يد ثابتة كما الحيوانات لديها قوية طيران أو المعركة الاستجابة وسوف محاولة لتجنب القبض عن طريق تشغيل والقفز من القفص. الأهم من ذلك، لا معالجة الحيوانات من ذيله كما لحب سيحدث.
    5. مصيدة الحيوانات في التخصيب الأنابيب على مدى التعامل المباشر. هذا يقلل بشكل كبير من الإصابات والهرب.

4. التقاط والتخدير

  1. أسر
    1. ارتداء قفازات جلدية سميكة لحمايةايون خلال جميع الإجراءات.
    2. استخدام وعاء من البلاستيك واضحة كبيرة مع فتحات للهواء والغطاء، لمحة تعريفية غرفة التخدير كبيرة بما يكفي لتناسب الحاوية ومخروط الأنف تركيبها على خرطوم انتاج الغاز (الشكل 3).
    3. العمل في أزواج لجعل الإجراء أكثر كفاءة وتقليل زمن التعرض للحيوانات لالأيزوفلورين، وهو مخدر الاستنشاق. التأكد من باحث واحد مسؤول عن افتتاح واستبدال غطاء من الفولاذ على القفص وغطاء غرفة الاستقراء (معالج 1 #) والزميلة التي هي المسؤولة عن القبض على الحيوان في أنبوب ونقلها إلى غرفة الاستقراء (معالج # 2).
    4. وضع القفص على سطح مستو وإزالة الغطاء الخارجي. رفع علبة تغذية الصلب قليلا والمناورة ببطء أنبوب التخصيب لذلك هو مواز مع الجانبين من القفص وضد الظهر. إذا لزم الأمر، استخدام كائن للمناورة أنبوب التخصيب دون فتح القفص لتجنب اثارة الحيوان (مقبضص # 1).
    5. إذا أصبح الحيوان المهتاج ويترك الأنبوب، إتاحة الوقت الكافي للحيوان للاسترخاء ويستقر مرة أخرى في الأنبوب (معالج 1 #).
    6. ببطء وروية رفع حافة أبعد الغطاء الصلب من الأنبوب تخصيب، والحفاظ على الطرف الآخر في اتصال مع القفص. جعل مساحة كبيرة بما يكفي للحاوية بلاستيكية (معالج 2 #).
    7. في واحدة على نحو سلس، الحركة السريعة، ودفع عاء من البلاستيك فاق من الأنبوب تخصيب اليورانيوم. البقاء على اتصال من الحاوية مع الجانب من القفص، محاصرة الحيوان في الأنبوب. تنفيذ الخطوات 4.1.6 و4.1.7 في أسرع وقت ممكن (معالج 2 #).
    8. إزالة علبة تغذية الصلب وإعطاء غطاء حاوية من البلاستيك لمعالج # 2 (معالج 1 #). حرك غطاء من البلاستيك بين الجانب من القفص والحاويات، لأنها تدرك من الزوائد الحيوان المحاصرين في هذه العملية. لا ختم الحاويات حيث سيؤدي ذلك إلى اتخاذ الخطوة المقبلة أكثر صعوبة (معالج رقم 2).
  2. AnesthesIA
    1. تأكد من تبقى حاوية مغلقة ونقل الحيوان إلى غرفة الاستقراء. وضع بسرعة الحيوان في غرفة وإزالة غطاء حاوية واحدة في حركة السوائل (معالج 2 #). فتح واستبدل على الفور غطاء غرفة الاستقراء (معالج رقم 1).
    2. بدوره على تدفق الأيزوفلورين إلى غرفة الاستقراء (5 لتر / دقيقة) ومراقبة الحيوانات لعلامات الخمول، وعند هذه النقطة بسرعة الانزلاق الحيوان من الأنبوب والحاويات، وإزالة كلا من غرفة التعريفي لتسهيل تداول الغاز.
    3. عندما يتم تخدير الفئران تماما، نقله إلى سطح العمل ووضع الأنف والفم في مخروط الأنف (الشكل 3). الفئران هو تخدير تماما عندما يكون غير قادر على الاستجابة إلى أخمص القدمين قرصة قوية.
    4. وضع التعليم والتدريب المهني الفازلين مرهم للعين على عيون الحيوان لمنع جفاف وسحجات. هذا هو خطوة أساسية عن الجرذان القطن لها عيون الكبيرة التي يمكن أن تكون عرضة للإصابة إذا حدثت الإصابة.
      5. <لى> مراقبة بعناية والحفاظ على معدل التنفس المستمر وضمان أن أنف الحيوان يبقى في مخروط الأنف المناسب في جميع أنحاء الداخلي. ضبط معدل تدفق الأيزوفلورين بشكل مناسب. كمية الأيزوفلورين حاجة إلى تخدير سوف تختلف كل حيوان.
    5. ما بعد الإجراء، يعود الحيوان إلى قفصه وضمان يستعيد التنقل الكامل والاستلقاء القصية.

