مقالة منهجية

المبيضات البيض بيوفيلم التنمية على الهيئات الأجنبية طبيا ذات الصلة في الماوس تحت الجلد نموذج تلاه ضوء بارد التصوير

DOI:

10.3791/52239

⸱

يناير 27, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven, 2Biomedical MRI Unit/ MoSAIC, Department of Imaging & Pathology, KU Leuven

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم إجراء تجريبيا لتطوير الأغشية الحيوية المبيضات البيضاء في نموذج تحت الجلد للفأر. تم قياس الأغشية الحيوية الفطرية من خلال تحديد عدد وحدات تكوين المستعمرة وعن طريق تصوير التلألؤ البيولوجي غير الجراحي ، حيث تتوافق كمية الضوء التي يتم إنتاجها مع عدد الخلايا القابلة للحياة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المبيضات البيض تطوير بيوفيلم على الأسطح الحيوية و / أو غير الحيوية تمثل تهديدا محددا لمرضى المستشفى. وحتى الآن، C. وقد تم دراسة الأغشية الحيوية البيض في الغالب في المختبر ولكن هناك حاجة ماسة لفهم أفضل لهذه العملية الديناميكية في ظل ظروف في الجسم الحي. قمنا بتطوير نموذج الفئران تحت الجلد في الجسم الحي لدراسة C. تشكيل بيوفيلم البيض. في نموذجنا، متعددة (ما يصل إلى 9) وزرع أجهزة -infected المبيضات إلى الجزء الخلفي من الحيوان. هذا يعطينا ميزة كبيرة على نظام نموذجي القسطرة الوريدية المركزية لأنها تسمح لنا لدراسة عدة الأغشية الحيوية المستقلة في حيوان واحد. مؤخرا، ونحن تكييفها هذا النموذج لدراسة C. تطوير بيوفيلم البيض في BALB / ج الفئران. في هذا النموذج، تنضج C. الأغشية الحيوية البيض تتطور خلال 48 ساعة وتظهر العمارة بيوفيلم ثلاثية الأبعاد النموذجية. القياس الكمي لبيوفيلم الفطريةويتم تحليل تقليديا بعد الوفاة ويتطلب التضحية المضيف. لأن هذا يتطلب استخدام العديد من الحيوانات لإجراء دراسات الحركية، طبقنا غير الغازية تلألؤ بيولوجي التصوير (BLI) لمتابعة طولي يصل في الجسم الحي تنضج C. البيض الأغشية الحيوية النامية في نموذج تحت الجلد لدينا. C. تم هندستها خلايا البيض للتعبير عن Gaussia princeps luciferase المراسل الجين (gLuc) تعلق على جدار الخلية. ويتم إنتاج إشارة تلألؤ بيولوجي من قبل luciferase المراسل أن يحول coelenterazine الركيزة أضاف في الضوء الذي يمكن قياسها. إشارة BLI تشبه عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من القسطرة explanted. التصوير غير الغازية لقياس في تشكيل الجسم الحي بيوفيلم يوفر تطبيقات فورية لفحص والتحقق من الأدوية المضادة للفطريات في ظل ظروف في الجسم الحي، فضلا عن الدراسات التي تعتمد على التفاعلات المضيف الممرض، تساهم بموجبه إلى فهم أفضل لجي من التسبب في العدوى المرتبطة القسطرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المبيضات البيض هو كائن المتعايشة، التي يمكن العثور عليها في مواقع مختلفة من الأفراد الأصحاء، على سبيل المثال على الجلد أو جزء من الجهاز الهضمي والنباتات المهبلية. ومع ذلك، في المستشفى، وخصوصا مرضى نقص المناعة، فإنه قد يسبب مجموعة واسعة من الالتهابات 1. في هؤلاء الأفراد، وضعف الجهاز المناعي يسمح خلايا المبيضات لنشر إلى مجرى الدم وتغزو الأنسجة العميقة يسبب العدوى المهددة للحياة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وجود ركائز غير الحيوية مثل القسطرة الوريدية المركزية والمسالك البولية، وصمامات القلب الاصطناعية والمفاصل قد توفر مكانا لالمبيضات مرفق 2. الانضمام إلى مثل هذه ركائز هو شرط أساسي لمزيد من التطوير بيوفيلم، وهو ما يمثل طبقة من الخميرة وخوطي خلايا جزءا لا يتجزأ من المواد البوليمرية خارج الخلية، التي تتألف أساسا من السكريات 2. C. البيض قسطرة -associated العدوىوترتبط مع ارتفاع معدل الوفيات. والسمة العامة للالأغشية الحيوية هي قابلية انخفضت لمضادات الفطريات المعروفة، مثل الأزولات 3،4. أثبتت أحدث فصول فقط من الأدوية المضادة للفطريات، مثل echinocandins وصياغة liposomal من الأمفوتريسين B لتكون فعالة ضد العدوى المرتبطة القسطرة 5-7. بسبب بيوفيلم القدرة على مقاومة مضادات الفطريات، والنهج العلاجية محدودة جدا، وغالبا ما يؤدي إلى إزالة القسطرة واستبدال لاحقا كحل وحيد.

