نقدم وصفا مفصلا لبروتوكول لتحليل قياس التدفق الخلوي للمستضدات السطحية و / أو المستضدات داخل الخلايا في أنواع الخلايا العصبية. يتم شرح الجوانب الحاسمة للتخطيط التجريبي والإجراءات المنهجية خطوة بخطوة والمبادئ الأساسية لقياس التدفق الخلوي من أجل تمكين علماء الأحياء العصبية من استغلال هذه التكنولوجيا القوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التدفق الخلوي بروتوكولات لالسطحية وبين الخلايا مستضد تحليلات العصبية أنواع الخلايا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم استخدام قياس التدفق الخلوي
على نطاق واسع لتحديد مجموعات الخلايا في علم المناعة وأمراض الدم والأورام. هنا ، نقدم وصفا مفصلا لبروتوكولات تحليل قياس التدفق الخلوي لمجموعة المستضدات السطحية للتمايز (CD) والمستضدات داخل الخلايا في أنواع الخلايا العصبية. يتضمن وصفنا خطوة بخطوة للإجراءات المنهجية: حصاد الثقافات العصبية في المختبر ، وخطوة اختيارية لوضع العلامات على الكربوكسي فلوريسين إستر السكسينيميديل (CFSE) ، متبوعة بتلوين المستضد السطحي مع الأجسام المضادة المضغوطة المترافقة (على سبيل المثال ، CD24 ، CD54) ، والكشف اللاحق عن المستضد داخل الطابق عبر الأجسام المضادة الأولية / الثانوية أو شظايا Fab المصنفة بالفلورسنت (وضع العلامات على Zenon). يوضح الفيديو الخطوات الأكثر أهمية. علاوة على ذلك ، يتم شرح مبادئ التخطيط التجريبي ، وإدراج الضوابط الحرجة ، وأساسيات تحليل قياس التدفق الخلوي (تحديد السكان المستهدفين واستبعاد الحطام ؛ استراتيجية البوابات ؛ التعويض عن التداخل الطيفي) بإيجاز من أجل تمكين علماء الأحياء العصبية الذين لديهم معرفة مسبقة محدودة أو تدريب محدد في قياس التدفق الخلوي من تقييم فائدته واستغلال هذه المنهجية القوية بشكل أفضل.
المقدمة
التدفق الخلوي تم استغلاله على نطاق واسع في علم المناعة، أمراض الدم والأورام لتعريف السكان الخلية عن طريق الخصائص الذاتية مبعثر، سطح الخلية مستضد التعبير، والمعلمات مضان أخرى 1-3. لدينا رؤى في التنمية نسب الدم والمرض نتيجة لذلك إلى درجة كبيرة من التحسين المتواصل لهذه المنهجية بعد 4،5 التنفيذ الأولي. زيادة الوعي بإمكانيات التحليلية الكمية والشاملة للالتدفق الخلوي وشجعت في الآونة الأخيرة استخدام أكثر على نطاق واسع في أبحاث الخلايا الجذعية وربما تمكن من التقدم عميق مشابه في إطار زمني أقصر 6. ومع ذلك، منذ فترة طويلة ينظر إلى تطبيق التدفق الخلوي لتحليل تحديدا وعزل السكان العصبي كما تحديا. وعلى النقيض ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. العصبية حصاد خلية
- التقييم من قبل المجهر:
- قبل الشروع في التجربة، تحقق من حالة من الثقافة مع مشرق الميدان أو النقيض من المرحلة المجهري.
ملاحظة: على الرغم من الأنسجة العصبية الأولية التي تم الحصول عليها من تشريح هي، من حيث المبدأ، قابلة أيضا على تحليل تدفق cytometric 14،28، يرجى ملاحظة أن التركيز البروتوكول هو على الخلايا التي تم الحصول عليها من في المختبر نظم خلايا العصبية.
- قبل الشروع في التجربة، تحقق من حالة من الثقافة مع مشرق الميدان أو النقيض من المرحلة المجهري.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بروتوكول المقدمة هنا يسمح للنهج التجريبية تنوعا (الشكل 2). في أقصر نسختها (الخطوات 1 و 3 و 6)، فإنه يمكن أن يعتبر دليلا لتلطيخ بسيط من المستضدات السطحية. في شكله أكثر تعقيدا، وعدد من نماذج التعاون لوضع العلامات مع مجموعة من مستضدات الخلايا يمكن متابعتها (اختياري الخطوات 2 و / أو 4 و 5). وعلاوة على ذلك، فإن الخطوة CFSE وضع العلامات تجسد فائدته لخلايا وضع العلامات / تتبع المجموعات ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتم تأسيس بروتوكول المعروضة هنا بشكل جيد للمزارع الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية، ولكن يمكن أن تطبق على قدم المساواة مع غيرها من مصادر الخلايا العصبية بما في ذلك الأنسجة الابتدائية أو خطوط الخلايا العصبية. بالإضافة إلى مصادر الجنينية، الخلايا الجذعية أو السلف العصبية يمكن استخراجه من المناطق العصبية من الدماغ البالغ 27. وعلاوة على ذلك، التدفق الخلوي وFACS يمكن استغلالها لتحديد وتحليل وعزل السكان الخلية المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية الناضجة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
يتم تمويل برنامجنا البحثي من خلال برنامج إيمي نويثر التابع لمؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) ، منحة PR1132 / 3-1. وأعرب عن امتنانه لمزيد من الدعم المقدم من مؤسسة مولر - فانينبرغ التابعة لجامعة فرايبورغ. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مبادرة التميز لمؤسسة الأبحاث الألمانية (GSC-4 ، كلية سبيمان للدراسات العليا).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 (1:1) (وسط إيجل المعدل من دولبيكو/المزيج الغذائي F-12) |  Life Technologies | 11330057 | |
| DPBS بدون Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14190169 | |
| مصل جنين البقر، مؤهل، معتمد من الاتحاد الأوروبي، منشأ أمريكا الجنوبية (FBS) | Life Technologies | 10270-106 | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x) | Life Technologies | 11140035 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
| محلول تريبان بلو، 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| بارافورمالدهيد | Carl Roth | 335.3 | |
| ألبومين المصل البقري (BSA) جزء V | PAA Laboratories, Coelbe | K41-001 | |
| منظف Tween-20 | Calbiochem | 655205 | |
| إستر سكسينيميديل كاربوكسيفلوريسين (CFSE) | eBioscience | 65-0850-84 | |
| DMSO | AppliChem | A1584 | |
| مرشحات أعلى الزجاجة express plus 0.22 µm، 250 ml | Millipore | SCGPU02RE | |
| دوارق معالجة لزراعة الخلايا (T 25) | NUNC | 156367 | |
| دوارق معالجة لزراعة الخلايا (T 75) | NUNC | 156499 | |
| أنابيب مخروطية (15 ml) | Greiner Bio-One | 188271 | |
| أنابيب مخروطية (50 ml) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| ماصة باستور، زجاجية (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen | S03710150 | |
| رؤوس ماصات (0.1-10 µl) | Corning | 4125 | |
| رؤوس ماصات (1-200 µl) | Corning | 4126 | |
| رؤوس ماصات (100-1000 µl) | Corning | 4129 | |
| ماصات سيرولوجية، 5 ml | Corning | 4051 | |
| ماصات سيرولوجية، 10 ml | Corning | 4101 | |
| ماصات سيرولوجية، 25 ml | Corning | 4251 | |
| أنابيب طرد مركزي صغيرة (0.5 ml) | Sarstedt | 72,699 | |
| أنابيب طرد مركزي صغيرة (1.5 ml) | Greiner Bio-One | 616201 | |
| أنابيب طرد مركزي صغيرة (2.0 ml) | Sarstedt | 72,695,500 | |
| جسم مضاد أحادي النسيلة anti-Human CD24 APC | eBioscience | 17-0247-42 | تخفيف التشغيل 1:50 |
| جسم مضاد أحادي النسيلة anti-Human CD54 PE | eBioscience | 12-0549-42 | تخفيف التشغيل 1:50 |
| جسم مضاد متعدد النسائل Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) | Covance | PRB-435P | تخفيف التشغيل 1:2,000 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies | A21206 | تخفيف التشغيل 1:2,000 |
| طقم وسم Zenon® Fluorescein Rabbit IgG | Life Technologies | Z-25342 | |
| غرفة عد Neubauer-Improved | Marienfeld | 0640010 | |
| جهاز مزج دوامي (Vortex) | Scientific Industries | G560E | |
| جهاز Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.001 | |
| مقياس تدفق خلوي Accuri C6 | Becton Dickinson (BD) | 653118 | |
| جهاز طرد مركزي صغير مبرد، PerfectSpin 24 R | Peqlab | 91-PSPIN-24R | |
| هزاز مداري، Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| جهاز طرد مركزي مبرد، Rotanta 96 RC | Hettich | 4480-50 | |
| كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية Safe 2020 | Thermo Scientific | 51026640 | |
| حاضنة CO2، Heracell 240i | Thermo Scientific | 51026331 | |
| نظام تفريغ، Vacusafe comfort | Integra Biosciences | 158320 | |
| مجهر، Axiovert 40 CFL | Zeiss | 451212 | |
| جهاز تحكم في الماصة، accu-jet pro | Brand | 26303 | |
| ماصة دقيقة، Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson | F144563 | |
| ماصة دقيقة، Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson | F144565 | |
| ماصة دقيقة، Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson | F144566 |
المراجع
- Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