5. إعداد الخلايا LCRT لورم تحت الجلد تشكيل

ملاحظة: واحد T-150 قارورة من LCRT (90٪ confluency) ينتج ما يقرب من 2 × 10 7 الخلايا. قاعدة عدد T-150 قوارير المطلوبة على العدد الكلي للخلايا اللازمة. البذور قوارير اضافية لضمان العدد الكلي للخلايا المطلوبة يتم الحصول عليها واستيعاب الخلايا المفقودة أثناء إعداد وتلك اللازمة لحقن إضافية. حفاظ على الخلايا على الجليد كلما أمكن ذلك لإطالة بقاء الخلية.

  1. حصاد الخلايا والمتوسطة نضح من قارورةخلايا شطف د مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  2. نضح PBS واحتضان الخلايا مع 2 مل من 1X التربسين حتى تنفصل الخلايا من القارورة (~ 2 دقيقة).
  3. Resuspend الخلايا في 8 مل المتوسطة (أي ما مجموعه 10 مل تعليق خلية) وبلطف ماصة صعودا وهبوطا لتفريق كتل من الخلايا. مواصلة حصاد الخلايا من قوارير إضافية.
  4. تجميع كل تعليق خلية في أنبوب مخروطي الشكل واحد، ما يقرب من 4 T-150S لكل 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 160 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. نضح المتوسطة و resuspend بيليه خلية في حجم مناسب من برنامج تلفزيوني (10 مل PBS في T-150) لانتاج كثافة الخلية في نطاق معدود باستخدام عدادة الكريات. لضمان وجود عدد خلايا دقيقة، وتخلط جيدا تعليق الخلية قبل تحميل عدادة الكريات من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  7. حساب العدد الكلي للخلايا:
    إجمالي عدد الخلايا تحصد = عدد الخلايا (خلية / مل) س إعادة تعليق الحجم (مل)
  8. حددحجم التعليق الخلية المطلوبة لجميع الحقن. جعل 2-3 جرعات اضافية في التجربة. وهناك ما مجموعه 5 × 10 5 خلايا LCRT حقن تحت الجلد تشكل الأورام واضح في غضون 3-4 أيام.
    إجمالي عدد الخلايا المطلوبة = 5 × 10 5 خلايا × عدد الكلي للجرعات
    تعليق خلية الحجم المطلوب (مل) = (مجموع الخلايا المطلوبة * مجموع كميات حقن) / (العدد الكلي للخلايا المقطوع)
  9. الماصة للحجم المطلوب من تعليق الخلية في أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على برنامج تلفزيوني وتخلط جيدا. حقن قسامة الفردية (100 ميكرولتر) في أنابيب إيبندورف. الحفاظ على أنابيب على الجليد أثناء إجراء الحقن.

6. الحقن

ملاحظة: تنفيذ الإجراءات مع اثنين من الباحثين، واحدة لأداء الحقن في حين أن المراقبين الآخرين معدل التنفس الحيوان والحالة العامة في حين تحت التخدير. استخدام المحاقن الأنسولين (29 G س 1/2 '، 0.3 مل) لجميع الحقن وإبرة جديدة لكل حيوان.

  1. حقن تحت الجلد
    1. التقاط وتخدير الحيوان (القسم 4).
    2. يحلق موقع الحقن باستخدام كليبرز. الفراء الفئران القطن سميكا ويتطلب الانتهازي حاد للحصول على سطح أملس لحقن. تنظيف موقع الحقن مع 70٪ من الإيثانول باستخدام قطعة من القطن والسماح لها تتبخر تماما قبل المتابعة.
    3. المحاقن الحمل (29 G س 1/2 "، 0.3 مل) مع الخلايا عن طريق وضع ببطء ولكن بثبات. إذا فقاعات نفض الغبار واضحا الحقنة مع بعض القوة. مرة واحدة فقاعات في بكبسة كبار المكبس حتى السائل هو في الجزء العلوي من الإبرة.
    4. رفع الجلد في موقع الحقن (ويشار إلى خيام الجلد) وإدراج الجانب شطبة إبرة يصل. تأكد من أن الإبرة تتحرك بحرية تحت الجلد لتجنب حقن العضل.
    5. طرد محتويات الحقنة بالتساوي وببطء. سحب الجانب شطبة إبرة أسفل.
  2. حقن Intratumoral
    1. التقاطد تخدير الحيوان (القسم 4).
    2. تنظيف موقع الحقن مع 70٪ من الإيثانول باستخدام قطعة من القطن والسماح لها تتبخر تماما قبل المتابعة.
    3. المحاقن الحمل (29 G س 1/2 '، 0.3 مل) مع اللقاح الفيروس عن طريق وضع ببطء ولكن بثبات في حين عقد الإبرة في وضع مستقيم. إذا فقاعات نفض الغبار واضحا الحقنة مع بعض القوة. مرة واحدة فقاعات في بكبسة العلوي ثم الغطاس حتى السائل هو في الجزء العلوي من الإبرة.
    4. إدراج الجانب شطبة إبرة يصل الى الورم وطرد محتويات الحقنة بالتساوي وببطء، بينما تتحرك الإبرة في نمط يشبه المروحة، سحب جزئيا الإبرة قبل كل حركة لمنع تمزق للورم. سحب الجانب شطبة إبرة أسفل.
      ملاحظة: الأورام LCRT تحت الجلد هي، ليصل إلى حوالي 100 مم 3 في 5-7 أيام سريعة النمو. وعلاوة على ذلك، ومراكز نخرية النزفية وغالبا ما تشكل على سطح الورم في غضون عدة أيام ويتطلب كاليفورنيامراقبة reful (الشكل 4).
  3. الحقن داخل الصفاق
    1. التقاط وتخدير الحيوان (القسم 4).
    2. تنظيف موقع الحقن مع 70٪ من الإيثانول باستخدام قطعة قطن والسماح لها تتبخر تماما قبل المتابعة.
    3. المحاقن الحمل (29 G س 1/2 '، 0.3 مل) مع المخدرات عن طريق رسم ببطء ولكن بثبات. إذا فقاعات نفض الغبار واضحا الحقنة مع بعض القوة. مرة واحدة فقاعات في بكبسة العلوي ثم الغطاس حتى السائل هو في الجزء العلوي من الإبرة.
    4. ادخال الإبرة في الربع السفلي الأيمن من البطن. سحب على المكبس لضمان أن الدم أو البراز لا يستنشق، وهذا يدل على وضع غير صحيح من الإبرة. إذا حدث هذا، سحب الإبرة وإعداد حقنة جديدة. عندما يتم وضع الإبرة بشكل صحيح، وطرد محتويات الحقنة بالتساوي وببطء.

7. ورم الختان والتشريح

  1. جمع وتنظيف آلأدوات لتر مع 70٪ من الإيثانول قبل القتل الرحيم للحيوان.
  2. الموت ببطء الحيوان من خلال طريقة المطلوب، ويوصى CO 2 الاستنشاق (2 لتر / دقيقة لمدة 5-10 دقيقة). فحص الحيوان لأي شذوذ في حالة الجسم.
  3. وضع الحيوان في الاستلقاء على ظهري مجلس تشريح وتنظيف الحيوان مع الايثانول 70٪.
  4. استخدام ملاقط لرفع الجلد في أسفل البطن. قطع طريق الجلد والعضلات باستخدام مقص وجعل شق وسطي يمتد على طول الحيوان (فتحة الشرج إلى الذقن).
  5. قطع القفص الصدري من خلال جعل اثنين من التخفيضات، واحد أفقيا حتى من جانب القفص الصدري واحدة عبر القص لفضح القلب والرئتين. دراسة فصوص الرئة لأي الانبثاث 27،29.
  6. فحص جميع الأجهزة للشذوذ وتسجيل أي تغييرات في اللون والحجم، والاتساق. إذا لزم الأمر، شق الأجهزة مع مشرط لفحص الأنسجة الداخلية. على وجه التحديد، ودراسة الكبد والكلى والطحال والجهاز الهضمي.
  7. تفقد الغدد الليمفاوية لالانبثاث والتوسيع 27،29.
  8. لجمع الورم، وجعل شقوق الجناح فوق وتحت الورم بحيث الجلد يمكن أن يتم سحبها بعيدا عن الجسم مع ملاقط. في حين عقد بحزم الجلد مع ملاقط، واستخدام مشرط لإزالة بعناية الورم عن طريق قطع بين الورم والأدمة (الشكل 5).
  9. وضع على الفور الورم في وعاء وصفت من 10٪ من الفورمالين مخزنة محايد.
  10. اعتمادا على حجم الورم، السماح 1-2 أيام (≤ 2 مم، صغيرة) أو 5-6 أيام (> 2 مم، كبير) لتحديد قبل إعداد أقسام للتحليل النسيجي (الشكل 6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ونظرا لطبيعة منفعل للغاية من الفئران القطن، ويجري على دراية والاستفادة من إجراءات الأمثل للحد من وطأة هذه الحيوانات سوف سهولة في استخدامها كنموذج حيوان ما قبل السريرية. واستخدام التقنيات السليمة للتعامل معها تقليل خطر أيضا للباحث.

عند استخدام الفئران القطن لا بد من الهدوء. الفئران هي منفعل للغاية وسوف تحاول الهرب قفص بهم. استخدام أنبوب التخصيب وnestlets سيقلل محاولات الهروب الشكل 2 يوضح الأمثل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الفئران القطنية مثيرة للغاية ولها استجابة طيران قوية. لذلك ، يجب توخي الحذر بشكل خاص لتقليل أي ضغط لا داعي له على. سيسمح إعداد القفص الموصوف بالقبض الآمن والسهل على ، مع وضع أنبوب التخصيب له أهمية قصوى. عند إعداد الأقفاص ، تأكد من أن أنابيب التخصيب تلبي متطلبات الحجم والشكل ، ويتم وضعها في الاتجاه الصحيح في القفص. من المهم أيضا التأكد من إبلاغ أي فنيين قد يساعدون في صيانة بالمتطلبات المحددة للسكن. سيؤدي اتخاذ هذه الاحتياطات إلى تقليل هياج قبل تنفيذ الإجراءات. ينصح أيضا بتنفيذ الإجراءات في الصباح ، قبل أي تعامل من قبل الف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يقر المؤلفون بعدم وجود تضارب مالي في المصالح يتعلق بهذا البحث.

شكر وتقدير

Breanne Cuddington حاصلة على زمالة من المؤسسة الكندية لسرطان الثدي. تمت رعاية هذا العمل من خلال منح تشغيلية من جمعية أبحاث السرطان ومعهد أبحاث جمعية السرطان الكندية (التحالف الكندي لأبحاث سرطان الثدي سابقا). نشكر آن تولفسون (كلية الطب بجامعة سانت لويس) على خلايا LCRT والدكتورة كاثلين ديلاني وماريون كوريك على المساعدة الفنية في إسكان الفئران القطنية والتخدير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو s النسر المعدل s متوسط قد تستخدم Gibco11965-092أي علامة تجارية 
1X محلول ملحي مخزن بالفوسفات   ؛يمكن تحضيره في المختبر ، وتصفية لتعقيم
200 ملي ل-جلوتامينجيبكو25030164قد تستخدم أي علامة تجارية
100x مضاد حيوي مضاد للفطريات   ؛قد تستخدم Gibco15240-062أي علامة تجارية
مصل الأبقار الجنينيQuality Biological Inc.110-001-101HIقد تستخدم أي علامة تجارية
T-150cm2< / sup> قارورة زراعة الأنسجةفيشر Scientific14-826-80قد تستخدم أي علامة تجارية
1X TypLE ExpressLife Technologies12604-013
لوحة زراعة الخلايا ذات 12 بئر ، قاع مسطحFisher Scientific08-772-29قد تستخدم أي علامة تجارية ، يجب أن تكون معالجة زراعة الأنسجة
alamarBlueLife تقنياتDAL1025قد تستخدم كاشفا بديلا لتحديد صلاحية الخلية
8640 Teklad 22/5 نظام غذائي القوارضHarlan & nbsp ؛8640
1/8 "ذرة كوز الفراش قوارضهارلان7092
نستليتسأنكار-مصنوعة من ألياف القطن البكر ، خالية من الغبار وقابلة للتعقيم
50 مل أنابيب مخروطيةفيشر Scientific14-432-22قد تستخدم أي علامة تجارية ، يجب أن تكون معقمة
Isoflurane USP ، 99.9٪ ، التخدير بالاستنشاقPharmaceutical Partners of Canada Inc.M60302
70٪ إيثانوليمكن تحضيره في المختبر
10٪ فورمالين محايدمخزن سيجما ألدريتشHT501128قد تستخدم أي علامة تجارية
NAPCO NapFlow 1200 Class II A / B3 خزانة السلامة الميكروبيولوجية للسلامة الحيوية (غطاء لزراعة الخلايا)NAPCOالمستخدم غير متوفر حالياقد يستخدم أي علامة تجارية
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water BathFisher النموذج العلمي المستخدم غير متوفر حاليا قد تستخدم أي علامة تجارية
[header]
Reichert Bright-line HemacytometerSigma-AldrichZ359629قد تستخدم أي علامة تجارية
Typhoon Trio BioAnalyzer   ؛علوم الحياة للرعاية الصحية من جنرال إلكتريكغير متوفر حاليا قد تستخدم أي قارئ لوحة مضان
Tecan Safire2< / sup> Multi-Detection Microplate ReaderTecanModel المستخدمة غير متوفرة حاليا قد تستخدم أي قارئ لوحة مضان
قد تستخدم أجهزة الطرد المركزي Allegra 6RBeckman Coulter366816أي علامة تجارية
لآلة التخديرVetEquipالمستخدمة غير متوفرة حاليا.قد تستخدم أي علامة تجارية ، يجب أن تكون محمولة
يمكن استخدام محاقن الأنسولين الصغيرة منWahlنوع من المقصات الصغيرة
محاقن الأنسولين 29 جم × 1/2 بوصة ، 0.3 ملدينار بحريني329464قد تستخدم أي علامة تجارية. يوصى باستخدام محاقن الأنسولين لأنها تجعل الحقن أسهل من خلال الفئران' s بشرة قاسية. 
مسحات قطنيةMedPro018-425قد تستخدم أي علامة تجارية
مقص تشريح حاد مدببفيشر Scientific8940قد يستخدم أي علامة تجارية
ملقط الأنسجة التشريحفيشر Scientific13-812-41قد يستخدم أي علامة تجارية
نموذج نموذج أي

المراجع

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7 (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254 (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78 (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63 (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11 (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8 (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26 (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66 (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20 (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88 (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14 (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62 (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12 (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110 (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30 (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74 (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76 (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222 (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13 (1), 123(2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369 (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التعامل مع الفأر القطن في الدراسات لتقييم ما قبل السريرية من حال الورم الفيروسات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.