أكثر من الفهم الحالي للC. لدينا تنبع تطوير بيوفيلم البيض من الدراسات في المختبر على ركائز غير الحيوية مثل البوليسترين، أو المواد البلاستيكية المستخدمة لتصنيع الأجهزة المذكورة أعلاه، أي سيليكون، البولي يوريثين 2. هذه النماذج هي متقدمة جدا ومحاولة لتقليد الوضع في الجسم الحي بأكبر قدر ممكن. ومع ذلك، فإن هذه الأنظمة لا تنطوي على تدفق الدم المستمر وركان الجهاز المناعي للمضيف. وأدى ذلك إلى تطوير نظم نموذج في الجسم الحي، مثل القسطرة الوريدية المركزية (سي) نموذج 8-10، ونموذج التهاب الفم أسنان من داء المبيضات الفموي 11 ونموذج الفئران لالمصاحب قسطرة بيلة المبيضات 12. بالإضافة إلى ذلك، C. تمت دراسة تطوير بيوفيلم البيض في الجسم الحي على الأسطح المخاطية، مثل تلك التي من المهبل عن طريق الفم تجويف 13 و 14. ساهم مختبرنا مع إنشاء C. تحت الجلد البيض نموذج بيوفيلم، والتي تقوم على زرع من القطع القسطرة المصابة على الجزء الخلفي من الفئران سبراغ داولي 15. وقد استخدم هذا النموذج بنجاح في المختبر لدينا لاختبار قابلية بيوفيلم لفلوكونازول وechinocandin المخدرات 5،16، لدراسة تأثير العلاج اندماجي من ديكلوفيناك وcaspofungin 17. وفي الآونة الأخيرة، فإننا تكييفها هذا النظام لاستخدامها في BALB / ج الفئران 18،19. فيمقارنة مع غيرها في نماذج الجسم الحي، والميزة الرئيسية لهذا النموذج تحت الجلد هو إمكانية لدراسة الأغشية الحيوية متعددة لكل حيوان وضعت داخل التجويف من القطع قسطرة مزروع.

للحد من عدد الحيوانات المختبرية، وتكيفنا هذا النموذج لدراسة تطوير C. البيض الأغشية الحيوية غير جراحية باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) 18،19. أثبتت هذه الطريقة أن تكون تقنية قوية، والتي يمكن استخدامها لقياس الأغشية الحيوية عن طريق قياس إشارة محددة BLI في المنطقة ذات الاهتمام (في حالتنا مجال القسطرة زرعها)، وتجنب التضحية الحيوانية. وبالمقارنة مع البكتيريا، والتي يمكن التعبير عن كل من الجينات والركيزة اللازمة للتفاعل تلألؤ بيولوجي نظرا لإدخال لوكس الاوبرون محدد 20، ومعظم الكائنات الحية حقيقية النواة، بما في ذلك C. البيض، تعتمد على التعبير مغاير من الجين luciferase المراسل إلى جانبالإدارة الخارجية للركيزة محددة، مثل D-وسيفيرين أو coelenterazine 21. وربما يرجع ذلك إلى وجود جدار الخلية الفطرية وC. كان البيض التشكل، والتسليم داخل الخلايا الركيزة للانزيم luciferase المراسل تحديا الرئيسي 21. من أجل حل هذه المشكلة، Enjalbert وآخرون 22 هندسيا سلالة حيث C. الاصطناعية وقد تنصهر البيض الإصدار الأمثل كودون من الجينات ليفرز بشكل طبيعي Gaussia princeps luciferase المراسل (gLuc) للC. البيض PGA59 الجينات، ترتكز على GPI- بروتين جدار الخلية. بسبب وجود luciferase المراسل في جدار الخلية، ويمكن تجنب المشاكل المتعلقة توافر داخل الخلايا الركيزة. وقد استخدم هذا النظام بشكل خاص لدراسة التهابات سطحية الناجمة عن C. البيض 22. قريب جدا، كان يستخدم BLI أيضا لمتابعة تطور داء المبيضات الفموي البلعومي وامكن لهاالعلاج ه 23. هذه النتائج تدعم استخدام BLI باعتبارها تقنية واعدة لدراسة الالتهابات التي تسببها الخلايا التي تعيش بحرية ولكن أيضا العدوى المرتبطة الجهاز.

في هذه الدراسة، فإننا وصف C. تطوير بيوفيلم البيض على قطع القسطرة البولي يوريثان في الفئران BALB / ج وتقدير لها باستخدام BLI. ونحن نقدم بروتوكول مفصلة في المختبر استعمار القسطرة البولي يوريثين خلال الفترة من التصاق تليها زرع في الفئران والتنمية بيوفيلم اللاحقة في الحيوانات الحية. وبصرف النظر عن قياس إشارة BLI المنبعثة من C. خلايا البيض، ونحن أيضا تحديد مستعمرة للمقارنة مع تقنية قياسية لبيوفيلم الفطرية الحمل الكمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة الأخلاقية لوفين KU (مشروع رقم 090/2013). الحفاظ على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان KU لوفين.

1. C. البيض النمو

  1. قبل أربع وعشرين ساعة من بدء التجربة الحيوانية، وإعداد لوحات YPD عن طريق إضافة 10 غرام من خلاصة الخميرة المحبب، 20 غراما من ببتون البكتريولوجية، و 15 غرام من أجار حبيبات. تشكل حجم 900 مل مع ميلي-Q المياه والأوتوكلاف.
  2. إضافة 50 مل من معقم الجلوكوز 40٪. تخلط جيدا وتصب في أطباق بتري. ترك لوحات أجار لتبريد وتقوية.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، استخدم سلالتين هما البرية نوع C. البيض SC5314 - gLuc سلالة السلبي (ويشار إلى WT) وC. البيض SKCA23 السلالة، وهو نوع C. البرية البيض SC5314 تحولت مع Clp10 :: Act1p-gLUC59 بلازميد 22 .في هذه السلالة (يسمى SKCA23- Aوقد تنصهر CTgLuc) gLuc إلى الجين PGA59 الذاتية تحت سيطرة ACT1 (الأكتين) المروج (هذا المروج نشطة في الخميرة، وكذلك مرحلة خوطي من نمو الفطريات). يمكن طلب هذه السلالة من مختبر البروفيسور باتريك فان DIJCK، KU لوفين، لوفين، بلجيكا. البلازميد Clp10 :: Act1p-gLUC59 بلازميد 22 تبرع يرجى البروفيسور جيم دي Enfert، معهد باستور، باريس، فرنسا.
  3. الحفاظ على كل من السلالات في الأسهم الجلسرين وتخزينها في -80 ° C.
  4. قبل أي سلالات متتالية التجربة على لوحة YPD. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.

2. قسطرة قطع التحضير

  1. قبل التجربة، تحديد عدد القسطرة المطلوبة. فمن الممكن زرع ما يصل الى 6 قطع القسطرة في الماوس (3 القسطرة على اليسار و 3 القسطرة على الجانب الأيمن للحيوان (الشكل 2A).
  2. أربع وعشرين ساعة قبل الجراحة الحيوان، فتح حزمةسن تحتوي على الثلاثي التجويف القسطرة تحت مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إزالة جميع الأجزاء غير الضرورية مع ملاقط معقمة وقطع جزء تعلق على القسطرة مع مشرط معقم. وضع حاكم تحت حزمة من البلاستيك وقطع قطع القسطرة البولي يوريثين بالضبط 1 سم وفقا للجدول على المسطرة (الشكل 1).
    ملاحظة: من المهم أن نذكر أن هذا النوع من قطعة القسطرة ليست الفسفورية، وبالتالي مناسبة لBLI 18،19.
  3. وضع حد أقصى قدره 15 قطعة قطع القسطرة (الخطوة 2.2) في 2 مل أنابيب microcentrifuge. إعداد دائما 3 قطع اضافية، والتي تستخدم لتعداد كمية من الخلايا المبيضات تعلق على الجهاز بعد فترة من الالتصاق.
  4. تكملة القسطرة مع ما يقرب من 1.8 مل من 100٪ مصل بقري جنيني (FBS).
  5. دوامة بقوة وإضافة 100-200 ميكرولتر إضافي قدره 100٪ FBS. تغطي تماما كل قطعة القسطرة مع المصل.
  6. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.

3. الحيوانات وقمع نظام المناعة

  1. إبقاء الأنثى BALB / ج الفئران (حوالي 8 أسابيع من العمر) في التهوية بشكل فردي مرشح أعلى أقفاص مع حرية الوصول إلى الغذاء القياسية والمياه الإعلانية libitum.
  2. بدء قمع المناعة نظام 24 ساعة قبل الجراحة الحيوان عن طريق إضافة ديكساميثازون (0.4 ملغم / لتر) إلى مياه الشرب للحيوانات. من أجل تجنب أي تلوث بكتيري للمضيف، تكملة مياه الشرب مع المضادات الحيوية، على سبيل المثال، ومسحوق الأمبيسلين الصوديوم (0.5 جم / لتر).
  3. حافظ على كبت المناعة من الحيوانات خلال التجربة بأكملها (تصل إلى 6 أيام).

4. ركائز البولي يوريثين خارج الحي C. البيض التصاق على FBS المغلفة

  1. نقل كل القسطرة قطعة المغلفة المصل الى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  2. كشط بعض C. خلايا البيض نمت على لوحات YPD (الخطوة 1) وتعليق عليها في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. مخفف يمكنخلايا ديدا (1: 100) في أنبوب microcentrifuge منفصلة. يستغرق 10 ميكرولتر من العينة المخففة وتطبيقه على غرفة العد الخلية. عدد لا يقل عن 16 مربعات صغيرة.
  4. إعداد خلايا المبيضات (كل سلالة على حدة) في المتوسط ​​1640 RPMI إلى تركيز النهائي من 5 × 10 4 خلية / مل.
  5. إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل قطعة قسطرة المغلفة المصل.
  6. دوامة بقوة والتأكد من أن القسطرة هي غارقة في المتوسط ​​وليس تطفو على القمة.
  7. احتضان القسطرة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة (مدة التصاق).
  8. إزالة القسطرة مع ملاقط معقمة وغسلها مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. خلال هذه الخطوة تأكد من أن السائل غسل يمر عبر التجويف عن طريق الحفاظ على القسطرة في الوضع الرأسي بينما التنظيف بلطف جدا القسطرة. الأهم من ذلك، لا تستخدم تدفق قوي مما قد يؤدي إلى إزالة خلايا المرفقة.
  9. نقل كل القسطرة غسلها لأنبوب microcentrifuge نظيفة (قطعة واحدة لكل توأن يكون).
  10. ضع على الجليد والحفاظ على وجود حتى الجراحة.

5. التخدير

  1. إعداد التخدير عن طريق خلط 75 ميكرولتر من الكيتامين (100 ملغ / مل) مع 100 ميكرولتر من medetomidine (1 ملغ / مل) و 825 ​​ميكرولتر من محلول ملحي معقم. إدارة البريتونى (IP) 60-80 ميكرولتر من مخدر كوكتيل لكل 10 غرام من وزن الجسم، مما يؤدي إلى جرعة من 45-60 ملغ / كغ الكيتامين و0،6-0،8 ملغ / كغ medetomidine.
  2. لعكس التخدير، وتمييع 50 ميكرولتر atipamezole (5 ملغ / مل) في 4.95 مل المالحة وإدارة الملكية الفكرية 100 ميكرولتر لكل 10 غرام من وزن الجسم كما الترياق، مما أدى إلى جرعة من 0.5 ملغ / كغ.
  3. بعد حقن التخدير، ووضع الحيوان في قفص منفصل والانتظار حتى يتم نائما بالكامل.
  4. تأكيد التخدير المناسب للحيوان عن طريق قرصة خفيفة الجلد وقرصة اصبع القدم، والتي لا تسبب أي ضرر على الجلد. أي حركة لوحظ تشير إلى أن هذا الحيوان هو ليس تخدير بما فيه الكفاية لإجراء عمليات جراحية. إذا حدث هذا، والانتظار لفصول التوجيه الجامعيلا تظهر سبيل من دقائق وقتا أطول حتى الحيوان أي علامات على الحركة على الجلد أو قرصة أخمص قدميه.

6. جراحة الحيوان

  1. نقل تخدير الحيوان من القفص على منديل نظيف وضعها على وسادة التدفئة، تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية (الشكل 2A، (1)).
    ملاحظة: أي بديل أرخص هو استخدام البطانيات ساخنة كهربائيا. ومن الممكن أيضا استخدام منصات متساوي الحرارة، والتي يجب أن تكون درجة حرارة تصل في الميكروويف قبل الجراحة الحيوان.
  2. تطبيق مرهم للعين على العيون.
  3. يحلق أسفل الظهر من الحيوان مع الحلاقة الكهربائية. إزالة جميع الشعر الحيواني ونقل الحيوانات على منديل نظيف. تطهير الجلد (على سبيل المثال، مع 1٪ اليود الأيزوبروبانول أو 0.5٪ الكلورهيكسيدين في الكحول 70٪) ومغادرة المنطقة تطهيرها لتجف لحوالي 1 دقيقة (الشكل 2A، (2)).
  4. إجراء شق صغير في الجلد (واحد على اليسار واحد على الجانب الأيمن من الحيوان) (حوالي 0.5 &# 8211؛ 1 سم) (الشكل 2A، (3)).
  5. تشريح تحت الجلد مع مقص لخلق نفقين تحت الجلد. يجب أن يكون كل نفق حوالي 1.5 سم طويلة و 1 سم.
  6. إدراج ثلاث قطع القسطرة، المصابة سابقا مع المبيضات، في كل نفق. تأكد من أن القسطرة تكمن بجانب بعضها البعض في ترتيب أفقي، وأنها لا تغطي بعضها البعض لتمكين غرس ستة أجزاء قسطرة في مجموع (الشكل 2A، (4)).
  7. إغلاق الشقوق مع الغرز. بدلا من ذلك، استخدم Dermabond لإغلاق الجرح.
  8. تطهير الجرح بلطف شديد مع 0.5٪ الكلورهيكسيدين في 70٪ كحول أو مع الأيزوبروبانول اليود (1٪).
  9. تطبيق مخدر موضعي (هلام الزيلوكائين، 2٪) مباشرة على الجرح.
  10. إدارة عكس التخدير (بروتوكول 5، الخطوة 2): البريتونى 100 ميكرولتر لكل 10 غرام من وزن الجسم.
  11. نقل الحيوان إلى قفص نظيفة وضعت سابقا على لوحة التدفئة. حفاظ على الحيواناتمنفصلة ودافئة حتى الحيوان مستيقظا تماما. وفي الوقت نفسه، مع الاستمرار في تشغيل وزرع الحيوان المقبل. مرة واحدة كل الحيوانات تعمل هي مستيقظا تماما. نقل إلى قفص واحد. مراقبة الحيوانات بانتظام.

التصوير 7. ضوء بارد: إعداد Coelenterazine (CTZ)، والركيزة لG. luciferase المراسل princeps

  1. إعداد coelenterazine الطازجة (CTZ) حل الأسهم عن طريق إذابة 5 ملغ / مل CTZ في الإيثانول يحمض أو وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. إعداد 1.2 ملي حل العمل عن طريق تمييع الحل الأسهم 01:10 في برنامج تلفزيوني العقيمة.
    ملاحظة: حقن 100 ميكرولتر CTZ حلول العمل تحت الجلد في المنطقة المحيطة القسطرة. استخدام المحاقن الأنسولين للحقن تحت الجلد CTZ.
  3. دائما الحفاظ CTZ في الظلام (على سبيل المثال، تغطية أنابيب microcentrifuge تحتوي على CTZ مع رقائق الألومنيوم). تخزين الحل السهم عند -80 درجة مئوية لمدة التجارب.

8. ضوء بارد التصوير

  1. تهيئة الكاميرا BLI.
  2. تخدير الحيوانات باستخدام مربع الاستقراء. استخدام خليط الغاز من الأيزوفلورين في الأكسجين، N 2 O / O 2، أو الهواء في 2-3٪.
  3. بعد الاستقراء، والحفاظ على التخدير في مربع الاستقراء وفي غرفة التصوير في 1.5-2٪.
  4. قبل بدء الدورة والتصوير، ووضع لوحة التصوير في موقف A، والتي تتطابق مع FOV 10 سم. تأكد من أن الموقف الصحيح من وسائل التخدير والحيوانية عن طريق وضع الحيوان النوم في المربع.
  5. خذ قليل من الصور حتى الحيوان هو في موقف التصوير المطلوب، في FOV الحق تحت الكاميرا.
  6. إعداد اثنين من محاقن الأنسولين تحتوي كل منها على 100 ميكرولتر من محلول العمل CTZ.
  7. وضع حيوان واحد على مقاعد البدلاء والحفاظ عليه نائما عن طريق مخروط الأنف التخدير توفير الغاز.
  8. جلب الإبر من المحاقن في مكان المحيطة القسطرة تحت الجلد وحقنوCTZ في وقت واحد على رأس القسطرة.
  9. مباشرة بعد الحقن، ووضع الحيوان على لوحة الدافئة في مربع الكاميرا والبدء في الحصول على الصور تلألؤ بيولوجي.
  10. اكتساب بالاشعة متتالية مع أوقات الاستحواذ تتراوح 20-60 ثانية (اعتمادا على شدة إشارة) حتى يتم التوصل إلى الحد الأقصى للكثافة إشارة. خلال الاستحواذ على الإطار التالي، وقياس كثافة إشارة BLI من الأطر المكتسبة سابقا عن طريق وضع ROI على كل الثلاثي القسطرة وقياس تدفق الفوتون من خلال هذا العائد على الاستثمار.
  11. كرر من الخطوة 7 للحيوان المقبل (ق).
  12. بعد التصوير، والعودة إلى قفص الحيوانات الخاصة بهم. كرر BLI خلال تجربة لالطولي، غير الغازية متابعة تشكيل بيوفيلم.
  13. تحليل البيانات باستخدام BLI المعيشة البرمجيات صورة. وضع ROI مستطيلة من حجم ثابت على كل الثلاثي القسطرة وقياس تدفق الفوتون (وهج) من خلال كل ROI. كرر ذلك كل حيوان.
  14. تقريركثافة إشارة BLI لكل الثلاثة القسطرة كما تدفق فوتون في الثانية الواحدة. تمثيل البيانات BLI على مقياس لوغاريتمي من قبل المتهم بالتآمر في المتوسط ​​وSD من تدفق الفوتون في الثانية لكل مجموعة. إجراء تحليل إحصائي على بيانات السجل 10 تحويلها.

