أداء تحت الشبكية الحقن في القوارض لتسليم خلايا الظهارة الصبغية الشبكية في تعليق

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا مقبولا من قبل المجتمع بتنسيق وسائط متعددة لحقن بلعة من خلايا RPE تحت الشبكية في الفئران والفئران. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد إمكانات الإنقاذ وملامح السلامة وقدرات البقاء على قيد الحياة لخلايا RPE المطعمة عند زرعها في نماذج حيوانية لتنكس الشبكية.

الملخص

تحويل الضوء إلى نبضات كهربائية يحدث في شبكية العين الخارجي ويتم إنجاز إلى حد كبير قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية في شبكية العين والظهارة الصبغية (RPE) الخلايا. RPE تقديم الدعم الحاسم لخلايا مستقبلة للضوء وفاة أو خلل في الخلايا RPE هو سمة من-الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، والسبب الرئيسي لفقدان البصر الدائم في الناس سن 55 فما فوق. في حين لم يتم التعرف على علاج لAMD، زرع RPE صحي في عيون المريضة قد يثبت أنه علاج فعال، وأعداد كبيرة من الخلايا RPE يمكن أن تتولد بسهولة من الخلايا الجذعية المحفزة. عدة أسئلة مثيرة للاهتمام فيما يتعلق بسلامة وفعالية تسليم خلية RPE لا يزال من الممكن فحص في النماذج الحيوانية، ولقد تم تطوير بروتوكولات مقبولة تماما تستخدم لحقن RPE. وقد استخدمت هذه التقنية الموصوفة هنا من قبل جماعات متعددة في مختلف الدراسات وتتضمن إنشاء أول حفرة في العين مع إبرة حادة. ثم حقنة مع بلويتم إدخال إبرة الإقليم الشمالي محملة الخلايا من خلال ثقب ومرت من خلال الجسم الزجاجي حتى يلمس بلطف RPE. باستخدام هذه الطريقة حقن، التي هي بسيطة نسبيا وتتطلب الحد الأدنى من المعدات، ونحن تحقيق التكامل متسقة وفعالة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا RPE في فترة ما بين RPE المضيف الذي يمنع كمية كبيرة من انحطاط مستقبلة للضوء في النماذج الحيوانية. بينما لا تشكل جزءا من بروتوكول الفعلي، نحن تصف أيضا كيفية تحديد مدى الصدمة الناجمة عن الحقن، وكيفية التحقق من أن الخلايا تم حقن في الفضاء تحت الشبكية باستخدام طرائق التصوير في الجسم الحي. وأخيرا، فإن استخدام هذا البروتوكول لا يقتصر على الخلايا RPE. يمكن استخدامه لحقن أي مركب أو خلية في الفضاء تحت الشبكية.

المقدمة

يتم تنظيم الشبكية الحسية في طبقات وظيفية من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية والخلايا البطانية. يتم تنشيط المستقبلات الضوئية في الجزء الخلفي من شبكية العين عن طريق الضوء. من خلال التنبيغ الضوئي ، يقومون بتحويل الفوتونات إلى إشارات كهربائية يتم تكريرها بواسطة الخلايا العصبية الداخلية ونقلها إلى القشرة البصرية في الدماغ. لا يمكن أن يحدث التنبيغ الضوئي بدون الجهود المنسقة لخلايا Mueller الدبقية وظهارة الشبكية الصبغية (RPE). يتم تنظيم RPE في طبقة أحادية خلف المستقبلات الضوئية مباشرة وتؤدي وظائف متعددة ومتنوعة لا تتجزأ من وظيفة المستقبلات الضوئية والتوازن. في الواقع ، تعتمد RPE والمستقبلات الضوئية على بعضها البعض لدرجة أنها تعتبر وحدة وظيفية واحدة. يؤدي الموت أو الخلل ال....

البروتوكول

ملاحظة: تم علاج جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعها معهد سكريبس للأبحاث.

1. إعداد مواد لحقن (~ 20 دقيقة)

1. قبل دافئ الحل تفارق الخلية (ويفضل أن يكون واحد هو أن المعطل من خلال التخفيف، وليس مع المصل)، برنامج تلفزيوني العقيمة، وسائل الإعلام والثقافة (الجدول 1).
2. تعقيم حقنة بإبرة حادة من قبل تفكيك ذلك والمغلي الأجزاء في الماء لمدة 15 دقيقة.

النتائج

يمكننا تقديم تعليق الخلايا RPE في الفضاء تحت الشبكية من القوارض بسرعة وباستمرار باستخدام تقنية الموضحة في هذه المخطوطة. في حين ليس مطلوبا، صدمات يمكن التقليل إلى حد كبير باستخدام الإعداد يظهر مع مياداة مجهرية في الشكل 1A & B. عقد القوارض كما هو مبين في الشكل 1C لجحوظ مؤقت. الخطوات هي نفسها إذا أجريت مع مياداة مجهرية أو باليد. وصفت هذه في الرسوم المتحركة في الشكل 1D. عندما يقوم نظيفة مضان من الخلايا المسمى RPE يمكن الكشف عنها ب.......

المناقشة

في هذه المقالة وصفنا طريقة بسيطة نسبيا لأداء الحقن تحت الشبكية من خلايا RPE معلق في الجرذان والفئران. بروتوكول من السهل تعلم والمزيد من الخبرة مع هذه التقنية سوف تترجم في أقل الصدمات (الشكل 3، وهذا يمثل واحدا من أفضل الحقن)، وخاصة إذا تم استخدام مياداة مجهرية (الشكل 1A). يمكن رصد أي صدمة في الجسم الحي مع نظام cSLO وأكتوبر (الشكل 2) إذا كانت متوفرة. وإذا رغبت دقة أعلى وأقل صاخبة الصور، حالة من منصات فن التصوير متوفرة، جنبا.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco   ؛	21985-023	50 مل × 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	حالة × 1
CellTracker أخضر CMFDA	مجسات جزيئية	C34552	50 & micro ؛ ز × 20
DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم	Gibco	14190-144	500 مل × 1   ؛
سريع أخضر	سيجما ألدريتش	F7258	25 جم × 1
جنتيل جل قطرات معتدلة إلى شديدة زيوت التشحيم قطرات العين	وول مارت	4060941	25 مل × 1
هاميلتون موديل 62 RN SYR	هاميلتون	87942	حقنة × 1   ؛
إبرة هاميلتون 33 جم ، 0.5 بوصة ، النقطة 3 (304 الفولاذ المقاوم للصدأ)	إبر هاميلتون	7803-05	× 6
ضربة قاضية DMEM	Gibco	10829-018	500 مل × 1   ؛
بديلة مصل بالضربة القاضية	جيبكو	10828-028	500 مل × 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 مل × 1
حامل مغناطيسي	Leica Biosystems	39430216	Stand × 1
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X & nbsp ؛	Gibco	11140-050	100 مل × 1
مناور Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	× 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U / ml)	Gibco	15140-122	100 مل × 1
محاقن ذات طرف منزلق بدون إبر BD & nbsp ؛ (3 مل)	حزمة BD309656 VWR		× 1
إبر للاستخدام المتخصص BD & nbsp ؛ (30 جم ، 1 بوصة)	VWR		BD305128 Box × 1
إنزيم TrypLE Express (1X) ، بدون فينول	أحمر Gibco	12604013	100 مل × 1