يصف هذا البروتوكول تقنيات عزل الخلايا الحية والثقافة الأولية لخطوط الخلايا العضلية والخلايا الليفية من أنسجة العضلات أو الجلد. كما تم وصف تقنية تخليد خطوط الخلايا هذه. إجمالا ، توفر هذه البروتوكولات أداة موثوقة لتوليد الخلايا المشتقة من المريض والحفاظ عليها للتطبيقات النهائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة وتخليد خطوط الخلايا المشتقة من المريض من خزعة العضلات لمرض النمذجة
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
يمثل توليد خطوط الخلايا الخاصة بالمريض أداة لا تقدر بثمن للبحث التشخيصي أو الانتقالي ، ويمكن جمع هذه الخلايا من أنسجة خزعة الجلد أو العضلات المتاحة أثناء العمل التشخيصي للمريض. في هذا البروتوكول ، نصف تقنية لعزل الخلايا الحية عن كميات صغيرة من العضلات أو أنسجة الجلد لزراعة الخلايا الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم تقنية لتخليد خطوط الخلايا العضلية وخطوط الخلايا الليفية من الخلايا الأولية. بمجرد تخليد خطوط الخلايا ، يمكن تحقيق توسع كبير في الخلايا المشتقة من المريض. الخلايا الخالدة قابلة للعديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك فحص الأدوية والتصحيح في المختبر للطفرة الجينية. إجمالا ، توفر هذه البروتوكولات أداة موثوقة لتوليد الخلايا المشتقة من المريض والحفاظ عليها للتطبيقات النهائية.
المقدمة
تطورت التشخيص الجزيئي بشكل كبير في السنوات العشرين الماضية. يتم الآن عزل الحمض النووي الجيني بشكل روتيني عن البلغم أو مسحة الخد ، بينما كان يتطلب في الماضي سحب الدم. مع الوقت الحالي السريع وسهولة التسلسل الجيني ، يتم تحديد العديد من الطفرات المرضية بشكل روتيني دون الحاجة إلى اختبارات إضافية. في حالة تشخيص أمراض العضلات ، فإن تحديد العشرات من الجينات الجديدة في العقد الماضي المسؤولة عن الحثل العضلي أو الاعتلال العضلي قد غير بشكل كبير طرق تشخيص هذه الأمراض 1،2. حاليا ، هناك العشرات من الجينات التي تم تحديدها على أنها أسباب للحثل العضلي والاعتلال العضلي الخلقي ، على الرغم من أن الآليات التي تنتج بها العديد من هذه الجينات المرض لا تزال غير واضحة. على وجه الخصوص ، تشكل الأمراض النادرة تحديا بسبب صغر حجم المرضى. بالنسبة لهذه الحالات ، وكذلك بالنسبة للأمراض الأكثر شيوعا ، من المستحسن للغاية إنشاء أدوات مستقرة تسهل إجراء دراسات حول آلية التسبب في المرض وفحص الأدوية العلاجية.
على الرغم من التقدم الكبير في تشخيص الحمض النووي ، لا تزال خزعات العضلات تجرى لتحديد التشخيص الأولي في العديد من المرضى الذين يشتبه في إصابتهم بأمراض التمثيل الغذائي أو العضلات. عندما تكون خزعة العضلات ضرورية ، فإنها توفر الفرصة لجمع أنسجة تشخيصية وبحثية إضافية مع الحد الأدنى من مخاطر المراضة الإضافية للمريض. نظرا لوجود عدد من الاستخدامات لكل عينة من الأنسجة ، فمن المستحسن للغاية إنشاء تقنيات لزراعة الخلايا الأولية باستخدام الأنسجة الجراحية المباشرة والفعالة وتتطلب كميات قليلة من الأنسجة. مطلوب الفرز المناسب لخزعات العضلات أو الجلد لتعظيم عزل الخلايا الأولية عن الأنسجة والتخزين طويل الأمد للمواد الحية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أبحاث الخلايا الجذعية وفحص الأدوية تبشر بنتائج كبيرة لتطوير علاجات للعديد من الأمراض باستخدام المقايسات القائمة على الخلايا 3،4.
نصف هنا طرق عزل الخلايا الأولية من خزعات العضلات أو الجلد البشري. بالإضافة إلى ذلك ، نقوم بتضمين بروتوكول لتخليد الخلايا العضلية ، وهو مفيد لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا من الفرد. يمكن استخدام هذه الخلايا للتطبيقات النهائية ، مثل فحوصات الأدوية المخصصة ، والتي لا يمكن تحقيقها مع العدد المنخفض الإجمالي للخلايا التي تم الحصول عليها من الأنسجة الأولية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يجب مراجعة بروتوكولات لجمع الأنسجة البشرية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية IRB: ملاحظة. وقد تمت الموافقة على مجموعة من التخلص منها، الأنسجة البشرية التي تم تحديدها من قبل دي مستشفى بوسطن للأطفال ومستشفى بريجهام للنساء في اللجان IRB. وقد طبقت الطرق الموضحة أدناه لعزل خلايا المنشأ العضلي من دي تحديدها، التخلص من الأنسجة. الأساليب المذكورة تنطبق على الأنسجة التي تم جمعها من المواد المرضى وافق.
1. عزل خلية
- تفكك خزعة العضلات وتنقية خلايا المنشأ العضلي
- قبل تزن لوحة زراعة الأنسجة 10 سم في السلامة الأحيائية هود زراعة الأنسجة، ومن ثم إعادة تزن-لوحة تحتوي على خزعة العضلات لحساب كمية الأنسجة ليتم فصلها.
- باستخدام المشارط معقمة، الأنسجة العضلية اللحم المفروم ناعما وإضافة بضع قطرات من معقم 1X HBSS لمنع الأنسجة من الجفاف.
- إضافة 3.5 مل كل من ديspase الثاني وكولاجيناز D في كل غرام من الأنسجة العضلية ليتم هضمها. ماصة الأنسجة المفروم وحل الانزيم من خلال العقيمة 25 مل ماصة عدة مرات. احتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 15 دقيقة وهضم الأنسجة حتى الطين يمر بسهولة على الرغم من معقمة 5 مل ماصة.
وعادة ما يتحقق الأنسجة التفكك عن طريق الهضم الأنزيمي داخل 45-90 دقيقة: ملاحظة. يرجى الرجوع إلى قسم "ممثل النتائج" للحصول على تفاصيل إضافية. - إضافة 2 مجلدات من متوسط النمو معقم للأنسجة فصلها، ومرشح من خلال مصفاة 100 ميكرون الخليوي أكثر من 50 مل الخلايا المخروطية أنبوب وبيليه لمدة 10 دقيقة في 329 x ج (~ 1،100 دورة في الدقيقة)، درجة حرارة الغرفة. يرجى الرجوع إلى الجدول المواد اللازمة لتكوين وسائل الإعلام.
- resuspend الكرية في 1 حجم معقم متوسطة النمو وإضافة 7 مجلدات الأحمر حل الخلية تحلل الدم. تصفية حل من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر، ثم بيليه رانه الخلايا لمدة 10 دقيقة في 329 x ج، درجة حرارة الغرفة.
- عدد الخلايا في عدادة الكريات و resuspend الخلايا في 1X HBSS 0.5٪ BSA بتركيز 1 × 10 6 خلية / 100 ميكرولتر. جانبا 250،000 الخلايا في أنبوب واحد التي سيتم استخدامها بوصفها سلبية (غير ملوثين) مراقبة ~. تعيين أحادية اللون أنابيب السيطرة الملون جانبا إضافية ليوديد propidium وCD56، وهي مطلوبة من أجل النابضة السليم للخلايا إيجابية CD56 بواسطة FACS الفرز. يرجى الرجوع إلى الخلية أدلة الفرز أو التشاور مع تدرج FACS فرز خبراء منشأة الأساسية لضمان الضوابط المناسبة.
- وصمة عار على الخلايا ليتم فرزها مع 5μl / 10 6 خلايا لمكافحة CD56 الأجسام المضادة. احتضان جميع العينات (بما في ذلك الضوابط) على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- عينات غسيل في 10 مل 1X HBSS وخلايا بيليه لمدة 10 دقيقة في 329 x ج (~ 1،100 دورة في الدقيقة) في أجهزة الطرد المركزي المبردة، 4 ° C درجة الحرارة.
- إضافة يوديد propidium بتركيز نهائي من 1μg / مل للعينة أن يكون سورتيد لاستبعاد الخلايا الميتة. تنقية خلايا إيجابية CD56 المنشأ العضلي من الخلايا غير المنشأ العضلي باستخدام مضان تنشيط خلية فارز.
- تفكك خزعة الجلد
ملاحظة: الجلد الخلايا الليفية يمكن عزلها من لكمة الجلد من المرضى عندما الخزعات العضلية غير متوفرة. الخلايا الليفية الجلدية ويمكن استخدام مادة بيولوجية للعديد من الدراسات، بما في ذلك التنبيغ مع MyoD على توليد خلايا المنشأ العضلي. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الليفية الجلدية يمكن استخدامها لتوليد خلايا الجذع، والتي يمكن أن تكون متباينة في مختلف أنواع الخلايا لمزيد من الدراسة.- نقل خزعة الجلد إلى المختبر في وسط النقل. وبمجرد استلام العينة، نفذ ثقافة الأولية في أقرب وقت ممكن. إذا لا يمكن تأسيس ثقافة الأولية في نفس اليوم، وتخزين العينة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- نقل خزعة الجلد لالعقيمة 35 ملم طبق بتري في غطاء تدفق الصفحي.
- شطف خزعة الجلد في طبق بتري مع معقم 1س PBS لإزالة الدم والحطام. إزالة الأنسجة الدهنية مع مشرط معقم.
- إضافة 2 مل من محلول كولاجيناز واللحم المفروم مع النسيج مشرط، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة، اعتمادا على حجم الأنسجة.
- نقل الأنسجة هضمها إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وشطف طبق بتري مع 2 مل من ثقافة الخلايا الليفية المتوسطة مرتين، وجمع المتوسطة في نفس الأنبوب.
- بيليه الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 3 مل من الخلايا الليفية المتوسطة لإزالة كولاجيناز، ثم خلايا بيليه مرة أخرى. يرجى الرجوع إلى الجدول المواد اللازمة لتكوين وسائل الإعلام.
- كرر الخطوة 1.2.7 مرة أخرى.
- اعادة تعليق بيليه في الخلايا الليفية المتوسطة وصفيحة 5 مل في الصعود إلى T25 نسيج الثقافة العقيمة القارورة. احتضان القارورة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- تقييم ثقافة لمرفق الخلايا الليفية والنمو خلال الايام المقبلة 1-3. <ر /> ملاحظة: بعض قطع الأنسجة الصغيرة قد تعلق أيضا على لوحة والخلايا الليفية تهاجر من هذه القطع الأنسجة.
- الحفاظ على الثقافة في ظل نفس الظروف حتى تزرع الخلايا الليفية إلى ما يقرب من 80٪ التقاء.
- جمع الخلايا الليفية من قبل trypsinization ونقل على قوارير ثقافة جديدة للتوسع إضافي. أداء trypsinization بغسل الثقافات 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم ++ ++. إضافة التربسين-EDTA (الجدول انظر المواد) إلى الخلايا (2ML / T25 القارورة) لمدة 2 دقيقة عند 37 ° C.
- انقسام خلايا منفصلة في قوارير إضافية. وإذا كان بعض قطع الأنسجة لا تزال تعلق على قوارير T25 الأصلية، إضافة 5 مل ثقافة جديدة متوسطة إلى هذه القارورة وسوف المزيد من الخلايا الليفية تهاجر خارج باستمرار.
ملاحظة: ثقافة الخلايا الليفية موسعة يمكن تجميد منصبه كرئيس P1 وتخزينها في النيتروجين السائل للتجارب المستقبلية.
2. تخليد خلايا عضلي
- لوحة الخلايا 5 ملايين فينيكس Ecotropic التعبئة والتغليف (PE) بين عشية وضحاها في 10 سم معقمة لوحة زراعة الأنسجة في DMEM والمتوسطة 199 في نسبة 4: 1، على أن تستكمل مع 10٪ العجل المصل.
- خلايا تغذية 30 دقيقة قبل ترنسفكأيشن مع 5 مل من وسائل الإعلام الجديدة تستكمل مع 10 ملي الكافيين.
- التجانس خليط من 2 ميكروغرام من DNA البلازميد من الإعدادية ميدي (CDK4 أو hTERT بلازميد) وpolyjet ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
- يضاف خليط بلازميد / polyjet إلى خلايا PE بين عشية وضحاها.
- خلايا تغذية مع المتوسطة الطازجة (DMEM والمتوسطة 199 في نسبة 4: 1، على أن تستكمل مع 10٪ مصل العجل). في وقت لاحق اثنتي عشرة ساعة، وجمع طاف التي تحتوي على الفيروس وتصفية من خلال حجم مرشح 0.45 ميكرون المسام.
- استخدام 1 مل من طاف جمعها على إصابة بين عشية وضحاها خط PA317 خلية التعبئة والتغليف amphotropic 5 و الحصول على خط الخلية المنتجة للفيروس مستقر بعد اختيار إما 0.5 ملغ / مل النيوميسين (G418) لCDK4 أو 0.5 ملغ / مل هيغروميسين لhTERT.
- إعداد العمل supernatants الفيروسية من خلال زراعة الخلايا التعبئة والتغليف مستقرة لالقريب confluency، ثم حصاد طاف كل صباح، مساء وصباح لمدة ثلاثة مواسم الحصاد.
- تصفية supernatants الفيروسية وإما استخدام مباشرة أو تقسيمها إلى 1 مل مأخوذة وتخزينها في -80 ° C لاستخدامها لاحقا. لاحظ أن طاف الفيروسي يفقد 50٪ كفاءة العدوى مع بعضها تجميد ذوبان الجليد. تذكر لتبييض غسل قبل رميه كل ما لمست الجسيمات الفيروسية.
ملاحظة: مستقر PA317 الفيروسات خط انتاج الخلايا يمكن تجميد والحفاظ على -150 درجة مئوية لمدة التخزين الدائم (تجميد المتوسطة هو 10٪ DMSO و 90٪ مصل). - لوحة-FACS تنقية خلايا المنشأ العضلي (موضح في الخطوات 1،1-1،9) في مناطق ذات كثافة من 5 × 10 4 خلايا / جيد في 6 لوحات جيدة المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين. ضمان المرفقة الخلايا إلى لوحة قبل المضي قدما في عدوى فيروسية.
- إضافة 400 ميكرولتر تصفيتها، وأنتجت reshly طاف الفيروسية أو مأخوذة المجمدة إلى كل لوحة ستة جيدا بين عشية وضحاها (الحفاظ على 2 الآبار والضوابط).
- تغيير المتوسطة عن طريق تغذية الخلايا مع 2.5 مل / جيد من وسائل الاعلام الطازج العضلات (4: 1 Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) والمتوسطة 199 تستكمل مع 15٪ مصل بقري جنيني، 0.02 M HEPES العازلة؛ 1.4 ملغم / لتر فيتامين B12، 0.03 ملغ / L ZnSO4، 0.055 ملغ / L ديكساميثازون 2.5 ميكروغرام / لتر عامل نمو الخلايا الكبدية و 10 ميكروغرام / لتر عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية). تجاهل وسائل الإعلام والماصات التي تحتوي على جسيمات فيروسية في وعاء التبييض. ترك الخلايا في نفس متوسطة لمدة 3 أيام للتعافي من الإصابة، ثم علاج لاختيار إما باستخدام 400 ميكروغرام / مل النيوميسين (عدوى CDK4) أو 300 ميكروغرام / مل هيغروميسين (عدوى hTERT).
- الحفاظ على الخلايا تحت اختيار المخدرات حتى الخلايا في الطبق يموت التحكم (1-2 أسابيع).
- خلايا مرور قبل أن تصبح متكدسة (60-80٪ confluency، واستخدام 0.05٪ التربسين EDTA)، حتى خلال selectiعلى الفترة. خلايا Replate في 10CM متعددة الأطباق مع المتوسطة بالخلايا العضلية الجذعية الطازجة (كما هو موضح في 2.11) تستكمل مع الدواء الاختيار. الحفاظ على الخلايا المحددة خلد باعتباره السكان غير متجانسة أو استنساخ للحصول على الخلفية الوراثية متجانسة تماما (نفس الإدراج من التحوير في كل خلية).
- أداء اختيار نسيلي باستخدام الخطوات التالية:
- البذور الخلايا في كثافة منخفضة (مثل 300 و 500 الخلايا في 10 سم أطباق) والمحافظة عليها لمدة أسبوعين تقريبا، حتى يتم تشكيل مستعمرات صغيرة (10-20 الخلايا).
- إزالة معظم المتوسطة في هذه المرحلة، ولم يتبق سوى طبقة رقيقة لمنع الخلايا من الجفاف.
- ضع حلقة الاستنساخ (مع نهاية واحدة مغموسة في سيليكون الشحوم فراغ) على كل استنساخ المطلوب وإضافة بضع قطرات من التربسين / EDTA.
- حصاد الخلايا بمجرد أن تصبح تقريب بواسطة الشفط بعناية الخلايا باستخدام طرف 1 مل أو الماصة باستور وتحويلها إلى أصغر جيش التحرير الشعبى الصينى multiwell متاحالشركة المصرية للاتصالات (96 أو 48، 24 أو 12 لوحات جيدا).
- توسيع استنساخ حسب الحاجة لمنع confluency المحلي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويوضح الشكل (1) بعض الخطوات الرئيسية المشاركة في التفكك النسيج الأساسي: يتم وزن المبلغ المحدد من الأنسجة في طبق بتري معقمة زراعة الأنسجة (الشكل 1A، B). ثم يتم مفروم ناعما النسيج باستخدام المشارط معقمة، حتى يتم الحصول على الطين الأنسجة (الشكل 1C، D). وبعد إضافة إنزيمات الهضم، وعادة ما تحقق العضلات الأولية الأنسجة التفكك عن طريق الهضم الأنزيمي داخل 45-90 دقيقة. تطور الهضم الأنسجة عادة ما يتم رصد كل 15-20 دقيقة لمنع overdigestion ومو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخلايا كما مصدرا مفيدا
العزلة وثقافة السكان الخلية عضلي مفيد للغاية عند إنشاء الظواهر المرض أو في نماذج المختبر من المرض. الإجراء العزلة خلية عضلي الموصوفة هنا يسمح للعزل myoblasts والخلايا الليفية من العينات العضلات والهيكل العظمي، والتي يمكن بعد ذلك نشر، متباينة، أو مباشرة تحليلها. يمكن تقييم هيكل بالخلايا العضلية الجذعية وظيفة من خلال الفحص المجهري، وتقييم بقاء الخلية، وتقييم الانصهار خلية، ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يتم تمويل هذا المنشور من خلال Cure CMD ، وهي منحة جمعية Contre Les Myopathies (AFM) (المشروع 16297) ، ومن قبل المعاهد الوطنية للصحة (أرقام المنح K08 AR059750 و L40 AR057721 و 2R01NS047727).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| معدات | |||
| الأنسجة غطاء محرك السيارة للسلامة البيولوجية | للثقافة شركة بيكر ، إنك. | نموذج SterilGuard هود | |
| المنضدة الطرد المركزي ، مثل Beckman Model ؛ | بيكمان كولتر | موديل Allegra 6R | إذا تم إجراء فرز الخلايا ، يفضل استخدام جهاز طرد مركزي مع التبريد |
| مجهر | نيكون | موديل Eclipse TS100 | |
| حاضنة ثقافة الأنسجة ، متصلة بمصدر CO2< / sub> | Forma Scientific | السلسلة الثانية | |
| فارز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) | Becton Dickinson | Model Aria | |
| لعزل الخلايا العضلية الأولية من الأنسجة | |||
| Dispase II | Roche Applied Science | # 04942078001 | تحضير محلول جورب بمقدار 2.4U / مل في DMEM |
| Collagenase D & nbsp ؛ | Roche Applied Science | # 088882001 | تحضير محلول مخزون 10 مجم / مل |
| 1x Sterile Hank s محلول ملحي متوازن (HBSS) خال من الكالسيوم والمغنيسيوم | GIBCO Life Technologies | # 14185-052 | |
| ألبومين مصل البقر ، الكسر V | Sigma | # 05470 | تحضير محلول معقم من 1X HBSS 0.5٪ BSA لفرز FACS |
| وسط نمو معقم للأرومات العضلية: Dulbecco s النسر المعدل s متوسط (DMEM) يحتوي على نسبة عالية من الجلوكوز (4.5 جم) مكمل بنسبة 30٪ مصل بقري للجنين | GIBCO Life Technologies | 11965-092 | L- الجلوتامين |
| RBC | Qiagen | 158904 | |
| مخزون بروبيديوم يوديد 10 مجم / مل | Sigma | P4170 | تحضير محلول المرق عن طريق تخفيف المسحوق في الماء المقطر المعقم |
| الجسم المضاد CD56 المضاد للإنسان لقياس التدفق | الخلوي Biolegend | 318310 | الجسم المضاد المترافق APC ، الملصقات الأخرى هي |
| كواشف قابلة للتوفر لتخليد الأرومات العضلية الأولية خط | |||
| خلية التعبئة والتغليف البيئي PE | Cell Biolabs | RV-101 | |
| خط خلية التعبئة والتغليف البرمائية PA3174 | Cell Biolabs | RV-102 | |
| جيلاتين جلد الخنزير | Sigma | G1890-500g | تحضير محلول مخزون من 0.1٪ جيلاتين في الماء. قم بتغطية الطبق بالمحلول عند 37 درجة ؛ ج لمدة ساعة واحدة. قم بإزالة المحلول وأضف متوسطا. |
| بولي جيت | Signagen | SL100688 | |
| G418 | Fisher | 345812 | |
| Hygromycin | EMD Biosciences | 400051 | |
| pBabe البلازميدات التي تحتوي على mCDK4 و hTERT | غير متوفرة | Stadler et al ، 2013 | |
| Qiagen البلازميد midiprep kit | Qiagen | 12143 | |
| Medium 199 | Life Technologies | متوسط 199 (31150022) | |
| Dulbecco' s معدل Eagle medium (DMEM) | Life Technologies | DMEM (11965-092) | مزيج 4: 1 DMEM: 199 |
| وسط نمو Myoblast: 4: 1 Dulbecco s معدل النسر المتوسط (DMEM) ومتوسط 199 مكمل مع 15٪ مصل الأبقار الجنينية; 0.02 م عازلة HEPES ؛ 1.4 مجم / لتر فيتامين ب 12 ؛ 0.03 مجم / لتر ZnSO4 ، 0.055 مجم / لتر ديكساميثازون ، 2.5 مو ؛ جم / لتر عامل نمو خلايا الكبد و 10 مو ؛ جم / لتر عامل نمو الخلايا الليفية بيتا. | تكنولوجيا الحياة (DMEM, F199); أتلانتا البيولوجية (FBS) ؛ Invitrogen (Hepes) ؛ فيشر (كبريتات الزنك) ؛ سيجما (فيتامين B12 ، ديكساميثازون) ؛ Chemicon الدولية (HGF) ؛ Biopioneer (betaFGF) | # 15630-080 (Hepes) ؛ #Z68-500 (ZnSO) ؛ #V2876.#D4902 (Vit.B12 ، Dex) ؛ GF116 (HGF) ؛ HRP-0011 (bFGF). | تحضير الوسائط ومحلول المخزون فيتامين B12 (20 مجم / مل) ؛ كبريتات الزنك (60 وميكرو؛ جم / مل) ؛ Dex (55 & micro; ز /& مايكرو ؛ ل) بشكل منفصل لتسهيل الاستخدام. حل مخزون HGF (5 & micro; جم / مل) و FGF (20 وميكرو ؛ جم / مل) يجب إضافته طازجا كل أسبوع بتركيز العمل النهائي. |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 | |
| Myosin الأجسام المضادة ذات السلسلة الثقيلة للتلوين المناعي | الورم الهجين التنموي | MF20 | Clone MF20 |
| Desmin الأجسام المضادة للتلوين المناعي | Thermo Scientific | MS-376-S0 | Clone D33 |
| مصل الحصان | Invitrogen | 26050-088 | |
| الكواشف لعزل الخلايا الليفية الأولية للجلد | |||
| وسيط النقل: RPMI 1640 مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ و 0.2٪ بنسلين / ستربتومايسين | RPMI متوسط 1640: GIBCO Life Technologies | 11875-093 | |
| وسط زراعة الخلايا الليفية الأولية البشرية: RPMI 1640 مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين | مصل بقري للجنين: Thermo Scientific | SH30071.03 | |
| محلول الكولاجيناز: الكولاجيناز من النوع 2 (100 مجم) معلق في 12.5 مل من وسط زراعة الخلايا الليفية ومعقم بالترشيح | ورثينجتون | 4176 | |
| معقم 1X محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) خال من الكالسيوم والمغنيسيوم | Lonza | 17-516F | |
| مواد لعزل الأرومات | |||
| 50 مل و 15 مل أنابيب مخروطية معقمة | GeneMate / Bioexpress | C-3394-4 (50 مل) ؛ C3394-1 (15 مل)) مشارط | |
| معقمة | Aspen Surgical | 372610 | |
| مقياس الدم | Hausser Scientific | 1492 | |
| معقمة 5 و 10 و 25 مل ماصات | Bellco | Glass 1226-05010 (5 مل) ؛ 1200-10010 (10 مل) ؛ 1228-25050 (25 مل) | غسل الماصات القابلة لإعادة الاستخدام وتثبيتها بالقطن وتعقيمها قبل الاستخدام |
| أطباق بلاستيكية معقمة معالجة بزراعة الأنسجة (10 سم) | مصافي خلايا النايلون المعقمة BD Falcon | 353003 | |
| (100 & micro; م و 40 & ميكرو; حجم م) | BD Falcon | 352340 (40 وميكرو ؛ m); 352360 (100 وميكرو; م) | |
| مواد لخلود | |||
| العضلية معقمة 0.45 & مرشحات | m Millipore | SLHV013SL | |
| حلقات الاستنساخ Corning | # 3166-8 | ليتم تنظيفها وتعقيمها قبل وبعد الاستخدام | |
| مواد لخطوط الخلايا الليفية ؛ | |||
| أطباق بلاستيكية معقمة 35 مم معالجة بزراعة الأنسجة | Greiner bio-one | 628160 | |
| مشارط معقمة | DeRoyal | D4510A | |
| قوارير زراعة الأنسجة المعقمة T25 | Techno Plastic Product ، TPP | 90026 | تباع في الولايات المتحدة الأمريكية بواسطة MIDSCI |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 |
المراجع
- Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
- Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
- Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
- Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
- Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
- Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
- Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
- Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
- Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454(2011).
- Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34(2011).
- Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).
- Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
- Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
- Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.
A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette
الوسوم
