يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الهلام بولي أكريلاميد لInvadopodia وقوة الجر فحوصات على خلايا سرطان

12.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52343

⸱

يناير 4, 2015

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

صلابة الميكانيكية في المكروية الورم تلعب دورا حاسما في سلوك القيادة الخبيث من خلال زيادة النشاط invadopodia وأكتوميوزين انقباض. باستخدام المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة)، invadopodia وقوة الجر فحوصات يمكن استخدامها لدراسة خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية في الاستجابة إلى matrix صلابة.

الملخص

تم أنسجة الورم جامدة تورط بقوة في تنظيم الهجرة الخلايا السرطانية والغزو. الهجرة الغازية من خلال الأنسجة عبر ربط وتيسره نتوءات الأكتين الغنية دعا invadopodia التي تحط proteolytically المصفوفة خارج الخلية (ECM). وقد تبين النشاط Invadopodia أن تعتمد على صلابة ECM وسرطان الخلايا مقلص القوات مما يوحي بأن إشارات صلابة يمكن تنظيم هذه الهياكل التحت خلوية من خلال أكتوميوزين انقباض. خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية يمكن ربط في المختبر باستخدام فحوصات invadopodia وقوة الجر بناء على المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة) من الجمود مختلفة. خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية يمكن ربط في المختبر باستخدام فحوصات invadopodia وقوة الجر بناء على المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة) من الجمود مختلفة. ورغم وجود بعض الاختلافات بين المقايسات، وهما بروتوكول المعروضة هنا يوفر وسيلة لخلق أجزاء من الكميات المخصصة عشرفي ويمكن أن تستخدم في كل من المقايسات ويسهل قابلة للتكيف مع الاحتياجات البيولوجية وتقنية محددة للمستخدم.

المقدمة

وقد تم التعرف على صلابة من ECM-المرتبطة ورم باعتبارها عاملا هاما في سلوك القيادة الخبيث من خلال زيادة أكتوميوزين انقباض 1-3. بينما في المقام الأول تجلى هذا التأثير مع خلايا سرطان الثدي، وقد وجد مصفوفة الصلابة لتغيير خصائص الغازية من الخلايا المشتقة من مجموعة متنوعة من السرطانات 4-8 مما يشير إلى أن صلابة الورم قد تلعب دورا في نوع آخر من أنواع السرطان. على اختراق الأنسجة عبر وصلات هنا خلال الهجرة الغازية، وسرطان الخلايا تستخدم نتوءات الأكتين الغنية لاصقة المعروفة باسم invadopodia أن توطين proteinases أن تتحلل الوزراء البريطانى وECM 9. وتعتبر Invadopodia السمة المميزة للخلايا الغازية وقد تورطت في غزو الخلايا السرطانية وورم خبيث 10،11. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن مصفوفة الصلابة يمكن تنظيم أرقام invadopodia وما يرتبط بها من تدهور ECM 4،12 من خلال ميوسين II النشاط والبروتينات mechanosensitive 12. نظرا إلىالعلاقة بين كثافة الورم والسرطان العدوانية 13،14، وتشير هذه النتائج إلى الآلية التي الخلايا السرطانية قد يستجيب لأنسجة الورم جامدة لقيادة الغزو والانبثاث من خلال أكتوميوزين انقباض.

في المختبر ECM صلابة وكثافة الأنسجة في الجسم الحي وقد ثبت أن تنظيم السلوك الغازية من الخلايا السرطانية 1،15-17. في حين أكتوميوزين انقباض يبدو أن المهم في هذه العملية، والصراع الدراسات الحالية حول ما إذا كان يرتبط قدرة النقيلي إلى زيادة أو نقصان القوات مقلص 6،18-20. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت هذه القوات التوسط مباشرة النشاط invadopodia 21. لقد وجدنا مؤخرا أن القوات مقلص الخلايا السرطانية كانت تعتمد على مصفوفة الصلابة وكانت التنبؤية لتدهور ECM التي كتبها invadopodia 5. وتشير هذه النتائج إلى أن قوات الخلوية قد تلعب دورا هاما في تطور السرطان عن طريق التوسط invadopodia ميلانالناقلية ردا على الخواص الميكانيكية للالمكروية الورم.

من أجل ربط خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية 5، ونحن تعديل بروتوكول لإنشاء جزء من الكميات المسندة مع الجمود المختلفة التي كانت تستخدم سابقا للتحقيق التي تعتمد على الصلابة النشاط invadopodia 4،12،22. قبل يشابك كيميائيا فبرونيكتين بلازما الإنسان في جميع أنحاء جزء من الكميات المسندة، وهذه الهلاميات المائية المعدلة ويمكن استخدام كأساس لكلا invadopodia والمقايسات قوة الجر لضمان أن الخلايا شهدت نفس الجمود في كلا التجربتين 5. في المقايسات invadopodia، توفر فبرونيكتين مجال ملزم الطبيعي لالجيلاتين لربط ECM مضافين إلى أجزاء من الكميات المخصصة للكشف عن تدهور المصفوفة. في المقايسات قوة الجر، توفر فبرونيكتين ليجند للالتصاق الخلوي المباشر للكشف عن نزوح المكروية المستخدمة لحساب قوات الجر الخلوية. هذه النتائج الأسلوب في ما طالبنا لينة، من الصعب،وجزء من الكميات المسندة الجامدة التي لا بد أن أطباق أسفل الزجاج ولها معاملات الرجوعية المرنة، E، من 1،023، 7،307، و22692 با 5 التي تغطي مجموعة من الخواص الميكانيكية وذكرت لالأنسجة الطبيعية والسرطانية 23.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد coverslips الزجاج لجزء من الكميات المسندة

  1. نظيفة 12 ملم coverslips مع مناديل الوبر منخفضة.
  2. لهب مم coverslips 12 و 14 ملم ساترة في microwell من كل 35 ملم الزجاج طبق أسفل عن طريق تمرير لهم من خلال لهب الموقد بنسن باستخدام الملقط.
  3. علاج microwells مع 200 ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. نضح والهواء الجاف وmicrowells لمدة 30 دقيقة.
  5. علاج microwells مع 50-100 ميكرولتر من 3 aminopropyltrimethoxysilane لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان. يتفاعل هذه المادة الكيميائية مع البلاستيك. وبالتالي، استخدام الماصات الزجاجية و لا ملء microwells تماما لتجنب الاتصال مع البلاستيك الطبق.
  6. غسل microwells مع الماء عالى النقاء لحوالي 10 دقيقة حتى يصبح aminopropyltrimethoxysilane-3 واضح.
  7. شطف microwells مع الماء عالى النقاء مرتين باستخدام زجاجة الضغط.
  8. غسل microwells مع 2 مل من الماء عالى النقاءدرجة حرارة الغرفة ر على الكرسي الهزاز وضعت في سرعة متوسطة (~ 1 هرتز) لمدة 10 دقيقة.
  9. نضح والهواء الجاف وmicrowells لمدة 30 دقيقة.
  10. علاج microwells مع 2 مل من 0.5٪ محلول غلوتارالدهيد في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز وضعت في سرعة متوسطة (~ 1 هرتز) لمدة 30 دقيقة.
  11. غسل microwells مع 2 مل من الماء عالى النقاء في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز وضعت في سرعة متوسطة (~ 1 هرتز) لمدة 10 دقيقة. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 30 دقيقة.
  12. microwells الجافة في زاوية حادة (60º أو أكثر) لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن تخزين أطباق لمدة 2 أشهر في dessicator ل.

2. إعداد جزء من الكميات المسندة لInvadopodia فحوصات

  1. ل1 مل حل PAA لينة (8٪ الأكريلاميد و 0.05٪ BIS)، والجمع بين 200 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 25 ميكرولتر من 2٪ BIS، و574 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 1).
  2. ل1 مل حل PAA الصلب (8٪ الأكريلاميد و 0.35٪ BIS)، والجمع بين 200 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 175 & #181؛ ل من 2٪ BIS، و 409 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 1).
  3. ل1 مل حل PAA جامدة (12٪ الأكريلاميد و 0.60٪ BIS)، والجمع بين 300 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 300 ميكرولتر من 2٪ BIS، و 169 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 1).
  4. ديغا الحلول لمدة 15 دقيقة. إضافة 200، 215، و 230 ميكرولتر من 1 ملغ / مل فبرونيكتين بلازما الإنسان في الماء عالى النقاء لينة، من الصعب، وجامدة حلول PAA، على التوالي. لجميع الحلول، إضافة 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حمض الاكريليك N-hydroxysuccinimide (NHS) استر، 5 ميكرولتر من / فوق كبريتات الأمونيوم مل 100 ملغ، و 2 ميكرولتر من N، N، N '، N' tetramethylethylenediamine (TEMED ، الجدول 1). خلط مع pipetting لطيف وتجنب خلق فقاعات في الحلول.

PAA
(1 مل) 		40٪
AA
(ميكرولتر) 		2٪
BIS
(ميكرولتر) 		عالى النقاء
ماء
(ميكرولتر) 		1 ملغ / مل
FN
(ميكرولتر) 		10 ملغ / مل
NHS استر
(ميكرولتر) 		100 ملغ / مل
APS
(ميكرولتر)
TEMED
(ميكرولتر) 		مطاط
معامل
(باسكال)
ناعم 200 25 574 200 1 5 2 1023
شاق 200 175 409 215 1 5 2 7307
جامد 300 300 169 230 1 5 2 22692

الجدول 1: العنصر voluوزارة التربية والعلم الناتجة معاملات الرجوعية المرنة لجزء من الكميات المسندة ينة، من الصعب، وجامدة المستخدمة في المقايسات invadopodia. AA = مادة الأكريلاميد، FN = فبرونيكتين، APS = فوق كبريتات الأمونيوم.

  1. ماصة 8.48 ميكرولتر من محلول PAA إلى مركز كل microwell.
    ملاحظة: هذا حجم ينتج نظريا PAA من 75 ميكرون في سمك.
  2. خفض بلطف الجانب ملتهب من 12 ملم ساترة إلى الحبرية في microwell باستخدام الملقط.
  3. السماح للحل PAA تقع إلى تتبلمر عن 15-30 دقيقة. تحقق البلمرة عن طريق التحقق من حل بقايا.
  4. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل طبق وإزالة 12 ملم coverslips مع ملاقط.
    ملاحظة: يتم 10X PBS في المختبر، وتتألف من 0.011 M KH 2 PO 4، 1.54 M كلوريد الصوديوم، و0.056 M نا 2 هبو 4.
  5. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.

3. Pجبر جزء من الكميات المسندة لقوة الجر فحوصات

  1. ل1 مل حل PAA لينة (8٪ الأكريلاميد و 0.05٪ BIS)، والجمع بين 200 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 25 ميكرولتر من 2٪ BIS، و 566 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 2).
  2. ل1 مل حل PAA الصلب (8٪ الأكريلاميد و 0.35٪ BIS)، والجمع بين 200 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 175 ميكرولتر من 2٪ BIS، و 401 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 2).
  3. ل1 مل حل PAA جامدة (12٪ الأكريلاميد و 0.60٪ BIS)، والجمع بين 300 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 300 ميكرولتر من 2٪ BIS، و 161 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 2).
  4. ديغا الحلول لمدة 15 دقيقة. إضافة 200، 215، و 230 ميكرولتر من 1 ملغ / مل فبرونيكتين البلازما البشرية لينة، من الصعب، وجامدة حلول PAA، على التوالي. يصوتن 8 ميكرولتر من 200 نانومتر المجهرية الفلورسنت الحمراء (الإثارة / انبعاث 580/605 نانومتر) لمدة 30 ثانية. لكل حل، إضافة 8 ميكرولتر من 200 نانومتر المجهرية الفلورسنت الحمراء،1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حمض الاكريليك NHS استر، 5 ميكرولتر من / فوق كبريتات الأمونيوم مل 100 ملغ، و 2 ميكرولتر من TEMED (الجدول 2). خلط مع pipetting لطيف وتجنب خلق فقاعات في الحلول.

PAA
(1 مل) 		40٪
AA
(ميكرولتر) 		2٪
BIS
(ميكرولتر) 		عالى النقاء
ماء
(ميكرولتر) 		1 ملغ / مل
FN
(ميكرولتر)
الصغير المجالات
(ميكرولتر) 		10 ملغ / مل
NHS استر
(ميكرولتر) 		100 ملغ / مل
APS
(ميكرولتر)
TEMED
(ميكرولتر) 		مطاط
معامل
(باسكال)
ناعم 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
شاق 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
جامد 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

الجدول 2: حجم العنصر وما ينتج عنها من معاملات الرجوعية المرنة لجزء من الكميات المسندة ينة، من الصعب، وجامدة المستخدمة في المقايسات قوة الجر AA = مادة الأكريلاميد، FN = فبرونيكتين، APS = فوق كبريتات الأمونيوم.

  1. ماصة 8.48 ميكرولتر من محلول PAA إلى مركز كل microwell.
    ملاحظة: هذا حجم ينتج نظريا PAA من 75 ميكرون في سمك.
  2. خفض بلطف الجانب ملتهب من اله 12 مم ساترة إلى الحبرية في microwell باستخدام الملقط.
  3. السماح للحل PAA تقع إلى تتبلمر عن 15-30 دقيقة. تحقق البلمرة عن طريق فحص بقايا حل.
  4. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل طبق وإزالة 12 ملم coverslips مع ملاقط.
  5. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.

4. إعداد ECM لInvadopodia فحوصات

  1. تسخين محلول الجيلاتين (1٪ الجيلاتين و 1٪ سكروز) إلى 37 درجة مئوية.
  2. علاج جزء من الكميات المسندة مع 150 ميكرولتر من محلول الجيلاتين لمدة 1 دقيقة ثم بعناية نضح من الجزء السفلي من microwells عندما عقد أطباق أسفل الزجاج في زاوية 45 درجة.
  3. تجف طبقة رقيقة المتبقي من الجيلاتين على أجزاء من الكميات المخصصة في microwells في زاوية حادة (60 درجة أو أكثر) لتحسين التجفيف لمدة 60 دقيقة.
  4. علاج microwells مع 2 مل من المبرد 0.5٪ حل غلوتارالدهيد على طم لمدة 15 دقيقة تليها درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.
  6. علاج microwells مع 2 مل من محلول بوروهيدريد الصوديوم لمدة 1 دقيقة. الاستفادة بلطف الأطباق على مقاعد البدلاء لإزالة الفقاعات التي تتشكل على سطح من الجيلاتين.
  7. نضح ويغسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.
  8. تمييع الحل فبرونيكتين البلازما البشرية FITC المسمى إلى 50 ميكروغرام / مل مع برنامج تلفزيوني 1X والطرد المركزي في 175،000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إما شراء فبرونيكتين المسمى المتاحة تجاريا أو التسمية على النحو التالي:
    1. حل 5 ملغ من فبرونيكتين في 10 مل من العازلة بورات (170 ملي الصوديوم metaborate tetrahydrate و 40 مم كلوريد الصوديوم) ومكان في أنابيب غسيل الكلى.
    2. تسمية فبرونيكتين عن طريق وضع أنابيب في 200 مل من العازلة بورات تحتوي على 6 ملغ من FITC المنحل في درجة حرارة الغرفة على محرك مغناطيسيوضعت في أدنى الإعداد لمدة 1.5 ساعة في الظلام.
    3. Dialyze مع 500 مل من برنامج تلفزيوني 1X على محرك مغناطيسي وضعت في أدنى الإعداد لمدة 3 أيام في غرفة باردة مظلمة (4 ° C) مع اثنين من حجم التغيرات في اليوم.
    4. حساب FITC المسمى تركيز فبرونيكتين على أساس الكثافة البصرية من مأخوذة المخفف (1: 200) في 280 نانومتر و 493 نانومتر كما [OD 280 - (0.36 X OD 493)] / 1.4 أضعاف عامل التخفيف من 200 مرة 2 (والذي يمثل لالجلسرين تركيز فبرونيكتين في الخطوة التالية) مما أدى إلى وحدات ملغ / مل.
    5. Dialyze بين عشية وضحاها في حل الجلسرين 50٪ على محرك مغناطيسي وضعت في أدنى الإعداد بين عشية وضحاها في غرفة باردة مظلمة في 4 درجات مئوية).
  9. علاج microwells مع 150 ميكرولتر من محلول فبرونيكتين FITC المسمى في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة في الظلام.
  10. نضح بعناية الحل فبرونيكتين المسمى FITC من الجزء السفلي من microwells عندما عقد أطباق أسفل الزجاج فيزاوية 45 درجة ومن ثم ملء الأطباق أسفل الزجاج مع 70٪ محلول الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في الظلام الثقافة هود خلية للتعقيم. كما شغل الزجاج الأغطية الطبق السفلي أو محو نظيفة مع مناديل الوبر منخفضة غارقة في الايثانول 70٪.
  11. غسل الأطباق أسفل الزجاج عن طريق ملء لهم مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X ليصبح المجموع 15 دقيقة.

5. إعداد والتصوير من Invadopodia فحوصات

  1. إضافة 25،000 الخلايا السرطانية في 2 مل من invadopodia المتوسطة (1: 1 DMEM وRPMI 1640 مع 5٪ مصل منخفض البروتين، و 10٪ مصل بقري جنيني، و 20 نانوغرام / مل من الطازجة وأضاف عامل نمو البشرة) إلى أطباق أسفل الزجاج و احتضان بين عشية وضحاها.
  2. نضح وعلاج microwells مع 2 مل من محلول بارافورمالدهيد 3.7٪ في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة لإصلاح الخلايا.
  3. بعد اثنين يغسل سريعة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X، علاج microwells مع 2 مل من 0.1٪ تريتون X-100 حل في غرفة تيمبيrature في الظلام لمدة 5 دقائق إلى permeabilize الخلايا.
  4. بعد واحد غسل سريع مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X، علاج microwells مع 3٪ ألبومين المصل البقري عرقلة الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 60 دقيقة لمنع الخلايا.
  5. احتضان microwells مع 150 ميكرولتر من الماوس الأضداد المضادة للcortactin (1: 750) في عرقلة الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 60 دقيقة.
  6. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.
  7. احتضان microwells مع 150 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس 633 الأضداد (1: 500) و 546 phalloidin (1: 750) في عرقلة الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 60 دقيقة.
  8. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.
  9. إضافة ست قطرات من تصاعد المتوسطة لملء كل microwell، وتغطي مع 22 × 22 coverslips.
  10. cortactin الصورة والأكتين لتحديد invadopodia باستخدام الإثارة وانبعاث المرشحات من 632/647 نانومتر، و556/570 نانومتر، على التوالي، وذلك باستخدام عالية NA، 40X عدسة الغمر النفط على مجهر مقلوب واسعة المجال. وبالمثل، صورة فبرونيكتين لتحديد تدهور ECM باستخدام الإثارة وانبعاث مرشح من 492/518 نانومتر.

6. إعداد والتصوير من قوة الجر فحوصات

  1. إضافة 15،000 الخلايا السرطانية في 2 مل من invadopodia المتوسط ​​إلى الأطباق أسفل الزجاج واحتضان بين عشية وضحاها.
  2. نضح المتوسطة في أطباق الزجاج السفلي واستبدالها مع 2 مل من L-15 متوسطة، مع نفس المكملات (5٪ منخفض البروتين مصل، و 10٪ مصل بقري جنيني، و 20 نانوغرام / مل من الطازجة وأضاف عامل نمو البشرة)، قبل -warmed إلى 37 درجة مئوية.
  3. احتضان الأطباق أسفل الزجاج في غرفة البيئية على مجهر مقلوب قبل معايرتها إلى 37 درجة مئوية مع رطوبة عالية لمدة 1 ساعة.
  4. خذ أربع مجموعات من الصور باستخدام NA عالية، 40X عدسة على المجهر واسعة المجال المقلوب مع مرحلة الآلي للاحتفال مواقف الخلوية:
    1. خلايا الصورة على لص من أجزاء من الكميات المخصصة باستخدام النقيض من المرحلة ("المرحلة" الصورة).
    2. الصورة المجهرية الفلورسنت باستخدام الإثارة وانبعاث المرشحات من 560/645 نانومتر من خلال التركيز قليلا تحت الخلايا حتى الطبقة الأولى من المجهرية في الجزء العلوي من جزء من الكميات المسندة تأتي في التركيز ("مشددا على" الصورة).
    3. وبالإضافة إلى ذلك، والتركيز على الجزء السفلي من جزء من الكميات المسندة (باستخدام المجهرية كعلامات) واتخاذ صورة ("أسفل" الصورة). ملاحظة: الغرض من هذه الصورة هو لتسجيل ض موقف للحصول على سمك PAA الفعلي في كل موقف لإجراء العمليات الحسابية قوة الجر كما هو موضح في ممثل النتائج.
    4. بعد تم الحصول عليها هذه الصور على مواقع متعددة، مزيج بلطف في 220 ميكرولتر من 10٪ تريتون-X الحل لإزالة الخلايا. المجهرية الصورة في الجزء العلوي من جزء من الكميات المسندة في كل موقف كما هو موضح سابقا ("لاغية" الصورة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في مقايسة invadopodia، وعادة ما حددت invadopodia التي كتبها colocalization من علامات مثل الأكتين وcortactin في الهياكل منقط داخل جسم الخلية (الشكل 1). كلا invadopodia مهينة بنشاط وغير مهينة يمكن الاعتماد، والتفريق عن طريق ما إذا كانت colocalized هذه الهياكل مع المناطق السوداء تفتقر إشارة الفلورسنت في فبرونيكتين FITC المسمى (الشكل 1). تحسب يدويا Invadopodia، ويتم تحديد تدهور ECM لكل خلية من العتبة هذه المناطق السوداء يدويا ضمن الخطوط العريضة للخلاي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ونحن نقدم وسيلة لافتعال أجزاء من الكميات المخصصة التي يمكن استخدامها كأساس لinvadopodia وقوة الجر المقايسات لربط السلوكيات الخلوية الغازية ومقلص. بينما جزء من الكميات المسندة منذ فترة طويلة تستخدم للنظر في الآثار صلابة على الخلايا وحساب القوات الجر 18،24،27، وهذا البروتوكول هو أول من وضع المقايسات متوازية على أساس جزء من الكميات المسندة بنفس الجمود لربط السلوكيات الخلوية الغازية ومقلص ردا على مصفوفة الخواص الميكانيكية. تفعيل صحيح لل coverslips من الأطباق أسفل الزجاج يضم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان من المعاهد الوطنية للصحة تحت بجائزة عدد K25CA143412 (باريخ). ونود أن نعترف بأن وقدمت دعما إضافيا من قبل إدارة طب الأذن والحنجرة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

شكر وتقدير

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3-أمينوبروبيل تريميثوكسي سيلانسيجما ألدريتش281778
أكريلاميد (40٪)Bio-Rad161-0140
حمض الأكريليك NHS إسترSigma-AldrichA8060تحضير طازجة في غطاء الدخان 10 مجم / مل في DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidinLife TechnologiesA22283يمكن أيضا استخدام الرودامين
الأمونيوم بيرسولفاتBio-Rad161-0700قم بإعداد محلول طازج بنسبة 10٪ في 1x PBS
Aqua Poly / MountPolysciences18606استخدم 6 قطرات لملء الآبار الصغيرة
BIS (2٪)Bio-Rad161-0142
ألبومين مصل الأبقارRPIA30075يجعل 3٪ لحجب المحلول في 1x PBS وتخزينه في 4 درجات ؛ C
Coverslips (12 مم)Fisher Scientific12-545-80
أنابيب غسيل الكلىSigma-AldrichD9777قبل التوازن في عازلة البورات لمدة 15-30 دقيقة
DMEMCellgro10-013-CVتستخدم لجعل invadopodia المتوسطة
DMSOSigma-AldrichD8418تستخدم لصنع محلول حمض الأكريليك NHS ester
عامل نمو البشرةالحياة التقنياتPHG0311استخدامها لجعل invadopodia متوسط
الإيثانولPHARMCO-AAPERE200مخفف بالماء فائق النقاء إلى 70٪
FBSThermo ScientificSH30070.03يستخدم لجعل invadopodia المتوسطة
FITCSigma-AldrichF7250تحمي من الجيلاتين الخفيف
Polysciences00639عادة ما تصنع 10 مل من محلول السكروز 1٪ / 1٪ الجيلاتين في PBS وتخزينها عند 4 درجات ؛ C (تسخين PBS لإذابة الجيلاتين بسهولة) أطباق
القاع الزجاجي (أغطية 35 مم) أغطيةMatTekP35G-0-14-Cغير مطلية
جلوتارالديهايد (25٪)Polysciences01909مخففة ب 1x PBS إلى 0.5٪
الماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 633 الأجسام المضادةLife TechnologiesA21050
الحياة في البلازما البشرية33016-015أضف 5 مل من الماء عالي النقاء لصنع 1 مجم / مل ؛ aliquot في الأحجام بناء على الاستخدام لتجنب دورات التجميد والذوبان المفرطة تستخدم
KH2< / sub>PO4< / sub>EMD MilliporePX-1565-1لصنع 10x مخزون PBS
الفأر المضاد للكورتاكتين 4F11 EMDMillipore05-180
Na2< / sub>HPO4< / sub>EMD MilliporeSX-0720-1لصنع 10x PBS الأسهم
NaClRPIS23020لصنع مخزون 10x PBS ومخزن بورات
هيدروكسيد الصوديوم (1 نيوتن)Sigma-AldrichS2770بماء فائق النقاء إلى 0.1
نيوتن Nu-Serum (مصل منخفض البروتين)يستخدم BD Biosciences355500لصنع Invadopodia متوسط
ParaformaldehydeAcros416785000عادة ما تصنع 10٪ من الأسهم في 1x PBS ، وتستعد في غطاء الدخان ، وتضيف بضعة مل من هيدروكسيد الصوديوم القوي لإذابة بارافورمالدهيد بسهولة ثم إعادتها إلى درجة الحموضة 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك القوي)
PBS (معقم)Cellgro21-040-CVلزراعة الخلايا
RPMI 1640استخدام Cellgro10-040-CVلصنع invadopodia متوسط
بوروهيدريد الصوديومSigma-Aldrich452882تحضير طازج في غطاء الدخان 1 مجم / مل في 1x PBS
استقلاب الصوديوم رباعي هيدراتSigma-AldrichS0251لصنع عازلة البورات
السكروزRPIS24060عادة ما يصنع 10 مل من محلول السكروز / 1٪ الجيلاتين في PBS ويخزن في 4 درجات ؛ C (تسخين PBS لإذابة الجيلاتين بسهولة)
TEMEDBio-Rad161-0800
Triton X-100Alfa AesarA16046يصنع 10٪ مخزون في 1x PBS ويستخدم كما هو الحال لإزالة الخلايا في مقايسة قوة الجر أو تخفيفه باستخدام 1x PBS للتلوين
تقنيات يستخدم يخفف استخدام يستخدم

المراجع

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572(2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015(2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

اختبارات الأقدام الغازيةهجرة الخلايا السرطانيةصلابة المصفوفة خارج الخلويةالمجهر الفلوريتنشيط الشرائح الزجاجية الغطائيةطلاء الفيبرونيكتينإزاحة الكريات المجهريةسمك الهيدروجيل
الهلام بولي أكريلاميد لInvadopodia وقوة الجر فحوصات على خلايا سرطان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.