طريقة بسيطة لDNA الإسفار في الموقع التهجين لسحق الكروموسومات

Amanda M. Larracuente; Patrick M. Ferree

doi:10.3791/52288

Method Article

طريقة بسيطة لDNA الإسفار في الموقع التهجين لسحق الكروموسومات

DOI:

10.3791/52288

⸱

January 6th, 2015

Amanda M. Larracuente¹ , Patrick M. Ferree²

¹Department of Biology, University of Rochester, ²W. M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer, and Scripps Colleges

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طريقة بسيطة لإجراء التهجين الموضعي للحمض النووي الفلوري (DNA ISH) لتصور التسلسلات غير المتجانسة المتكررة على الكروموسومات المثبتة على الشريحة. تتطلب الطريقة الحد الأدنى من الكواشف وهي متعددة الاستخدامات للاستخدام مع المجسات القصيرة أو الطويلة ، والأنسجة المختلفة ، والكشف عن الإشارات الفلورية أو غير الفلورية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA الموقع التهجين (DNA ISH) في هو طريقة تستخدم عادة لتسلسل رسم الخرائط للمناطق كروموسوم محددة. هذا النهج غير فعالة بشكل خاص في رسم الخرائط تسلسل المتكررة للغاية لمناطق heterochromatic، حيث تواجه المناهج الحسابية التحديات باهظة. نحن هنا وصف بروتوكول مبسط للDNA ISH أن تلتف يغسل الفورماميد التي هي الخطوات القياسية في غيرها من البروتوكولات ISH DNA. هو الأمثل لدينا بروتوكول لالتهجين مع واحدة تحقيقات DNA حبلا القصيرة التي تحمل الأصباغ الفلورية، والتي احتفال بفعالية تسلسل الحمض النووي المتكررة داخل المناطق الكروموسومات heterochromatic عبر عدد من مختلف أنواع الأنسجة الحشرات. ومع ذلك، يجوز تمديد التطبيقات لاستخدام مع تحقيقات أكبر والتصور من متواليات نسخة واحدة (غير متكرر) DNA. ونحن لشرح هذه الطريقة عن طريق تعيين عدة سلاسل متكررة مختلفة لسحق الكروموسومات من الخلايا العصبية الدروسوفيلاميلانوجاستر وNasoniavitripennis الخلايا المنوية. وتبين لنا أنماط التهجين على حد سواء، تحقيقات صغيرة توليفها تجاريا وتحقيق أكبر للمقارنة. يستخدم هذا الإجراء وازم المختبرات بسيطة والكواشف، ويعتبر مثاليا للمحققين الذين لديهم خبرة قليلة مع أداء DNA ISH.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA الموقع التهجين (DNA ISH) في هو طريقة تستخدم عادة لتسلسل رسم الخرائط للمناطق كروموسوم محددة. يمكن أن تتولد تحقيقات لمناطق نسخة واحدة داخل كروماتين حقيقي من خلال حفنة من النهج، بما نيك الترجمة أو نهاية توسيم منتجات DNA طويلة ^1،2 وإدراج deoxygenin (DIG) النيوكليوتيدات -attached والاعتراف بها من خلال مجموعة متنوعة واسعة من الأجسام المضادة مترافق مجموعة ^1-3. تصور تسلسل الكروماتين الحقيقي في قلة أو واحد في عدد النسخ يتطلب استخدام إما واحدة، تحقيقات واسعة للنشاط معين عالية أو مزيج من عدة تحقيقات أصغر التي تعزز إشارة جماعي.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الأنسجة تشريح والتثبيت (60 دقيقة)

لالعقول ذبابة الفاكهة، ضع 3 ^{الثالثة} طور مرحلي اليرقات في قطرة من برنامج تلفزيوني 1X (الفوسفات مخزنة المالحة). اختر كبيرة 3 ^{الثالثة} طور مرحلي اليرقات التي يتم الزحف بنشاط من قوارير أو زجاجات ليست مكتظة.
1. استخدام متناهية الصغر زوج واحد منتاش لانتزاع عقد من السنانير الفم وزوج منتاش آخر لانتزاع 2/3 أسفل طول الجسم (الشكل 1A، B). سحب بلطف على السنانير الفم لفضح الدماغ، العقد بطني، ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لشرح هذا الأسلوب، نحن تهجين مجموعة من oligos صغيرة توليفها تجاريا التي تم تعديلها كيميائيا مع تقارن الفلورسنت (الشكل 2) والتحقيق يعد المعقدة البيروكسيديز (التي تتم من خلال الترجمة نيك لمنتج PCR، الشكل 2B)، إلى الكروموسومات من عدة أنسجة مختلفة أنواع (انظر الجدول 1). وتضمنت تسلسل الهدف يكرر الأقمار الصناعية تقع في pericentromeric (heterochromatic) مناطق من الكروموسومات الإنقسامية من D. البطن neuroblasts اليرقات (الش.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كثيرا ما يستخدم الحمض النووي ISH لرسم خريطة تسلسل محددة لالكروموسومات. وصفناها طريقة بسيطة لDNA ISH الأمثل لعدد نسخ عالية، متواليات heterochromatic. بدلا من استخدام يغسل في حل الفورماميد، الذي هو شرط في غيرها من البروتوكولات ISH DNA الموجودة، ونحن نضع شرائح محمولة على الأنسجة مباشرة على كتلة تسخينه مسبقا لتفسد DNA. هذه الطريقة تلتف استخدام كميات كبيرة من الفورماميد. واحد خطوة حاسمة لإنتاج إشارات التهجين هش هو استخدام تقدم طازجة حل التثبيت. عدم القيام بذلك (أو جعل الحل الجديد مع ام.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب مالي أو أي تضارب آخر في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Zhaohua Irene Tang في قسم العلوم في W.M. Keck لاستخدام مجهر التألق اللامع ومختبر Werren للتبرع ب Nasonia للتشريح. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال زمالة المعاهد الوطنية للصحة - NRSA (5F32GM105317-02) إلى مكافحة غسل الشعر.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
شرائح مطلية ب Poly-L-lysine (يمكن أيضا استخدام الشرائح العادية)	Sigma Aldrich
متناهية الصغر (قياس 5)	Dumont
مقاس 22 × 22 مم	معالج فيشر		سيجماكوت بالغمر لمدة 15 ثانية ، وتجفيف النشاف ، ومسح جميع آثار Sigmacote بحيث يكون انزلاق الغطاء واضحا
Sigmacote	Sigma
			ورق
			شمع البارافين
كتلة حرارية مع مقياس
حاضنة
شفرات
غرفة			صندوق طرف ماصة فارغة أو Tupperware ، مبطنة بمناشف ورقية مبللة أو
برطمانات			مع أخاديد الشريحة
رقائق الألومنيوم
ماصات
1.5 مل أنابيب
الدقيق طلاء الأظافر			واضح أو ملون
P20 ماصة دقيقة ونصائح
بلاستيكية مشابك			20-25 مشبك ورق معدني قياسي مرتبط بتشكيل أ سلسلة
16٪ EM الصف بارافورمالدهيد	الكواشف المجهرية الإلكترونية كواشف
حمض الخليك	سيجما
النيتروجين
100٪ الإيثانول ، الصف
طويل البيوتينيل	إنفيتروجين. الخطوات البديلة 2.7.1-2.7.3		على سبيل المثال,< / em> مترجم وبيوتينيل مع BioNick من Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; الخطوات البديلة 2.7.1-2.7.3		للكشف عن مسبار طويل بيوتينيل
وصفة مخزن التهجين	فوق
4x SSCT	وصفة فوق		سترات الصوديوم المالحة + Tween
0.1x SSC	وصفة فوق		المالحة والصوديوم
	وصفة فوق
SBT		أعلاه	SSC ، ألبومين مصل الأبقار ، Tween
1x PBT	وصفة فوق		محلول ملحي مخزن بالفوسفات + Tween
1x PBS			محلول ملحي
		محلول خفيف التوتر	0.5٪ سترات الصوديوم في H_{2< / sub>O}
فورماميد	Sigma Aldrich
Vectashield متوسط التركيب مع DAPI	Vector المختبرات

ملاقط زلات غطاء من ورق ترشيح 75 - 150 مم حرارةجافةحلاقة الرطوبة Kimwipes Coplinباستورالطرد الورق < td colspan = "4" > الكواشفالسائل الكيميائي < td colspan = "4" > مركب تجاريا ، مسبار أوليغوس محلول الحجب السيترات وصفة مخزن بالفوسفات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
Dimitri, P.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

طريقة بسيطة لDNA الإسفار في الموقع التهجين لسحق الكروموسومات

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles