يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المستمدة الشبكية الظهارة الصبغية (RPE) من المستحثة متعددة القدرات الجذعية (آي بي إس) الخلايا عن طريق أحجام مختلفة من الهيئات مضغي

10K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52262

⸱

فبراير 4, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا التقرير هو لوصف بروتوكولات لاستخلاص الظهارة الشبكية الصباغ (RPE) من الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا باستخدام أحجام مختلفة من الهيئات مضغي الشكل.

الملخص

تمتلك الخلايا الجذعية متعددة القدرات القدرة القدرة على التكاثر إلى أجل غير مسمى والتمايز إلى أي نوع من الخلايا تقريبا. بالإضافة إلى ذلك ، أدى تطوير تقنيات لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPS) إلى إثارة الاهتمام والإثارة تجاه إمكانية الطب التجديدي الشخصي المخصص. ومع ذلك ، فإن كفاءة تمايز الخلايا الجذعية نحو النسب المطلوب لا تزال منخفضة. الغرض من هذه الدراسة هو وصف بروتوكول لاشتقاق ظهارة صبغة الشبكية (RPE) من خلايا iPS (iPS-RPE) من خلال تطبيق نهج هندسة الأنسجة لتوليد مجموعات متجانسة من الأجسام الجنينية (EBs) ، وهو وسيط شائع أثناء التمايز في المختبر. يطبق البروتوكول تشكيل حجم معين من EBs باستخدام تقنية لوحة microwell. كما يتم شرح طرق تحديد علامات البروتين والجينات ل RPE عن طريق الكيمياء الخلوية المناعية وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR). أخيرا ، يتم وصف كفاءة التمايز في أحجام مختلفة من EBs التي يتم مراقبتها بواسطة تحليل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لعلامات RPE. ستسهل هذه التقنيات تمايز خلايا iPS إلى RPE للتطبيقات المستقبلية.

المقدمة

الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا التي يسببها هي نوع من الخلايا الجذعية المحفزة المشتقة عن طريق إعادة برمجة خلايا بالغة مع العوامل الخارجية 1. في المقابل، الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، ونوع آخر من الخلايا الجذعية المحفزة، يتم إنشاء من الكتلة الخلوية الداخلية من الكيسة 2-3. وعلى الرغم من أصولها المختلفة، خلايا الجذع والمجالس الاقتصادية والاجتماعية قابلة للمقارنة في قدرة غير محدودة لتكرار في التجارب المختبرية وقدرتها على التمايز إلى أي نوع من الخلايا 4-5. هذه الخصائص من خلايا الجذع جعلها المرشحين مثالية لتطبيقات في شخصية الطب التجديدي. وتتركز الجهود البحثية الأخيرة على تطوير بروتوكولات التمايز قوية لإنتاج خلايا بالغة متخصصة بما في ذلك الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) 6-11.

لالتطبيقات السريرية المحتملة للخلايا الجذع المشتقة، والتمايز الموجهة لهذا النوع من خلية معينة أمر ضروري. وهناك طرق مختلفةنشرت للتمايز موجهة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية والجذع خلايا كلا في RPE التي تختلف اختلافا كبيرا في كفاءتها 6-7، 12-16. ونحن ما زلنا لا نعرف الكثير من الأحداث الجزيئية التي تتحكم في مصير خلية / الأنسجة أثناء تطوير أو التمايز. في السنوات الأخيرة، بذلت جهود لتطوير بروتوكول التمايز التي يمكن أن تحاكي التطور الجنينى قدر الإمكان. خلال مرحلة الكيسة الأريمية، والسكان غير الملتزم به والخلايا الجذعية هي معا في المكروية ثلاثية الأبعاد. لذلك، طبقت استراتيجيات مختلفة لجعل خلايا ESC / IPS تجميعها معا وتنمو لهم في ثلاثة أبعاد. وتسمى هذه المجاميع الخلايا الجذعية الهيئات مضغي الشكل (EBS). وقد أظهرت الدراسات أن EB تمايز الخلايا الجذعية تحاكي المرحلة المبكرة من تطور الجنين ويمكن أن تعطي بشكل عفوي أدى إلى الأديم الباطن البدائي على سطحه الخارجي. وفي وقت لاحق، كما تقدم EB التنمية، الظواهر خلية متمايزة من كل الأنساب الجرثومية الثلاث تظهر 17-18. عشرerefore، جذبت EBS بروتوكولات التمايز القائم على الكثير من الاهتمام لفي المختبر تمايز الخلايا ESC / الجذع وتكون مرشحا جيدا لتوليد RPE من الخلايا الجذعية المحفزة (13).

EBS يمكن أن يتم باستخدام عدة أساليب من خلايا ESC / IPS. في البداية، أدلى EBS عن طريق كشط قبالة المستعمرات ملتصقة والحفاظ عليها في الثقافة تعليق غير ملتصقة. ومع ذلك، فإن هذا النهج غلة السكان غير متجانسة من EBS الذي يسبب انخفاض التكاثر. شنقا انخفاض زراعة الخلايا وmicrowell تشكيل EBS المعتمدة على تقنيات الشعبية الأخرى لتشكيل EBS التي تسفر EBS متجانسة من الأحجام المحددة التي هي تكرار للغاية. وعلاوة على ذلك، يمكن للتقنية microwell تسفر عن عدد كبير من المجاميع مع أقل جهد.

وينظم تمايز الخلايا داخل EBS من متعدد من العظة morphogenic من المكروية خارج الخلية والخلايا. وعلى النقيض من التمايز في مونشكل olayer، EBS توفير منصة لتجميع معقدة من الخلايا والإشارات بين الخلايا أن تحدث 17. ومن المثير للاهتمام، لوحظ عدد من الخلايا الجذعية المحفزة التي استخدمت لصنع EBS الفردية للتأثير على مصير الخلايا. على سبيل المثال، في دراسة التمايز المكونة للدم من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان، لوحظ أن 500 خلية EB الترويج التمايز نحو الأنساب النخاعي في حين دفعت 1،000 خلية EB نحو محمر النسب 20. وفي دراسة أخرى، فضلت EBS أصغر الأديم الباطن التمايز في حين EBS أكبر روجت نحو العصبية الأديم الظاهر التمايز 11، 17.

هذه الدراسات السابقة تشير بقوة إلى أن عدد الخلايا ESC / IPS المستخدمة لجعل EBS الفردية تؤثر على EBS التمايز القائم على أي من أنواع الخلايا. ومع ذلك، على حد علمنا، لا توجد دراسات الحالية التي توضيح تأثير حجم EBS في نزوعها إلى التفريق نحو RPE. والهدف من هذه الدراسة هو لتوصيف تأثيرحجم EB على يسببها المحفزة الجذعية (آي بي إس) خلايا - الظهارة الصبغية الشبكية (IPS-RPE) التمايز وتحديد عدد الخلايا الأمثل لجعل EBS للتمايز الموجهة نحو RPE النسب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الكواشف الثقافة ومركبات الثقافة

  1. إعداد خالية من تغذية الخلايا الجذعية مستنبت بإضافة 100 مل من 5X المصل خالية ملحق إلى 400 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة القاعدية. المتوسط ​​مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع وعند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
  2. إضافة 10 ميكرومتر حل المرتبط رو، ملفوف لفائف تحتوي على بروتين كيناز (روك) المانع (Y-27362) لمتاحة تجاريا الجسم مضغي الشكل (EB) تشكيل المتوسطة.
  3. إعداد التمايز المتوسطة بإضافة 0.1 ملم β المركابتويثانول، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، 2 مم L-الجلوتامين، و 10٪ استبدال المصل خروج المغلوب (KSR) و 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لDulbecco لتعديل النسر متوسطة / المغذيات خليط F-12 (DMEM / F12).
  4. إعداد IPS-RPE المتوسطة عن طريق إضافة 1X N1 ملحق، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، 250 ميكروغرام / مل التورين، 13 نانوغرام / مل triiodo-L-ثيرونين ملح الصوديوم، / مل الهيدروكورتيزون 20 نانوغرام، 5 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و 15٪ مصل بقري جنيني (FBS) <سوب> 21 إلى الحد الأدنى الضروري المتوسطة النسر (MEM). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
  5. إعداد triiodo-L-ثيرونين حل الصوديوم الأسهم الملح. حل 1 ملغ من triiodo-L-ثيرونين ملح الصوديوم في 1 N هيدروكسيد الصوديوم من قبل يحوم بلطف. إضافة 49 مل من MEM لجعل 50 مل من 20 ميكروغرام / مل من triiodo-L-ثيرونين ملح الصوديوم. إعداد مأخوذة وتجميد في -20 ° C لحين الحاجة إليها. استخدام حجم مناسب لتحقيق التركيز المطلوب في مستنبت النهائي.
  6. إعداد الهيدروكورتيزون حل الأسهم. ذوبان 1 ملغ من الهيدروكورتيزون في 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ عن طريق الإثارة لطيف. إضافة 19 مل من MEM لجعل 20 مل من 50 ميكروغرام / مل حل الأسهم الهيدروكورتيزون. قسامة والتجميد في -20 ° C لحين الحاجة إليها. استخدام حجم مناسب لتحقيق التركيز المطلوب في مستنبت النهائي.
  7. يعد حل عمل dispase من 1 ملغ / مل في DMEM / F12.
  8. إعداد مصفوفة المغلفة لوحات
    1. إعداد مصفوفة البروتين المستخرج من Engelbreth-هولم-سرب (EHS) مذكرة التفاهمخلايا ساركوما حد ذاتها في DMEM / F12 إلى 0.08 ملغ / مل. معطف كل بئر من لوحة 6 جيدا مع 1 مل من محلول المصفوفة. احتضان لوحات مغلفة في RT لمدة 1 ساعة.
    2. بعد حضانة 1 ساعة، نضح الزائد DMEM / F12. إضافة 0.5 مل من خالية من تغذية الجذعية خلية ثقافة المتوسط ​​لمنع جفاف الآبار. لوحات مصفوفة المغلفة جاهزة للاستخدام.
  9. إعداد لوحات microwell، وذلك بدهن كل جيدا مع 2 مل من DMEM / F12. إزالة DMEM / F12 وإضافة 0.5 مل من تشكيل EB المتوسطة تستكمل مع روك المانع إلى كل بئر. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2،000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة أي فقاعات الهواء.
  10. إعداد FACS العازلة تلطيخ عن طريق خلط 2٪ FBS، وبنسبة 0.09٪ أزيد الصوديوم في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ضبط العازلة لدرجة الحموضة 7.4.
  11. إعداد التربسين حل تحييد بإضافة 10٪ FBS لDMEM / F12.

2. الجذع الثقافة

  1. قبل الجذع البذر الخلية، دافئة خالية من تغذية الجذعية خلية ثقافة المتوسط ​​إلى 37 درجة مئوية، ويكون أماهتريكس المغلفة لوحات جاهزة.
  2. ذوبان الجليد بسرعة الخلايا IMR90-1 الجذع في 37 ° C حمام الماء. ثم إزالة القارورة-البرد من حمام الماء ومسح القارورة مع الايثانول 70٪. نقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي باستخدام ماصة 2 مل لتقليل كسر كتل الخلية.
  3. إضافة 5 مل باب الحارة خالية من تغذية الخلايا الجذعية مستنبت للخلايا قطرة قطرة وتخلط بلطف. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT وإزالة طاف.
  4. و resuspend بعناية كتل الخلايا في 2 مل من خالية من تغذية الخلايا الجذعية مستنبت والبذور كتل الخلايا في الآبار لوحة المغلفة المصفوفة. وضع لوحة في حاضنة C 37 درجة مع 5٪ CO 2، 95٪ الرطوبة.
  5. تغيير الجذع خلية ثقافة المتوسط ​​يوميا. مراقبة مستعمرات غير متمايزة خمسة إلى سبعة أيام بعد البذر. التحقق من وجود مستعمرات غير متمايزة التي هي على استعداد للمرور (المستعمرات مع مركز كثيف) تحت المجهر الضوئي.

3. الركض من خلايا الجذع

  1. لمرور الخلايا المحفزة قبل البداية، تدفئة حل dispase، DMEM / F12 وخالية من وحدة التغذية الجذعية خلية ثقافة المتوسط ​​إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. قبل الركض الخلايا الجذع، وإزالة أي مجالات التمايز عن طريق كشط المنطقة والشفط والمتوسطة. شطف بعناية خلايا الجذع مع 2 مل DMEM / F12.
  3. إضافة 1 مل من 1 ملغ / مل dispase إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. نضح dispase وشطف بلطف المستعمرات الخلية مع 2 مل من DMEM / F12 مرتين. بعد الشطف، إضافة 2 مل من خالية من تغذية ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة إلى كل بئر.
  4. باستخدام ماصة 5 مل كشط بلطف المستعمرات من لوحة لتشكيل كتل الخلية. نقل كتل خلية منفصلة لأنبوب مخروطي 15 مل. إضافة كافية خالية من تغذية ثقافة الخلية الجذعية متوسطة إلى البذور مرور القادم من الخلايا.

4. توليد EBS عن طريق Microwell لوحات

  1. إعداد تعليق خلية واحدة من خلايا الجذع
    1. إزالة جامعة المدينة العالميةمتر من خلايا الجذع وشطف خلايا الجذع مع 2 مل من DMEM / F12. إضافة 750 ميكرولتر من accutase إلى خلايا الجذع في كل بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للسماح للخلايا لفصل من لوحة (حوالي 5-10 دقيقة).
    2. استخدام ماصة لفصل بلطف أي الخلايا المتبقية وفصل أي الخلايا المتبقية على سطح اللوحة. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل. شطف لوحة مع 5 مل من DMEM / F12 والجمع بين تشطف DMEM / F12 مع الخلايا في أنبوب مخروطي الشكل. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون لإزالة أي كتل الخلايا المتبقية ممكنة.
    3. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT لإزالة accutase. resuspend الكرية خلية في EB تشكيل المتوسطة بحيث تركيز الخلية حوالي 0.5-1.0 × 10 7 خلية / مل.
    4. تحديد عدد خلايا قابلة للحياة عن طريق عد الخلايا مع التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
  2. Adjustinز كثافة الخلايا في microwells لتشكيل EBS التي تسيطر عليها حجم
    1. ضبط عدد من الخلايا لكل بئر من لوحة microwell لتوليد أحجام EB المطلوب. إضافة الخلايا إلى microwells من لوحات أعدت في الخطوة 1.9، بالتساوي توزيع الخلايا عن طريق pipetting بلطف الخلايا عدة مرات.
      ملاحظة: عدد الخلايا المطلوبة لكل بئر = المرجوة عدد الخلايا في EB × عدد microwells لكل بئر.
    2. ضبط تشكيل المتوسطة EB تستكمل مع روك المانع في الآبار إلى الحجم النهائي من 2.0 مل. إعادة توزيع الخلايا عن طريق pipetting بلطف كل بئر. أجهزة الطرد المركزي لوحات microwell في 100 x ج لمدة 3 دقائق. وضع لوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة لمدة 24 ساعة.
  3. EBS الحصاد من لوحات microwell
    1. حصاد EBS من microwells من قبل pipetting المتوسطة في البئر صعودا وهبوطا مع 1 مل micropipettor لإزالة معظم EBS. تمرير تعليق EB من خلال خلية 40 ميكرون مقلوبمصفاة على رأس أنبوب مخروطي 50 مل لإزالة الخلايا واحد.
    2. غسل لوحة microwell 5 مرات مع 1 مل من DMEM / F12 لإزالة كافة EBS. جمع يغسل وتمر عبر مصفاة خلية مقلوب. تحويل مصفاة الخلية من الناحية اليمنى تصل إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. جمع EBS بغسل مع EB تشكيل المتوسطة. عدد EBS لتحديد العائد.

5. تصفيح EBS وبدء التمايز

  1. لوحة للEBS على مصفوفة البروتين المغلفة ست لوحات جيدة (كما في الخطوة 1.8.1) في كثافة <1،000 EBS / جيد في EB تشكيل المتوسطة بالإضافة إلى 10 ميكرومتر روك المانع. احتضان EBS عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة لمدة 24 ساعة.
  2. 24 ساعة بعد EB الطلاء، مع استبدال التمايز المتوسطة لبدء التمايز. تغيير نصف المتوسط ​​التمايز كل يوم حتى يتم جمع الخلايا لمزيد من التحليل.
  3. جمع العينات في يوم 6، 17، 29 و 60 لإجراء RT-PCR، IMMunocytochemistry وFACS للتحقق من صحة التعبير عن الجينات RPE مميزة والبروتينات.

6. استخراج الحمض النووي الريبي وPCR

  1. استخراج الحمض النووي الريبي من عينات EB وفقا لتعليمات المنصوص عليها في عدة متاحة تجاريا. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام معمل.
  2. أداء النسخ العكسي على 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع وفقا لRNA المتاحة تجاريا ل[كدنا عدة نسخة عكسي.
  3. أداء PCR مع 10 نانوغرام من [كدنا] باستخدام بادئات التالية (الجدول 1) بتركيز 10 ميكرومول / 10 نانوغرام من [كدنا]. تعيين PCR على النحو التالي: تفسد الحمض النووي في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، مع تضخيم 35 دورات على 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها دورة النهائية في 72 ° C لمدة 10 دقيقة. تشغيل المنتج PCR على 1٪ الاغاروز هلام.

7. كيمياء سيتولوجية مناعية

  1. غسل EBS مع برنامج تلفزيوني مرتين في RT. إصلاح EBS في RT في 4٪ paraformaldehyde لمدة 10 دقيقة. شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في RT. مخزن العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى استخدامها لتلطيخ.
  2. في يوم تلطيخ، وعلاج الخلايا ثابتة مع تثبيت وpermeabilization الكواشف. احتضان هذه العينات مع عرقلة الحل (10٪ مصل الماعز في حل permeabilization) لمدة 1 ساعة على RT.
  3. أداء كيمياء المناعة في 10٪ مصل الماعز في حل permeabilization باستخدام الأجسام المضادة الأولية التالية في التخفيفات المبين: مكافحة Pax6 (01:10)، ومكافحة RX (1: 200)، ومكافحة MITF (01:30)، ومكافحة ZO1 (1: 100). احتضان عينات مع الأجسام المضادة O / N المقابلة في 4 درجات مئوية.
  4. اليوم التالي، وإزالة الأجسام المضادة الأولية من الخلايا وشطف العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان عينات مع الأجسام المضادة الثانوية fluorophore مترافق لمدة 1 ساعة على RT.
  5. إزالة الأجسام المضادة الثانوية من الخلايا وشطف العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. تركيب غطاء ينزلق على الشرائح الزجاجية مع دابي تحتوي على تصاعد المتوسطة والسماح عينات لضبط O / N في غرفة مظلمة.استخدام المجهر مضان لتصور تلطيخ.

8. تلطيخ لتحليل FACS

  1. غسل EBS مثقف في برنامج تلفزيوني مرتين. احتضان EBS مع 0.5 مل من 0.25٪ التربسين لمدة 5-10 دقائق لجعل تعليق خلية واحدة. تحييد التربسين مع الحل التربسين تحييد (1 مل / جيد).
  2. نقل تعليق خلية واحدة إلى 15 مل أنبوب مخروطي وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة.
  3. تجاهل طاف وإضافة 10 مل من DMEM / F12 إلى الخلايا في الأنبوب. عكس بلطف لمزج الخلايا. الطرد المركزي في 600 × ز. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف و resuspend الخلايا في FACS العازلة تلطيخ.
  4. عد العدد الكلي للخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة. بعد الطرد المركزي تجاهل طاف. إصلاح الخلايا على الفور بإضافة 0.5 مل من 4٪ امتصاص العرق. مزيج جيد من قبل vortexing لطيف. احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة وإزالةطاف. دوامة برفق لتعطيل بيليه الخلية. Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول permeabilization المبردة. دوامة برفق لخلط واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة وإزالة طاف. إضافة 3 مل من FACS العازلة تلطيخ و resuspend. كرر هذه الخطوة مرة أخرى. resuspend الخلايا في FACS العازلة تلطيخ بتركيز نهائي من 5 × 10 6 خلية / مل.
  7. نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية (0.5 × 10 6 خلايا) لكل أنابيب microfuge وإضافة حجم الموصى بها من الأجسام المضادة الأولية. لPax6، إضافة 5 ميكرولتر من PE مكافحة Pax6 في 100 ميكرولتر من التعليق الخلية. لMITF، إضافة 5 ميكرولتر من مكافحة MITF في 100 ميكرولتر من التعليق الخلية.
  8. خلط واحتضان عند RT لمدة 60 دقيقة. إضافة 3 مل من FACS العازلة تلطيخ. خلط وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف وتكرار 8.16 لمرتين إضافية.
  9. لMITF تلطيخ، واحتضان الخلايا في antibo الثانويدى والماعز لمكافحة فأر اليكسا فلور 488 في التخفيف من 1: 2،000 لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. لPax6 تلطيخ، وتجنب هذه الخطوة.
  10. غسل الخلايا مع 5 مل من FACS العازلة تلطيخ وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر العملية مرتين أخريين.
  11. resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من FACS العازلة تلطيخ ودوامة بلطف لعرقلة بيليه الخلية. عينات جاهزة للتحليل تدفق cytometric.

9. IPS-RPE العزلة والثقافة

  1. في يوم 29، وقطع بعناية حول المستعمرات المصطبغة مختارة من لوحة الثقافة باستخدام ماصة غيض 200 ميكرولتر. نقل المستعمرات العائمة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي المستعمرات في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في RT وإزالة طاف.
  2. Resuspend والمستعمرات خلية في 10 مل من DMEM / F12 وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف.
  3. إعداد تعليق خلية واحدة التي يحتضنها المستعمرات مع 2 مل من 0.25٪ التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 7-10 دقيقة. دوامة بلطف تعليق خلية لفصل المستعمرات.
  4. تحييد التربسين بإضافة 2 مل من IPS-RPE المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة وتجاهل طاف. resuspend الخلايا وحيدة في 2 مل من IPS-RPE المتوسطة. نقل الخلايا في مصفوفة البروتين المغلفة لوحة 6 جيدا ومكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه التجربة، كانت خلايا الجذع مثقف ومتميزا في النسب RPE من EBS. وتم تشكيل EBS من الأحجام التحكم باستخدام لوحات microwell. كما رأينا في الشكل 1 EB تشكيل كانت متجانسة في لوحات microwell. وكانت هذه EBS ثم جمعها ومطلي على 6 لوحات جيدا (الشكل 2).

RPE يمكن تحديدها من قبل الكلاسيكيه سداسية التشكل، وتصبغ، والتعبير عن علامات RPE. بعد 12 أسبوعا من الثقافة، وكانت 200 خلية EBS المتقدمة نج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لتحقيق الوعد الكامل للخلايا الجذعية المحفزة لعلاج الخلايا، فمن الضروري لتنظيم التمايز بهم بطريقة متسقة وقابلة للتكرار. ويصف هذا التقرير بروتوكولات لتشكيل EBS التي تسيطر عليها حجم استخدام التكنولوجيا لوحة microwell، والشروع في التمايز نحو RPE وتحديد البروتين والجينات علامات RPE. لمزامنة التمايز في المختبر، وتم تشكيل الأحجام متجانسة من EBS بواسطة أرقام معروفة من خلايا الجذع طرد في لوحات microwell طريق التجميع القسري. وتستخدم مناعية وعكس النسخ تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-PCR)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

الآراء أو التأكيدات الواردة هنا هي وجهات نظر خاصة للمؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها رسمية أو تعكس وجهات نظر وزارة الجيش أو وزارة الدفاع. تم إجراء هذا البحث بينما كان المؤلفون ألبرتو مونيز وراميش آر كايني وويتني إيه جرين وجاي هيك تشوي يحملون زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه في المجلس الوطني للبحوث في USAISR. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج أبحاث الطب التأهيلي السريري للجيش الأمريكي (CRMRP) وبرنامج أبحاث الطب التشغيلي العسكري (MOMRP).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسائط mTeSR1 + مكمل 5xتقنيات الخلايا الجذعية5850
Y-27632 (مثبط الصخور)تقنيات الخلايا الجذعية72304
DMEM / F12Life Technologies11330-032
2-MercaptoethanolSigmaM-7154
الأحماض الأمينية غير الأساسيةHyclone (Fisher)SH30853.01
استبدال مصل الضربة القاضيةLife Technologies10828-028
Gentamicin لايف تكنولوجيز15750-060
L-GlutamineLife Technologies25030-081
MEM mediaLife Technologies10370-021
N1 supplementSigmaN-6530-5ML
TaurineSigmaT-8691-25G
HydrocortisoneSigmaH0888-1G
بقرة الجنين مصلهيكلون (فيشر)SH3008803HI
ترييودو-إل-ثيرونين الصوديوم   ملحسيجماT6397
هيدروكسيد الصوديومسيجماS5881
ديسبازلايف تكنولوجيز17105-041
ماتريجلBD Biosciences354277
الفوسفات المحلول الملحيالمخزن هيكلون (فيشر)10010-023
Aggrewell 400Plate Stem CellsTechnologies 27940
AggreWellMedium Stem CellsTechnologies 5893
AccutaseStem CellTechnologies 7920
BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilization KitBD Biosciences554714
دراسات نمو الأجسام المضادة للجسم المضاد ل PAX6 للفأر Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX AntibodyAbcamAb23340
Mouse   الأجسام المضادة المضادة ل MITFThermo ScientificMS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 الأجسام المضادةInvitrogen40-2200
RNeasy plus mini kitQiagen74134
PCR master mixPromegaM7502
الحمض النووي الريبي عالي السعة إلى مجموعة الحمض النووي الريبي (cDNAالحياة 4387406
) تقنيات

المراجع

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  6. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
  7. Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
  8. Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
  9. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  10. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427(2012).
  11. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  12. Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
  13. Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152(2009).
  15. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
  16. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  17. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
  18. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
  19. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  20. Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
  21. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  22. Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
  23. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية المستحثة وافرة القدرةتكوين الأجسام المضغيةتقنية أطباق الآبار الدقيقةالتمايز الموجهالكيمياء النسيجية المناعية الخلويةتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيفرز الخلايا المنشط بالفلورةتعبير مؤشرات الظهارة الصبغية للشبكيةتحضين المزارع الخلوية
المستمدة الشبكية الظهارة الصبغية (RPE) من المستحثة متعددة القدرات الجذعية (آي بي إس) الخلايا عن طريق أحجام مختلفة من الهيئات مضغي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.