9. قسطرة يزدرع

  1. إعداد أنابيب microcentrifuge تحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني، واحد لكل جهاز قسطرة والاحتفاظ بها على الجليد.
  2. الموت ببطء الحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم (الشكل 2B، (1)).
  3. تطهير الجلد من الجزء الخلفي مع 0.5٪ الكلورهيكسيدين في 70٪ كحول أو مع الأيزوبروبانول اليود (1٪).
  4. إجراء شق (حوالي 3 سم) فوق القسطرة.
  5. قطع الأنسجة تحت الجلد وإزالة شظايا القسطرة واحدا تلو الآخر من تحت النسيج تحت الجلد باستخدام الملقط معقمة (الشكل 2B، (2)).
  6. التعامل مع القسطرة بلطف في الوضع الرأسي، وأغسلها مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. وضع كل قسطرةقطعة في أنبوب microcentrifuge منفصلة (المعد في الخطوة 1).

10. الكمي لبيوفيلم المصاحب الخلايا عن طريق مستعمرة عدد (CFUs) والتحليلات الإحصائية للنتائج

  1. القسطرة يصوتن وضعت مسبقا في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في 40،000 هرتز في sonicator حمام الماء ووضعها على الجليد.
  2. بعد صوتنة، دوامة بقوة لمدة 30 ثانية والمكان مرة أخرى على الجليد.
  3. إعداد اثنين من أنابيب microcentrifuge إضافية تحتوي على 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  4. جعل 1:10 و 1: 100 التخفيفات من العينة الأصلية (واحد الذي يحتوي على القسطرة) والحفاظ على جميع أنابيب microcentrifuge على الجليد.
  5. لوحة 100 ميكرولتر من العينات الأصلية، 1:10 و 1: 100 التخفيفات على لوحات YPD أجار في مكررة.
  6. احتضان لوحات لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية والاعتماد CFUs.
  7. عدد المستعمرات نمت على لوحات YPD أجار (مبلغ معدود من المستعمرات، والحد الأقصى 300 المستعمرات / لوحة) وتتكاثر عليهم من قبل dilu السليمعامل نشوئها (1X-الأصلي، 10X أو 100X التخفيف). وعلاوة على ذلك مضاعفة كل قطعة القسطرة عن طريق 10X، وهو ما يعادل المبلغ النهائي من المستعمرات في 1 مل الأنبوب الذي يحتوي على القسطرة. جلب المبلغ النهائي من المستعمرات إلى تسجيل 10 خلية / قطعة القسطرة مع انحراف معياري (SD). التعبير عن البيانات كما يعني ± SD.
  8. وضع جميع القيم لكل القسطرة ومجموعة معينة في / أو برنامج جداول البيانات والإحصائية، لأداء العمليات الحسابية المذكورة أعلاه والتحليلات الإحصائية. تشير جماعات محددة للمقارنة، أي WT مقابل متحولة أو 2 أيام مقابل. 6 أيام تشكيل بيوفيلم وتنفيذ أونبايريد اختبار t وANOVA مع توكي بعد الاختبار على البيانات حولت LOG10.
    1. التعبير عن مستوى الدلالة التي كتبها قيمة ص. في هذه الدراسة تشير إلى أهمية إذا كانت القيمة P <0.05، ممثلة على النحو التالي: * ف <0.05، ** p <0.005 ***، P <0.0005.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، وتبين لنا الإجراء الجراحي لزرع قسطرة ويزدرع خلال المجراة C. تنمية البيض بيوفيلم في الماوس. وعلاوة على ذلك، فإننا عرض الكمي من الأغشية الحيوية الناضجة ليس فقط من قبل CFUs الكلاسيكية تعداد ولكن أيضا من قبل BLI.

كما هو مبين في الشكل 1A، وقطعت غير الفسفورية القطع القسطرة البولي يوريثان في الأجهزة 1 سم والمغلفة في وقت لاحق مع المصل. هذه الخطوة مهمة جدا لأنها تمكن خلاي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام النماذج الحيوانية، ونماذج القوارض وخاصة، للدراسات مخصصة لالأغشية الحيوية الميكروبية مهم جدا لجهاز المناعة المضيف هو عامل أساسي في تشكيل بيوفيلم أن النماذج في المختبر لا يمكن حساب ل. في هذه الدراسة، نحن تصف تحت الجلد C. واضحة نسبيا البيض نموذج بيوفيلم الماوس، والتي يمكن اعتمادها بسهولة في مختبر البحوث ولا تتطلب مهارات تقنية قوية. وقد تم تطوير هذا النموذج في الأصل لدراسة تشكيل بيوفيلم المكورات العنقودية البشروية في الجرذ 24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل KU Leuven PF 'IMIR' ، مجتمع أبحاث FWO حول علم الأحياء وبيئة الأغشية الحيوية البكتيرية والفطرية (FWO: WO.026.11N) ومشروع FWO G.0804.11. تعترف SK بامتنان ب KU Leuven على زمالة PDMK 11/089 و FWO لزمالة ما بعد الدكتوراه. ونحن ممتنون لنيكو فانغويثيم على مساعدته في إعداد الأرقام. يسعدنا أن نتوجه بخالص الشكر إلى سيليا لوبو روميرو للمساعدة الفنية أثناء الإجراءات التجريبية في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مستخلص الخميرة المحببMerckMERC1.03753.0500
الببتون البكتريولوجيOxoidLP037B
Agar المحببDifco214530
D- (+) -الجلوكوزFluka49159-5KG
محلول ملحي مخزن بالفوسفات   ؛أعدت في المختبرلمقدار 1 لتر من 10 أضعاف PBS: 80 جم كلوريد الصوديوم، 2 غرام كلوريد كلوراما، 14.4 جم من حمض الصوديوم <الفرعي>2HPO4، 2.4 غرام KH2PO4
RPMI1640 مع L-الجلوتامين وبدون كربونات الصوديوم ؛SigmaR6504-1Lالتحضير وفقا لبروتوكول اختبار الحساسية للأدوية المبيضات البيضاء  
3- (N-Morpholino) حمض البروبان سلفونيك (MOPS)SigmaM1254MOPS لضبط درجة الحموضة لوسط RPMI (درجة الحموضة 7.0)
مصل الأبقار الجنينية (FBS)SigmaF7524
قطعة قسطرة وريدية من مادة البولي يوريثين ثلاثية التجويف (قطر 2.4 مم ، Certofix Trio S730)   ؛BBraunCV-15703جزء من البولي يوريثين مقطع إلى قطع 1 سم
ديكساميثازونفاغرون SAS ، فرنسا611139مثبط للمناعة (محلول مخزون 10 مجم / مل)
أمبيسلين   ؛Duchefa Biochemie ، هولنداA0104الوقاية المضادة للبكتيريا
الكيتامين 1000فايزر804 119التخدير
DomitorPfizer134737-1مخدر
مضاد للسيدانPfizer134783-2عكس التخدير
جل Xylocaine (2٪) - هذا هو LinisolAstraZeneca352 1206مخدر موضعي للبشرة
Terramycin/ polymyxin-bللعيون لمنع جفاف وعدوى
العين Coelenterazine Prolume (Nanolight)NF-CTZ-FBعامل حساس للضوء (يجب أن يبقى في الظلام)
اليود إيزوبروبانول (1٪)3M & trade ؛ DuraPrep™  مطهر للبشرة
0.5٪ كلورهيكسيدين في 70٪ كحول.   السيديومللبشرة
معدات
غرفة
محاقن الأنسولين (0.3 مل)Terumo Myjector 29G324826لحقن الحلاقة
للحيوانات الصغيرة
أدواتمقص ، 2 زوج من الملقط ،
مشرط وسادة تسخينLeica14042321474
خياطة الجلدJohnson& جونسونK890Hالخيط الجراحي ، إبرة
حمام مائي سونيكاتيربرانسون 2210
BLI (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, AlamedaIVISSPE
Living Image software Perkin Elmer, Alameda(الإصدار 4.2) 
يستخدم مرهم مطهر عد الخلايا الكهربائية coelenterazine جراحية معقمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
  2. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352(2012).
  3. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  4. Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
  5. Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
  6. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
  7. Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
  8. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
  9. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  10. Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
  11. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
  12. Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
  13. Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
  14. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976(2009).
  15. Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
  16. Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
  17. Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
  18. Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
  19. Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
  20. Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
  21. Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
  22. Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
  23. Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
  24. Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
  25. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة