صلابة الميكانيكية في المكروية الورم تلعب دورا حاسما في سلوك القيادة الخبيث من خلال زيادة النشاط invadopodia وأكتوميوزين انقباض. باستخدام المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة)، invadopodia وقوة الجر فحوصات يمكن استخدامها لدراسة خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية في الاستجابة إلى matrix صلابة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الهلام بولي أكريلاميد لInvadopodia وقوة الجر فحوصات على خلايا سرطان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم أنسجة الورم جامدة تورط بقوة في تنظيم الهجرة الخلايا السرطانية والغزو. الهجرة الغازية من خلال الأنسجة عبر ربط وتيسره نتوءات الأكتين الغنية دعا invadopodia التي تحط proteolytically المصفوفة خارج الخلية (ECM). وقد تبين النشاط Invadopodia أن تعتمد على صلابة ECM وسرطان الخلايا مقلص القوات مما يوحي بأن إشارات صلابة يمكن تنظيم هذه الهياكل التحت خلوية من خلال أكتوميوزين انقباض. خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية يمكن ربط في المختبر باستخدام فحوصات invadopodia وقوة الجر بناء على المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة) من الجمود مختلفة. خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية يمكن ربط في المختبر باستخدام فحوصات invadopodia وقوة الجر بناء على المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة) من الجمود مختلفة. ورغم وجود بعض الاختلافات بين المقايسات، وهما بروتوكول المعروضة هنا يوفر وسيلة لخلق أجزاء من الكميات المخصصة عشرفي ويمكن أن تستخدم في كل من المقايسات ويسهل قابلة للتكيف مع الاحتياجات البيولوجية وتقنية محددة للمستخدم.
المقدمة
وقد تم التعرف على صلابة من ECM-المرتبطة ورم باعتبارها عاملا هاما في سلوك القيادة الخبيث من خلال زيادة أكتوميوزين انقباض 1-3. بينما في المقام الأول تجلى هذا التأثير مع خلايا سرطان الثدي، وقد وجد مصفوفة الصلابة لتغيير خصائص الغازية من الخلايا المشتقة من مجموعة متنوعة من السرطانات 4-8 مما يشير إلى أن صلابة الورم قد تلعب دورا في نوع آخر من أنواع السرطان. على اختراق الأنسجة عبر وصلات هنا خلال الهجرة الغازية، وسرطان الخلايا تستخدم نتوءات الأكتين الغنية لاصقة المعروفة باسم invadopodia أن توطين proteinases أن تتحلل الوزراء البريطانى وECM 9. وتعتبر Invadopodia السمة المميزة للخلايا الغازية وقد تورطت في غ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد coverslips الزجاج لجزء من الكميات المسندة
- نظيفة 12 ملم coverslips مع مناديل الوبر منخفضة.
- لهب مم coverslips 12 و 14 ملم ساترة في microwell من كل 35 ملم الزجاج طبق أسفل عن طريق تمرير لهم من خلال لهب الموقد بنسن باستخدام الملقط.
- علاج microwells مع 200 ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح والهواء الجاف وmicrowells لمدة 30 دقيقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في مقايسة invadopodia، وعادة ما حددت invadopodia التي كتبها colocalization من علامات مثل الأكتين وcortactin في الهياكل منقط داخل جسم الخلية (الشكل 1). كلا invadopodia مهينة بنشاط وغير مهينة يمكن الاعتماد، والتفريق عن طريق ما إذا كانت colocalized هذه الهياكل مع المناطق السوداء تفتقر إشارة الفلورسنت في فبرونيكتين FITC المسمى (الشكل 1). تحسب يدويا Invadopodia، ويتم تحديد تدهور ECM لكل خلية من العتبة هذه المناطق السوداء يدويا ضمن الخطوط العريضة للخلاي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ونحن نقدم وسيلة لافتعال أجزاء من الكميات المخصصة التي يمكن استخدامها كأساس لinvadopodia وقوة الجر المقايسات لربط السلوكيات الخلوية الغازية ومقلص. بينما جزء من الكميات المسندة منذ فترة طويلة تستخدم للنظر في الآثار صلابة على الخلايا وحساب القوات الجر 18،24،27، وهذا البروتوكول هو أول من وضع المقايسات متوازية على أساس جزء من الكميات المسندة بنفس الجمود لربط السلوكيات الخلوية الغازية ومقلص ردا على مصفوفة الخواص الميكانيكية. تفعيل صحيح لل coverslips من الأطباق أسفل الزجاج يضم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان من المعاهد الوطنية للصحة تحت بجائزة عدد K25CA143412 (باريخ). ونود أن نعترف بأن وقدمت دعما إضافيا من قبل إدارة طب الأذن والحنجرة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
شكر وتقدير
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3-أمينوبروبيل تريميثوكسي سيلان | سيجما ألدريتش | 281778 | |
| أكريلاميد (40٪) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| حمض الأكريليك NHS إستر | Sigma-Aldrich | A8060 | تحضير طازجة في غطاء الدخان 10 مجم / مل في DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | يمكن أيضا استخدام الرودامين |
| الأمونيوم بيرسولفات | Bio-Rad | 161-0700 | قم بإعداد محلول طازج بنسبة 10٪ في 1x PBS |
| Aqua Poly / Mount | Polysciences | 18606 | استخدم 6 قطرات لملء الآبار الصغيرة |
| BIS (2٪) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| ألبومين مصل الأبقار | RPI | A30075 | يجعل 3٪ لحجب المحلول في 1x PBS وتخزينه في 4 درجات ؛ C |
| Coverslips (12 مم) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| أنابيب غسيل الكلى | Sigma-Aldrich | D9777 | قبل التوازن في عازلة البورات لمدة 15-30 دقيقة |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | تستخدم لجعل invadopodia المتوسطة |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | تستخدم لصنع محلول حمض الأكريليك NHS ester |
| عامل نمو البشرة | الحياة التقنيات | PHG0311 | استخدامها لجعل invadopodia متوسط |
| الإيثانول | PHARMCO-AAPER | E200 | مخفف بالماء فائق النقاء إلى 70٪ |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | يستخدم لجعل invadopodia المتوسطة |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | تحمي من الجيلاتين الخفيف |
| Polysciences | 00639 | عادة ما تصنع 10 مل من محلول السكروز 1٪ / 1٪ الجيلاتين في PBS وتخزينها عند 4 درجات ؛ C (تسخين PBS لإذابة الجيلاتين بسهولة) أطباق | |
| القاع الزجاجي (أغطية 35 مم) أغطية | MatTek | P35G-0-14-C | غير مطلية |
| جلوتارالديهايد (25٪) | Polysciences | 01909 | مخففة ب 1x PBS إلى 0.5٪ |
| الماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 633 الأجسام المضادة | Life Technologies | A21050 | |
| الحياة في البلازما البشرية | 33016-015 | أضف 5 مل من الماء عالي النقاء لصنع 1 مجم / مل ؛ aliquot في الأحجام بناء على الاستخدام لتجنب دورات التجميد والذوبان المفرطة تستخدم | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | EMD Millipore | PX-1565-1 | لصنع 10x مخزون PBS |
| الفأر المضاد للكورتاكتين 4F11 EMD | Millipore | 05-180 | |
| Na2< / sub>HPO4< / sub> | EMD Millipore | SX-0720-1 | لصنع 10x PBS الأسهم |
| NaCl | RPI | S23020 | لصنع مخزون 10x PBS ومخزن بورات |
| هيدروكسيد الصوديوم (1 نيوتن) | Sigma-Aldrich | S2770 | بماء فائق النقاء إلى 0.1 |
| نيوتن Nu-Serum (مصل منخفض البروتين) | يستخدم BD Biosciences | 355500 | لصنع Invadopodia متوسط |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | عادة ما تصنع 10٪ من الأسهم في 1x PBS ، وتستعد في غطاء الدخان ، وتضيف بضعة مل من هيدروكسيد الصوديوم القوي لإذابة بارافورمالدهيد بسهولة ثم إعادتها إلى درجة الحموضة 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك القوي) |
| PBS (معقم) | Cellgro | 21-040-CV | لزراعة الخلايا |
| RPMI 1640 | استخدام Cellgro | 10-040-CV | لصنع invadopodia متوسط |
| بوروهيدريد الصوديوم | Sigma-Aldrich | 452882 | تحضير طازج في غطاء الدخان 1 مجم / مل في 1x PBS |
| استقلاب الصوديوم رباعي هيدرات | Sigma-Aldrich | S0251 | لصنع عازلة البورات |
| السكروز | RPI | S24060 | عادة ما يصنع 10 مل من محلول السكروز / 1٪ الجيلاتين في PBS ويخزن في 4 درجات ؛ C (تسخين PBS لإذابة الجيلاتين بسهولة) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | يصنع 10٪ مخزون في 1x PBS ويستخدم كما هو الحال لإزالة الخلايا في مقايسة قوة الجر أو تخفيفه باستخدام 1x PBS للتلوين |
المراجع
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
