تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في<em&gt; خميرة الخباز</em

ملخص

نقدم هنا طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد التفاعلات الكيميائية الجينية في الخميرة الناشئة. تم بناء النهج على التقنيات الأساسية في البيولوجيا الجزيئية للخميرة وهو مناسب تماما للاستجواب الميكانيكي للمجموعات الصغيرة والمتوسطة من المواد الكيميائية وبيئات الوسائط الأخرى.

الملخص

تحديد طريقة عمل المواد الكيميائية الحيوية النشطة هي التي تهم مجموعة واسعة من الأكاديمية، والمستحضرات الدوائية، والعلماء الصناعي. خميرة الخباز، أو في مهدها الخميرة، هو حقيقي النواة نموذج الذي مجموعة كاملة من ~ 6،000 المسوخ حذف الجينات وhypomorphic الجين ضروري تتوفر تجاريا المسوخ. هذه المجموعات من المسوخ يمكن استخدامها للكشف عن منهجية التفاعلات الكيميائية الجينات، أي الجينات اللازمة لتحمل مادة كيميائية. هذه المعلومات، بدوره، تقارير عن الوضع المحتمل لعمل المجمع. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في مهدها الخميرة. ونحن لشرح طريقة استخدام وكيل العلاج الكيميائي 5-فلورويوراسيل (5-FU)، والتي لديها آلية واضحة المعالم للعمل. نتائجنا تظهر أن TRAMP النووي RNA وهناك حاجة exosome وإصلاح الحمض النووي الانزيمات لانتشار في وجود 5-FU، وهو ما يتسق مع م السابقicroarray النهج الترميز شريط الكيميائية الوراثية على أساس ومعرفة أن 5-FU يؤثر سلبا على كل من RNA والحمض النووي الأيض. كما وصف بروتوكولات المصادقة المطلوب من هذه الشاشات عالية الإنتاجية.

المقدمة

وقد مكنت الأدوات والموارد المتاحة في الكائن الحي نموذج خميرة الخباز الوراثية واسعة النطاق علم الجينوم وظيفية الدراسات التي توفر مجتمعة نظرة جديدة في كيفية عمل الجينات كشبكات للوفاء بمتطلبات النظم البيولوجية. وكان حجر الزاوية في هذه الأدوات إنشاء تعاونية من مجموعة كاملة من الجينات الحذف غير الضرورية من جميع الأطر القراءة المفتوحة في الخميرة ^1،2. ومن الملاحظات اللافتة التي فقط ~ 20٪ من جينات الخميرة ويلزم للبقاء عندما نمت كما haploids تحت ظروف المختبر القياسية. هذا يسلط الضوء على قدرة خلية لالعازلة ضد الاضطرابات الجينومية من خلال الاستفادة من المسارات البيولوجية البديلة. المسوخ الوراثية التي هي قابلة للتطبيق ب....

البروتوكول

ويرد سير العمل العام لهذا الإجراء في الشكل 2: ملاحظة.

1. تحديد الجرعة النمو المثبطة

1. إعداد الخميرة الثقافة بين عشية وضحاها
   ملاحظة: وسائل الإعلام نمو الخميرة استخراج-ببتون-الدكستروز (YEPD) المستخدمة في هذا البروتوكول هو وصفة معيارية ^13.
   1. خط خارج BY4741 (ماتا HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) الخلايا على لوحة أجار YEPD واحتضان لمدة 48 ساعة على 30 ....

النتائج

كما التحقق من صحة هذا النهج أجرينا شاشة التفاعل تمثيلية الكيميائية الوراثية من وكيل العلاج الكيميائي 5-فلورويوراسيل (5-FU) بعد بروتوكول المبينة أعلاه. ومن المعروف 5-FU لتعطيل ثيميديلات سينسيز وكذلك DNA و RNA الأيض ^18. التفاعلات الكيميائية الوراثية من 5-FU هي مدروسة وتم التحقيق فيها من خلال تقنيات ميكروأري الخميرة الباركود باستخدام كل متخالف ومتماثل مجموعات الحذف ^8،19. نحن هنا تبين أن نتائج مماثلة يمكن الحصول على الكميات النسبية للمتحولة حجم مستعمرة.

المناقشة

المبين هنا هو نهج لتوليد ملامح التفاعل الكيميائي الوراثية. وطريقة بسيطة: من خلال مقارنة أحجام مستعمرة من كل سلالة في مجموعات الحذف الجين شاملة في وجود وعدم وجود مادة كيميائية، ويتم تحديد جميع الجينات اللازمة لتحمل إهانة الكيميائية. ويمكن بعد ذلك استخدام تحليل تخصيب الشرح من القائمة الناتجة من سلالات حساسة لتوفير نظرة ثاقبة وضع المواد الكيميائية للعمل. في حين تم تحسين هذا البروتوكول لفي مهدها الخميرة، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف للاستخدام مع غيرها من المجموعات المحتشدة حذف الميكروبية، .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مستخلص الخميرة	BioBasic	G0961	بالنسبة للوسائط السائلة / الصلبة YEPD تضاف إلى التركيز النهائي بنسبة 1٪ (وزن / حجم)
مسحوق Tyrptone	BD Biosciences	211820	بالنسبة للوسائط السائلة / الصلبة YEPD تضاف إلى 2٪ تركيز نهائي (وزن / حجم)
سكر العنب	Anachemia	31096-380	بالنسبة للوسائط السائلة / الصلبة YEPD ، أضف إلى 2٪ تركيز نهائي (وزن / حجم) &# 8212 ؛ لا تعتيم. قم بإعداد محلول مخزون بنسبة 20٪ ، وتعقيم المرشح ، وإضافته إلى الوسائط بعد التعقيم.
Agar A	Bio Basic	FB0010	بالنسبة للوسائط الصلبة YEPD تضيف إلى 2٪ تركيز نهائي (مع حجم حجمي)
G418	AG Scientific Inc.	G-1033	قم بإعداد مخزون 1,000x عند 200   ؛ ملغ / مل في dH2< / sub>O وتعقيم المرشح.
12 بئر لوحة	Greiner Bio One	655180
5 مل أنابيب الثقافة	Evergreen Scientific	222-2376-080
10 سم Petri Dish	VWR	25384-302
ROTOR HDA	Singer Instruments	ROT-001	تثبيت المصفوفة الميكروبية
عالية الإنتاجية PLUSPLATE & copy ؛ أدوات المغني بتري ديش		PLU-001	صندوق من 200 طبق
384 Short-Pin RePad	Singer Instruments	RP-MP-384	صندوق من 1,000 وسادة
1536 أدوات RePad Singer ذات دبوس قصير		صندوق RP-MP-1536	من 1,000 وسادة
أنظمة Robtic المؤتمتة	بالكامل S & P الروبوتات	http://www.sprobotics.com	العديد من أنظمة المستعمرات الآلية للتعامل مع الروبيتيك والتخيل المتاحة.
أدوات التثبيت اليدوي	V& P Scientific	http://www.vp-scientific.com	أدوات النسخ المتماثل المحمولة وملحقاتها.

روبوت < td colspan = "4" > أدوات التثبيت البديلة: