مقالة منهجية

طرائق لتقييم السمسة والمناعة من احتراق التبغ الاستعدادات المنتج

DOI:

10.3791/52351

⸱

يناير 10, 2015

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest University Health Sciences, 2R&D Department, R.J. Reynolds Tobacco Company

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام فحوصات الخلايا أحادية النواة أحادية النواة للدم المحيطي البشري (PBMC) خارج الجسم الحي ، أظهرنا أن مستحضر منتج التبغ القابل للاحتراق يثبط بشكل ملحوظ السيتوكينات المفرزة داخل الخلايا بوساطة المستقبلات والقدرة المحللة للخلايا ل PBMCs المستجيبة. قد تكون هذه المقايسات السريعة مفيدة في تقييم المنتج وفهم الآثار المحتملة طويلة المدى للتعرض للتبغ.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن بين التغييرات الفيزيولوجية المرضية الأخرى، والتعرض المزمن لدخان السجائر يسبب التهاب وقمع المناعي، والتي تم ربطها إلى زيادة التعرض للمدخنين للعدوى الميكروبية وحدوث الأورام. خارج الحي قمع الردود بوساطة مستقبلات المناعة في خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية البشرية (PBMCs) تعامل مع مكونات الدخان هو نهج جذابة لدراسة آليات وتقييم الآثار المحتملة على المدى الطويل من التعرض لمنتجات التبغ. هنا، نحن الأمثل طرق لأداء خارج الحي المقايسات باستخدام PBMCs تحفزها lipopolysaccharide في البكتيري، وتول مثل مستقبلات 4 يجند. آثار كله المتوسطة مكيفة الدخان (WS-CM)، وقد تم التحقيق لإعداد منتجات التبغ قابل للاحتراق (TPP)، والنيكوتين على إفراز خلوى وقتل الخلية المستهدفة من قبل PBMCs في المقايسات فيفو السابقين. وتبين لنا أن السيتوكينات يفرز IFN-γ، TNF، IL-10، IL-6، وIL-8 والسيتوكينات داخل الخلايا IFN-قمعت 47 ؛، TNF-α، وMIP-1α في PBMCs WS-CM يتعرض. تم تخفيض وظيفة لحل الخلايا من PBMCs المستجيب، على النحو الذي يحدده مقايسة قتل الخلية المستهدفة K562 أيضا عن التعرض لWS-CM. كان النيكوتين الحد الأدنى من الفعالية في هذه المقايسات. وباختصار، فإننا نقدم مجموعة من تحسين فحوصات لتقييم آثار TPPs في المقايسات فيفو السابقين، وهذه الطرق يمكن تكييفه بسهولة لاختبار المنتجات الأخرى ذات الاهتمام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجموعة كبيرة من نقاط المعرفة إلى الآثار الصحية السلبية للتدخين السجائر المزمنة، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية، ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) وسرطان 1،2. وقد عرفت تدخين السجائر المزمنة أن تسبب الالتهاب وقمع المناعي، ويتم الإبلاغ عن هذه التعديلات للمساهمة في زيادة خطر العدوى الميكروبية والسرطان لدى المدخنين 3. في المختبر وتقنيات فيفو السابقين مفيدة في توضيح الأساس الجزيئي للآثار المرضية في جسم المريض ل يتم الاعتراف دخان السجائر 4-9 (الجدول 1)، وكأدوات هامة لتوجيه التنظيم الناشئة من منتجات التبغ المختلفة 10،11.

على سبيل المثال، لقد أثبتنا أن الاستعدادات القابلة للاحتراق منتجات التبغ (TPPs) مثل كله المتوسطة مكيفة الدخان (WS-CM) ومجموع الجسيمات (TPM) هي أكثر بكثير السامة للخلايا والضارة لDNA من TPPs غير قابلة للاحتراق أو النيكوتين 12،13. وتمشيا مع الأعمال المنشورة، أفيد مؤخرا أن TPPs قابل للاحتراق أو النيكوتين 12،13. وتمشيا مع الأعمال المنشورة، ونحن ذكرت مؤخرا ان TPPs احتراق تسبب المناعة ملحوظ. ومما يدل على ذلك عن طريق قمع النابعة مثل مستقبلات (TLR) -ligands، حفز إفراز السيتوكينات، واستهدفت خلية (K562) قتل من قبل PBMCs في نموذج خارج الحي 14. ونظرا لأهمية التهاب في السجائر عمليات المرض التي يسببها الدخان، ويرد مزيد من التحسين من الظروف فحص لتقييم الآثار تغييري المناعية للدخان السجائر في هذا التقرير.

وخارج الحي فحوصات قياس عادة داخل الخلايا ويفرز السيتوكينات فضلا عن وظيفة لحل الخلايا السامة للخلايا T والخلايا القاتلة الطبيعية في الخلية K562 مما أسفر عن مقتل 14 المقايسات. المقايسات تضمنت ما قبل الحضانة مع WS-CM والنيكوتين والتحفيز لاحق من PBMCالصورة مع TLR منبهات على مدى 3 أيام؛ يتم تنفيذ قراءات النهائية باستخدام فحوصات انزيم مرتبط المناعي (ELISAs) و / أو التدفق الخلوي. نحن تستخدم lipopolysaccharide في البكتيري (LPS)، والتي تربط لمستقبلات TLR-4 ويحفز PBMCs مما أدى إلى إنتاج السيتوكينات داخل الخلايا وإفراز السيتوكينات. بالإضافة إلى تعظيم الاستفادة من مختلف خطوات الفحص لتقييم الآثار المناعية للTPPs، ونحن أيضا الأساليب الحالية لعزل PBMCs، المقايسات موت الخلايا، وIL-8 الكمي. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لمعالجة المسائل البحثية الأخرى ومزيد من الصقل لتقييم منتجات التبغ في سياق تنظيمي.

الجدول 1. نشرت تقارير في المختبر، وبحكم فيفو طرق تستخدم لدراسة varilus الآثار المرضية في جسم المريض من الاستعدادات منتجات التبغ CS، ودخان السجائر المتوسطة؛ CSC، دخان السجائر المكثفات. CSE، والسجائر استخراج الدخان. ELISA، انزيم مرتبط المناعي فحص. GADPH، غليسيرألدهيد نازعة 3-الفوسفات. QPCR، الكمي تفاعل البلمرة المتسلسل. RT، في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل الكمي التفاعل؛ TS، دخان التبغ.

المؤلف (سنة الدراسة) LAAN وآخرون (2004) مودي وآخرون (2004) أولتمان وآخرون (2005) Vayssier (1998) Witherden وآخرون (2004) Birrell وآخرون (2008)
الخلايا المستخدمة خلايا البطانة الشعب الهوائية الإنسان (BEAS-2B)، العدلات الإنسان الخلايا الظهارية السنخية الإنسان (A549) الهوائية السلس خلايا العضلات الإنسان (HASMC) خلايا U937 premonocytic الإنسان، وحيدات الإنسان نوع السنخية II الخلايا الظهارية (ATII) وحيدي البشريخط الخلية (THP-1)، الضامة رئة الإنسان
TPP المستخدمة CSE CSC CSE TS CSE CS
الطريقة المستخدمة ELISA، QPCR، والهجرة، والتحول electromobility Immunohisto الكيمياء، الكهربي، مجموعة Arrayscan، RT-PCR، ELISA ELISA، RT-PCR، QPCR، الكهربي تحول جل التنقل المجهر الضوئي، المجهر الإلكتروني، الكهربي، ELISA QPCR، ELISA، طقم-toxate E (سيغما)، لوحة P65 فحص (TransAM)، الكهربي، ومختلف مجموعات المناعية
قياس IL-8، GM-CF، AP-1، NF كيلوبايت، والهجرة acetyltransferases هيستون، deacetylases هيستون، NF كيلوبايت، IL-8، بي كيلوبايت-α، GADPH HO-1، GADPH، RANTES، IL-8، eotaxin حرارة بروتينات الصدمة / الإجهاد (HSP / HSP70)، HF عامل النسخ، NF كيلوبايت،TNF-α بروتين بالسطح (SP-A، SP-C)، IL-8، MCP-1، GRO-α، TNF-α، IL-1β، IFN-γ IL-8، IL-1β، IL-6، TNF-α، MIP1-α، GRO-α، MAPK / JNK / ERK الفسفرة، cJUN: الحمض النووي ملزمة، الجلوتاثيون، P65: الحمض النووي ملزمة
النتيجة النهائية CSE أسفل ينظم إنتاج السيتوكينات عبر قمع AP-1 التنشيط. H 2 O 2 و CSC تعزيز أستلة من البروتينات هيستون، وانخفاض النشاط deacetylase هيستون، تفاضلي تنظيم الإفراج proinflammatory سايتوكاين. قد يسبب دخان السجائر إطلاق سراح IL-8 من HASMC، تتعزز TNF-α، و 20٪ CSE أقل IL-8 الإفراج عنهم، تثبيط eotaxin وRANTES بدخان السجائر. TS تنشيط عامل HF النسخ، والذي كان مرتبطا مع HSP70 overexpression وتثبيط NFkB النشاط وإطلاق TNF-α ملزمة. انخفاض ATII مستويات chemokine المستمدة من خلية وسطا alveoإصلاح لار، والمساهمة في السجائر التي يسببها الدخان ضرر السنخية وانتفاخ الرئة. توفر البيانات تفسير الآلية لماذا زادت المدخنين التهابات الجهاز التنفسي. ويرافق قمع الاستجابة الفطرية زيادة في IL-8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على موافقة خطية مطلعة أن تفعل هذه الدراسة في وحدة الأبحاث السريرية المحلية في ظل موافقة IRB، في الممارسات السريرية الجيدة: ملاحظة. تجهيز الدم، يتم تنفيذ عزل PBMCs وغيرها من تجارب زراعة الخلايا تحت ظروف معقمة، وذلك باستخدام إمدادات معقمة الميكروبيولوجية والكواشف.

1. WS-CM إعداد

  1. توليد WS-CM كما هو موضح سابقا (12).
    1. إعداد WS-CM عن طريق تمرير الدخان من أربعة 3R4F السجائر المرجعية من خلال معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسيط وبدون الفينول الأحمر باستخدام نظام التدخين التالية: 35-60-2، وحجم نفخة في مل، فاصل نفخة في ثانية، ومدة نفخة في ثانية، على التوالي. كل إعداد يولد عينة 20 مل.
  2. أنبوب تسمية (s) مع التاريخ والوقت الانتهاء، واسم السجائر والعدد. تخزين 500 مكل في -80 درجة مئوية فورا بعد اكتمال التدخين.
  3. تحليل aliquots من WS المجمدة-CM لتحديد مستويات النيكوتين، النتروزامين الخاصة بالتبغ، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات كما هو موضح سابقا (12).

2. عزل PBMCs

  1. جمع دماء جديدة من المتبرعين الأصحاء (الذين هم غير المستهلكين لمنتجات التبغ) عزل PBMCs من الدم الطازج كما هو موضح أدناه بموجب موافقة منفصلة عن ويك فورست المعمدانية الصحة IRB 15.
    1. وقبل وصول كيس الدم، ولها زجاجة 500 مل، مقص، وعازلة العزلة، والفوسفات المالحة Dulbecco ومخزنة (DPBS) (RT) جاهزا في مستوى السلامة الحيوية 2 (BSL-2) ثقافة الخلية غطاء محرك السيارة. يجب حماية عازلة بمعزل عن الضوء.
    2. عقد كيس الدم رأسا على عقب وقطع أنبوب أسفل حيث تم فرضت عليه ترك 3 سم على الأقل من الأنابيب.
    3. إزالة الغطاء من زجاجة مل 500 و عقد الأنبوب فوق فتح زجاجة. التقاط كيس الدم وعكس ذلك للسماح بتدفق الدم بحرية من الكيس إلى روقال انه حتى زجاجة حقيبة فارغة. السماح بتدفق الدم على الجدار الداخلي للزجاجة مقابل رأسا إلى أسفل لتجنب خلق فقاعات.
    4. صب عازلة العزلة في زجاجة في نسبة 1: 5 من العازلة العزلة إلى الدم. سقف الزجاجة بإحكام وعكس ذلك بلطف، نهاية الإفراط في نهاية المطاف، 10 مرات. ترك الزجاجة في الخلية هود الثقافة لاحتضان مع الأنوار، لمدة 1 ساعة على RT.
    5. سوف A، طبقة بلون القش الخفيفة تتراكم فوق الدم. إزالة هذه الطبقة باستخدام 25 مل ماصة المصلية إلى 50 مل أنابيب مخروطية. قد تختلف كمية جمعت 50-300 مل، اعتمادا على هذا الموضوع الذي تبرع الدم.
    6. أنابيب الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    7. نضح طاف شفافة، وترك بيليه الدم داكن اللون. سوف بيليه تكون فضفاضة ولكن لزج.
    8. ماصة 3 مل من العازلة العزلة إلى 15 مل أنابيب مخروطية.
    9. إلى Resuspend بيليه، إضافة 20 مل من DPBS لكل 50 مل من القش الملون السائل التي تم جمعها في الصورةتيب 2.1.5. دوامة لمزيج دقيق، وتوطيد السائل معلق من أنابيب متعددة. هذا السائل يحتوي على تعليق خلايا الدم.
    10. مع الماصة نقل، ونقل 5 مل من خلايا الدم مع وقف التنفيذ على 3 مل من العازلة العزلة في الخطوة 2.1.8. إمالة 15 مل المخروطية الأنبوب الذي يحتوي على تعليق خلية ببطء وبرفق لخلق طبقتين منفصلتين. أنابيب الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 40 دقيقة في RT مع الحد الأدنى من تسارع وبدون الفرامل.
    11. استخدام الماصة نقل لإزالة الناتجة الطبقة الوسطى غائم جزئيا (معطف الشهباء) التي تحتوي على PBMCs إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تجنب وضع طبقات أخرى واضحة تحتها. نقل ما لا يزيد عن 25 مل إلى 50 مل كل أنبوب مخروطي الشكل.
    12. إضافة 25 مل من العازلة جارية باردة (أو أكثر لملء وحدة التخزين بالكامل المتبقية من 50 مل أنبوب مخروطي) لغسل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    13. resuspend الكرية مع 10 مل تشغيل العازلة. هذا يحتوي على PBMCs. عدد الخلايا واستخدام الدردشةبتوسط أو مكان على الجليد لتجميد.

3. تجميد والذوبان في PBMCs

  1. أجهزة الطرد المركزي في PBMCs التي تم جمعها في الخطوة 2.1.13 لمدة 10 دقيقة في 400 ز س.
  2. ملء حاوية تجميد مع ايزوبروبيل فقا لتعليمات الشركة الصانعة. تنبيه: الإيزوبروبيل غير قابلة للاشتعال وذات سمية حادة.
  3. resuspend الكرية مع المتوسط ​​1640 RPMI (4 ° C) تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). هذا هو RPMI 1640 تجميد المتوسطة. resuspend الكرية مع مبلغ تجميد المتوسطة التي من شأنها أن تؤدي إلى تعليق جود حوالي 5 × 10 7 خلية / مل. فإن عدد الخلايا المتاحة لتجميد تختلف.
  4. الاستغناء 1 مل aliquots من تعليق خلية في 2 مل cryotubes ووضع cryotubes في حاوية التجمد. وضع الحاوية تجميد مع cryotubes في الثلاجة عند -80 درجة مئوية لتخزين O / N ثم قم بإزالة cryotubes ونقل لتخزين فيالفريزر المبردة بين -150 درجة مئوية إلى -190 درجة مئوية.
  5. إزالة cryotube من التخزين المبردة وذوبان الجليد بشكل سريع مع الإثارة لطيف في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  6. نقل على الفور PBMCs إذابة في cryotube إلى 15 مل أنبوب مخروطي مع 10 مل المتوسط ​​1640 RPMI الكامل (4 ° C) تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ القلم / بكتيريا و 1٪ L-الجلوتامين. يجب نقل محتويات cryotube إذابة في أقرب وقت ممكن للحصول على خلية القصوى الجدوى 15.
  7. الطرد المركزي PBMCs في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  8. resuspend الكرية مع 5 مل المتوسط ​​1640 RPMI كاملة وعدد الخلايا.
  9. قياس بقاء الخلية التي أنشئت طرق مثل طريقة التريبان الأزرق الاستبعاد. عموما بقاء الخلية مع هذا الأسلوب هو حوالي 90 - 95٪. وPBMCs هي الآن جاهزة للاستخدام في التجارب.

4. خلية تحديد الموت

ملاحظة: التخفيفات المذكورة هنا هي لأغراض هذه ستودى. التخفيفات يمكن تغيير وفقا لذلك.

  1. تمييع WS-CM أو النيكوتين في لوحة 96-جيدا باستخدام RPMI المتوسطة كاملة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد، كما هو مبين أدناه.
  2. تمييع WS-CM إلى التركيزات التالية: 0.1، 0.5، 1، 1.5، 2، 2.5، 3، 4، و 5 ميكروغرام / مل من وحدات متساوية النيكوتين (على أساس محتوى النيكوتين في WS-CM) 12.
  3. تمييع النيكوتين في RPMI متوسطة إلى التركيزات التالية: 100، 200، 500، 750، 1000، 2000 و 3000 ميكروغرام / مل. تنبيه: النيكوتين هو ذات سمية حادة وخطرة على البيئة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من PBMCs معلقة في RPMI المتوسطة كاملة إلى كل بئر بتركيز 1 × 10 6 خلايا / جيد. فإن الحجم الكلي للخلايا بالإضافة إلى WS-CM أو النيكوتين يكون 200 ميكرولتر / جيد.
  5. لغرض هذه الدراسة، وإعداد مجموعتين من لوحات على النحو الوارد أعلاه. تغطية لوحات واحتضان لوحة واحدة لمدة 24 ساعة وصفيحة واحدة لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. ضبط نقاط زمنية حسب الضرورة.
  6. غسل الخلايا في RT بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق، الشفط طاف، vortexing لأسفل اللوحة مع لوحة مغطاة، وأخيرا إعادة التعليق الخلايا مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة عازلة على التوالي، وكرر الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
  7. إضافة 95 ميكرولتر من تشغيل عازلة تليها 5 ميكرولتر من 7 aminoactinomycin D (7AAD) إلى كل بئر لإجمالي حجم 100 ميكرولتر / جيد. احتضان لوحة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من تشغيل عازلة لأنابيب العنقودية. نقل وحدة التخزين بالكامل من تعليق خلية من كل بئر من لوحة للأنابيب العنقودية والحصول على العينات على تدفق عداد الكريات.
  9. تحديد نسبة الخلايا 7AAD الإيجابي باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل.

5. EC 50 تقرير

  1. يتم تحديد القيم EC 50 من WS-CM والنيكوتين كل 7AAD الإيجابي تلطيخ PBMCs.
  2. يتم تعريف EC 50 القيمة على أنها اضربentration الذي 50٪ من الخلايا لم تعد قابلة للحياة في مقايسة 24 ساعة، ويتم التعبير عن القيم كما ميكروغرام من-متساو النيكوتين وحدة / مل.
  3. لأغراض هذه الدراسة، تم تحديد القيم EC 50 لتكون 1.56 ميكروغرام / مل و 1،650 ميكروغرام / مل لWS-CM والنيكوتين، على التوالي.

6. السيتوكينات يفرز

ملاحظة: التخفيفات المذكورة هنا هي لأغراض هذه الدراسة. التخفيفات يمكن تعديلها وفقا لذلك.

  1. تمييع WS-CM في لوحة 96-جيدا باستخدام RPMI المتوسطة كاملة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد في تركيز 0.3، 1.56، 3، و 5 ميكروغرام / مل من وحدات متساوية النيكوتين.
  2. تمييع النيكوتين إلى التركيزات التالية: 100، 200، 500، 750، 1000، 2000 و 3000 ميكروغرام / مل. تنبيه: النيكوتين هو ذات سمية حادة وخطرة على البيئة.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من PBMCs معلقة في RPMI المتوسطة كاملة إلى كل بئر بتركيز 1 × 10 6 خلايا / جيد.فإن الحجم الكلي للخلايا بالإضافة إلى WS-CM أو النيكوتين يكون 200 ميكرولتر / جيد.
  4. تغطية لوحة واحتضان لمدة 3 ساعات في 37 ° C وCO 2 5٪.
  5. غسل الخلايا في RT بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق، الشفط طاف، vortexing لأسفل اللوحة مع لوحة مغطاة، وأخيرا وقف الخلايا مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة تشغيل العازلة وتكرار الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من RPMI المتوسطة كاملة، وكرر الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
  7. إضافة 200 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل LPS المتوسطة إلى كل بئر.
  8. تغطية لوحة واحتضان لمدة 4 ساعات، 24 ساعة، 48 ساعة، أو 72 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. ضبط الأوقات الحضانة عند الضرورة.
  9. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 × ز لمدة 3 دقائق.
  10. تأخذ 175 ميكرولتر من طاف من كل بئر وتخزينها في الثلاجة عند -80 درجة مئوية إلى إجراء فحوصات في الخطوات 7 و 8.

7. Cytometric الخرزة صفيف الفحص

<رأ>
  • ذوبان الجليد في supernatants خلية أعدت من الخطوة 6.10 واستخدامها في فحص CBA. أداء مجموعة حبة cytometric (CBA) مقايسة حسب تعليمات الشركة المصنعة.

    • 8. IL-8 ELISA

    1. ذوبان الجليد في supernatants خلية من الخطوة 6.10 واستخدامها في IL-8 ELISA. إجراء فحص ELISA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

    9. بين الخلايا تلطيخ والتدفق الخلوي

    ملاحظة: التخفيفات المذكورة هنا هي لأغراض هذه الدراسة. التخفيفات يمكن تعديلها وفقا لذلك.

    1. تمييع WS-CM في لوحة 96-جيدا باستخدام RPMI المتوسطة كاملة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد في تركيز 0.3، 1.56، 3، و 5 ميكروغرام / مل من وحدات متساوية النيكوتين.
    2. في نفس لوحة، وتمييع النيكوتين إلى التركيزات التالية: 2، 10، 50، 100، 500، 2000، و 4000 ميكروغرام / مل. تنبيه: النيكوتين هو ذات سمية حادة وهزار للبيئةدوس.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من PBMCs معلقة في RPMI المتوسطة كاملة بتركيز 1 × 10 6 خلايا / جيد. فإن الحجم الكلي للخلايا بالإضافة إلى WS-CM أو النيكوتين يكون 200 ميكرولتر / جيد.
    4. تغطية لوحة واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
    5. غسل الخلايا في RT بواسطة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 3 دقائق، الشفط طاف، vortexing لأسفل اللوحة مع لوحة مغطاة، وأخيرا إعادة التعليق الخلايا مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة عازلة على التوالي، وكرر الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
    6. إضافة 200 ميكرولتر من RPMI المتوسطة الكامل إلى لوحة، وكرر الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
    7. إعداد تركيزات العمل من 2 ميكرولتر / مل GolgiPlug و 10 ميكروغرام / مل LPS باستخدام RPMI المتوسطة كاملة وإضافة 200 ميكرولتر إلى كل بئر.
    8. احتضان لوحة لمدة 6 ساعات في 37 ° C وCO 2 5٪.
    9. في نهاية الخطوة 9.8، وغسل الخلايا مع تشغيل عازلة (4 ° C)، والغزل في 300x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
    10. إضافة 100 ميكرولتر من Cytofix إلى كل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    11. غسل الخلايا 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 9.9 مع 1X Permwash (4 ° C) في 300 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
    12. إضافة 45 ميكرولتر من 1X Cytoperm إلى كل تليها جيدا بنسبة 5 ميكرولتر من كل واحد من الأجسام المضادة التالية إلى كل بئر: TNF-α-فلور اليكسا 488، IFN-γ V500، MIP-1α PE. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    13. غسل الخلايا مرتين كما هو موضح في الخطوة 9.9 مع 1X Permwash (4 ° C) ومرة ​​واحدة مع تشغيل عازلة (4 ° C) في 300 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
    14. resuspend الخلايا مع 200 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد (4 ° C). نقل الخلايا إلى 12 × 75 مم أنابيب، وتحليل العينات على تدفق عداد الكريات. تنبيه: لامتصاص العرق غير قابلة للتآكل، شديد السمية ويشكل خطرا على الصحة.

    10. K562 قتل الفحص

    يجب أن نمت الخلايا K562: ملاحظةفي الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 مع RPMI المتوسطة كاملة حتى تصل إلى 80٪ التقاء قبل الفحص.

    1. إعداد 5 ملي carboxyfluorescein حل succinimidyl استر (CFSE) الأسهم من خلال إضافة 18 ميكرولتر من DMSO إلى القارورة.
    2. تمييع WS-CM أو النيكوتين في لوحة 96-جيدا باستخدام RPMI المتوسطة كاملة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد لتحقيق وحدات متساوية النيكوتين المطلوبة أو تركيزات النيكوتين لكل بئر. تنبيه: النيكوتين هو ذات سمية حادة وخطرة على البيئة.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من PBMCs في RPMI المتوسطة كاملة بتركيز 1.5 × 10 6 خلايا / جيد. فإن الحجم الكلي للخلايا مع WS-CM أو النيكوتين يكون 200 ميكرولتر / جيد.
    4. تغطية لوحة واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
    5. غسل الخلايا K562 بإضافة 10 مل من DPBS وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 8 دقائق في RT.
    6. resuspend الخلايا مع 10 مل من DPBS وعدد الخلايا K562.
    7. إعداد CFSE workiحل نانوغرام بإضافة 1 ميكرولتر من CFSE حل الأسهم إلى 1 مل DPBS.
    8. إضافة 1 مل من محلول العمل CFSE إلى 1 مل من تعليق خلية K562 تحتوي على 1 - 2 × 10 7 الخلايا. دوامة واحتضان بالضبط لمدة 2 دقيقة في RT.
    9. إضافة على الفور 200 ميكرولتر من FBS. دوامة واحتضان بالضبط لمدة 2 دقيقة في RT.
    10. إضافة 10 مل من RPMI المتوسطة كاملة وأجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ج لمدة 8 دقائق في RT.
    11. إزالة طاف RPMI وكسر بيليه و resuspend الخلايا مع 10 مل من RPMI المتوسطة كاملة وعدد الخلايا K562 CFSE المسمى.
    12. غسل PBMCs بواسطة الطرد المركزي لوحة في 300 x ج لمدة 3 دقائق في RT. نضح طاف بواسطة الصب السائل. استبدال الغطاء ودوامة الجزء السفلي من لوحة. إضافة 200 ميكرولتر من RPMI المتوسطة كاملة وتكرار غسل خطوة واحدة لمزيد من الوقت.
    13. إضافة خلايا K562 CFSE المسمى بنسبة 1:15 (100،000 K562s: 1.5 × 10 6 PBMCs) لكل عينة بئر من لوحة PBMC ومزيد من طncubate لمدة 5 ساعة عند 37 ° C وCO 2 5٪.
    14. غسل مزيج الخلية عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق في RT. نضح طاف بواسطة التخلص من السائل. ضع الغطاء ودوامة الجزء السفلي من لوحة.
    15. إضافة 200 ميكرولتر من تشغيل العازلة وكرر الخطوة غسل موضح في الخطوة 10.14 مرة أخرى.
    16. إضافة 95 ميكرولتر من تشغيل عازلة تليها 5 ميكرولتر من 7AAD إلى كل بئر لإجمالي حجم 100 ميكرولتر / جيد. احتضان لوحة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
    17. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة على التوالي إلى كل بئر ونقل وحدة التخزين بالكامل من تعليق خلية من كل بئر من لوحة للأنابيب العنقودية والحصول على العينات على تدفق عداد الكريات.
    18. تحديد النسبة المئوية للخلايا 7AAD إيجابية وCFSE إيجابية باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وعرضت النتائج على النحو يعني الخطأ ± المعياري للمتوسط ​​(أربع عينات المانحة). تم إجراء اختبار t الطالب بين عينات مراقبة المعالجة وغير المعالجة باستخدام برنامج إكسل وكذلك مقارنات اختبار t لجميع العلاجات مع الضوابط المقابلة الخاصة بهم. وأشار إلى الأهمية الإحصائية عن طريق: *، P <0.05. **، P <0.005. ***، P <0.0005.

    لقياس تأثير التعرض لWS-CM والنيكوتين، تم علاج PBMCs مع تركيزات مختلفة من WS-CM والنيكوتين لمدة...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    نحن وآخرون قد أظهرت في وقت سابق ان علاج PBMCs مع TPPs يقمع عدة ردود، بما في ذلك التعبير وإفراز السيتوكينات وتدابير وظيفية مثل قتل الخلية المستهدفة 14. الطرق التجريبية وصفها في الأعمال السابقة تتطلب فترات حضانة أطول وكانت متواضعة في حجم 14. وبالنظر إلى التطبيقات المحتملة لهذا النموذج جذابا خارج الحي لالبحوث الأساسية والتطبيقية، ونحن التحقيق ما إذا كان أي من المعلمات مقايسة في هذه المقايسات البيولوجية متعددة الخطوات يمكن أن يكون الأمثل. هنا، نقدم مبسطة...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ويتم تمويل هذا العمل من قبل RJ شركة التبغ رينولدز (RJRT) بموجب اتفاق البحوث التعاونية مع جامعة ويك فوريست مدرسة الطب. GL براساد هو موظف بدوام كامل من RJRT.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    أنابيب 12 × 75 ممBDFalcon 352058
    15 مل أنابيب مخروطية Corning430790
    2 مل أنابيب دقيقةAxygenMCT-150-C-S
    3R4F السجائر المرجعيةجامعة كنتاكي ، كلية الزراعة3R4F
    50 مل أنابيب مخروطيةكورنينج430828
    500 ملكورنينج430282
    7AADBD Pharmingen559925
    لوحة سفلية مسطحة 96 بئرTermo Nunc439454
    ألواح سفلية مستديرة 96 بئر BDFalcon353077
    غطاء ثقافة الخليةThermo Scientific1300 Series A2
    طرد مركزيEppendorf58110R
    CFSEالمجسات الجزيئية تقنيات الحياةC34554
    العنقوديةCorning4401ضارة في حالة الابتلاع ، مادة مسرطنة
    Cytofix / Cytoperm (Permwash)BD Biosciences555028قابل للاشتعال
    (ثنائي ميثيل سلفوكسيد)Sigma-AldrichD8418
    DPBSLonza17-512F
    FBSSigma-Aldrichيحلل برنامج F2442
    FCAP ArrayBD Biosciences652099تصفية بيانات CBA
    Nalgene156-4020
    مقياس التدفق الخلويBD BiosciencesFACS Canto II8 ألوان ، في Ex 405 و Em 785.
    مقياس التدفق الخلويBD BiosciencesFACS Calibur4 ألوان في Ex 495 و Em 785.
    يحتوي برنامج تحليل قياس التدفقTree StarFlowJo
    التجميدNalgene5100-0001على DMSO ، مهيج
    GogliPlugBD Biosciences555029مادة مسرطنة ، مهيجة ، أكالة
    H2< / sub>SO4< / sub>Sigma-Aldrich339741
    مجموعةالسيتوكين الالتهابية البشريةBD Biosciences551811
    IFN-& gamma; V-500 الأجسام المضادةBD Horizon561980محسس الجلد
    IL-8 ELISA KitR and D SystemsDY208
    عازلة العزلIsolymph ، CTL Scientific Corp.1114868سائل قابل للاشتعال ، مهيج
    كحول الأيزوبروبيلسيجما ألدريتشW292907
    L-GlutamineGibco Life Technologies25030-081
    LPSSigma-AldrichL2630
    MIP1- & alpha ؛ PE الأجسام المضادةBD Pharmingen554730السمية الحادة ، عن طريق الفم
    MonensinSigma-AldrichM5273
    NaClSigma-AldrichS7653
    النيكوتينسيجما-ألدريتشN3876السمية الحادة ، المخاطر البيئية
    ParafilmBemis" م"
    ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148قابل للاشتعال ، تهيج الجلد
    قلم / بكتيرياعقدية Gibco Life Technologies15140-122
    RPMI 1640Gibco Life Technologies11875-093
    تشغيل عازلةMACS Running Buffer ، Miltenyi Biotech130-091-221
    Th1 / Th2 CBA KitBD Biosciences551809
    TNF- & ألفا; Alexa Fluor 488 الأجسام المضادةBioLegend502915
    نقل الماصةفيشر Scientific13-711-20
    Tris BaseSigma-AldrichT1503
    زجاجة جهاز أنابيب DMSO وحدة الخلوي حاوية

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
    2. Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
    3. Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
    4. Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
    5. Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
    6. Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
    7. Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74(2005).
    8. Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
    9. Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
    10. Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
    11. Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
    12. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
    13. Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
    14. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
    15. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
    16. Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
    17. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
    18. Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    K562 CFSE LPS

    مقالات ذات صلة